韓穩(wěn)琦，霍建華，李國良，蔣永榮，武金娥，孫超峰

西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科 西安 710061

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先天性長QT綜合征2型hERG基因G604S突變真核表達(dá)載體的構(gòu)建和表達(dá)*

韓穩(wěn)琦，霍建華，李國良，蔣永榮，武金娥，孫超峰#

西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科 西安 710061

關(guān)鍵詞先天性長QT綜合征;hERG基因;突變;真核表達(dá)載體

摘要目的：構(gòu)建長QT綜合征(LQTS)2型hERG 基因G604S突變的真核表達(dá)載體G604S-hERG-pcDNA3、G604S-hERG-pEGFP。方法：采用重疊延伸PCR法在pEGM-hERG基礎(chǔ)上構(gòu)建G604S突變體PGEM-hERG-G604S，通過限制性內(nèi)切酶法和基因重組技術(shù)將突變體插入到真核表達(dá)載體pcDNA3和pEGFP-C2中并測序驗(yàn)證，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將G604S-hERG-pEGFP轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞并觀察其熒光表達(dá)。結(jié)果：構(gòu)建的含有突變位點(diǎn)的真核表達(dá)載體經(jīng)DNA測序均成功驗(yàn)證hERG基因1 810位點(diǎn)堿基G突變?yōu)锳，構(gòu)建的G604S-hERG-pEGFP在HEK293細(xì)胞中成功表達(dá)綠色熒光。結(jié)論：成功構(gòu)建hERG基因G604S-hERG-pcDNA3和G604S-hERG-pEGFP表達(dá)載體。

AbstractAim: To construct eukaryotic expression vectors G604S-hERG-pcDNA3 and G604S-hERG-pEGFP linked to LQT2.Methods: PGEM-hERG-G604S containing G604S fragment was constructed using pEGM-hERG as a template by overlap extension PCR and then validated by DNA sequencing, then hERG-G604S sequence was subcloned into pcDNA3 and pEGFP-C2 vectors using restriction enzymes and gene recombination technology, respectively. After sequencing, G604S-hERG-pcDNA3 and G604S-hERG-pEGFP expression vectors were transfected into HEK293 cells to obtain heterologous expression system.Results: G604S-hERG-pcDNA3 and G604S-hERG-pEGFP eukaryotic expression vectors were constructed successfully， a missense mutation in hERG 1 810 site nucleotide G mutant to A was identified using DNA sequencing，hERG mutant was correctly combined to eukaryotic expression vector pEGFP-C2 and expressing green fluorescent protein confusion mutant G604S in HEK293 cells.Conclusion: The protocol can be used to construct the eukaryotic expression vector G604S-hERG-pcDNA3 and green fluorescent protein expression vector G604S-hERG-pEGFP.

先天性長QT綜合征(congenital long QT syndromes,cLQTS)為一種心肌離子通道病，是由于編碼心肌離子通道蛋白的基因突變導(dǎo)致心肌細(xì)胞復(fù)極時(shí)間延長而觸發(fā)的一組臨床綜合征。LQTS表現(xiàn)為心電圖上T波異常，易發(fā)生尖端扭轉(zhuǎn)型室性心動過速(torsades de pointes,TdP)，從而導(dǎo)致暈厥和猝死等心血管惡性事件[1-2]。目前已證實(shí)12種基因與LQTS相關(guān)，hERG基因突變是引起中國人LQTS的最主要原因[1]。hERG基因定位于人類染色體7q35~36，編碼1 159個(gè)氨基酸殘基[3]，參與形成完整的緩慢激活延遲整流鉀電流快成分(Ikr)通道[4]。Ikr通道在心室肌細(xì)胞復(fù)極、維持心臟動作電位時(shí)程(APD)和調(diào)節(jié)心臟正常節(jié)律過程中發(fā)揮重要作用[5]。hERG突變使蛋白表達(dá)異常，Ikr通道功能降低或喪失，從而使動作電位時(shí)程延長，導(dǎo)致2型LQTS(LQT2)。作者所在的實(shí)驗(yàn)室在LQTS一家系中發(fā)現(xiàn)hERG基因第七外顯子處1 810G→A突變，導(dǎo)致蛋白604位甘氨酸(G)→絲氨酸(S)的改變，即G604S突變[6]，進(jìn)而導(dǎo)致LQT2表型。該研究通過構(gòu)建G604S-hERG-pcDNA3和G604S-hERG-pEGFP真核表達(dá)載體，以期闡明此突變的分子生物學(xué)特征及為該病的個(gè)體化治療研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1主要試劑與儀器質(zhì)粒pEGM-hERG由BD Anson 博士(University of Wisconsin,USA)惠贈，質(zhì)粒pMD19-T、限制性內(nèi)切酶BstE Ⅱ和sdaⅠ、DNA連接酶均購于TaKaRa公司，pEGFP-C2購于Clontech公司，感受態(tài)細(xì)菌TOP10購自Promega公司，HEK293細(xì)胞取自西安交通大學(xué)環(huán)境與疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。DNA片段回收試劑盒購自Qiagen公司，DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司，DNA ladder購自Fermentas公司，X-treme GENE HP DNA轉(zhuǎn)染試劑、質(zhì)粒提取試劑盒、SYBR Green Master(ROX)購自Roche公司。引物合成及測序由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司完成。PTC-200DNA擴(kuò)增儀為美國MJ公司產(chǎn)品，2000型凝膠成像系統(tǒng)為美國Biotech公司產(chǎn)品。

1.2hERG-G604S突變體的構(gòu)建 應(yīng)用重疊延伸PCR法制備hERG-G604S突變體。設(shè)計(jì)G604S突變體引物：①兩條hERG基因外側(cè)端引物，上游序列5’-GCCACGCCAGCACCGGGGCCATGC-3’和下游序列5’-GTGTGGTCTTGAACTTCATGGCCAGGGC-3’。②G604S突變的鄰近引物，上游序列5’-CCT GGGCAGCCCCTCCATCAAGGACAAG-3’，下游序列5’-CTTGTCCTTGATGGAGGGGCTGCCCAGG-3’。共進(jìn)行三步PCR反應(yīng)，其中前兩步分別擴(kuò)增彼此重疊的DNA片段，片段大小分別為922 bp和486 bp；PCR 反應(yīng)體系：緩沖液 10 μL，模板 2 μL，正向引物 1 μL，反向引物 1 μL，dNTP Mix 4 μL，STAR DNA 聚合酶 0.5 μL，調(diào)整總體積為50 μL。第三步PCR連接5’端和3’端DNA片段，并擴(kuò)增出突變片段，片段長度為1 408 bp；反應(yīng)條件：98 ℃ 2 min，98 ℃ 10 s，66 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s；5個(gè)循環(huán)后在反應(yīng)體系中分別加入1 μL的引物再進(jìn)行25個(gè)循環(huán)，反應(yīng)條件：98 ℃，2 min，98 ℃，10 s，66 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，72 ℃ 10 min，4 ℃ 30 min。將突變片段3’末端加A尾后連接到pMD19-T上，反應(yīng)條件：PCR產(chǎn)物15 μL，加 A 反應(yīng)液4 μL，Taq 酶1 μL，72 ℃保溫30 min。產(chǎn)物經(jīng)轉(zhuǎn)化擴(kuò)增后提質(zhì)粒(pMD19-hERG-G604S)并行DNA測序。

1.3真核表達(dá)載體G604S-hERG-pcDNA3的構(gòu)建

利用雙酶切法將hERG-G604S突變體經(jīng)基因重組技術(shù)插入具有氨芐青霉素抗性的表達(dá)載體pcDNA3-hERG中，利用氨芐青霉素抗性對重組子進(jìn)行篩選，挑取單克隆菌種擴(kuò)增后提取質(zhì)粒并測序。使用DNAMAN軟件，選用突變兩端單一的BstE Ⅱ和sdaⅠ限制性內(nèi)切酶對pMD19-hERG-G604S及pcDNA3-hERG同時(shí)進(jìn)行酶切，產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測，于紫外線下切取前者的小片段(約1 056 bp)和后者的大片段部分(約8 244 bp)，依回收試劑盒步驟回收產(chǎn)物后，利用T4 DNA聚合酶將兩者進(jìn)行連接，構(gòu)建G604S-hERG-pcDNA3。經(jīng)轉(zhuǎn)化擴(kuò)增后提取質(zhì)粒并測序。

1.4綠色熒光表達(dá)載體G604S-hERG-pEGFP的構(gòu)建利用雙酶切法(EcoRⅠ和HindⅢ)切取G604S-hERG-pcDNA3中突變?nèi)康膆ERG片段并插入具有Kana抗性的表達(dá)載體pEGFP-C2中，利用Kana抗性對重組子進(jìn)行篩選，挑取單克隆菌種擴(kuò)增后提取質(zhì)粒并測序。選用EcoRⅠ和HindⅢ限制性內(nèi)切酶對pMD19-hERG-G604S及pEGFP-C2同時(shí)進(jìn)行酶切,紫外線下切取G604S-hERG-pcDNA3的小片段(約3 480 bp)，pEGFP-C2在4 000 bp和5 000 bp之間顯示一條帶，依回收試劑盒步驟回收產(chǎn)物后利用T4 DNA聚合酶將兩者進(jìn)行連接，構(gòu)建成G604S-hERG-pEGFP。經(jīng)轉(zhuǎn)化擴(kuò)增后提取質(zhì)粒并測序。

1.5HEK293細(xì)胞的培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基于6孔培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，12 h后當(dāng)細(xì)胞貼壁生長至70%~85%時(shí)，進(jìn)行脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染混合物配比:G604S-hERG-pEGFP 4 μg，X-tremeGENE HP轉(zhuǎn)染劑8 μL，轉(zhuǎn)染24 h后活體細(xì)胞熒光顯微鏡下進(jìn)行檢測。

2結(jié)果

2.1G604S突變體的構(gòu)建 第一步PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖1上，可以觀察到900 bp附近有一條很亮的條帶，與所擴(kuò)增的片段大小相符；第二步PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖1中，可以觀察到500 bp附近有一條很亮的條帶，與所擴(kuò)增的片段大小相符；第三步PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖1下，可見1 200 bp和2 000 bp之間有一條很亮的條帶，與連接的上下游片段全長大小相符，表明是第三步重疊PCR的產(chǎn)物。DNA測序(圖2)顯示hERG基因1 810處的堿基G變?yōu)锳，而其他序列均無改變，表明突變成功。

圖1　hERG-G604S PCR產(chǎn)物電泳圖

M:Marker;1:目的基因;上、中、下：分別為第一、二、三步PCR產(chǎn)物。

圖2　PCR產(chǎn)物測序圖

2.2G604S-hERG-pcDNA3的構(gòu)建pMD19-hERG-G604S的限制性內(nèi)切酶電泳結(jié)果見圖3上，為含突變點(diǎn)的DNA片段(大小為1 056 bp)。pcDNA3-hERG的酶切電泳結(jié)果見圖3下，為大小8 244 bp的目的片段。DNA連結(jié)后的測序結(jié)果(圖4)表明G604S-hERG-pcDNA3的hERG基因1 810處的堿基G突變?yōu)锳，而無其他序列的改變，表明G604S-hERG-pcDNA3構(gòu)建成功。

圖3　雙酶切電泳圖

1：目的基因；M：Marker；上：pMD19-hERG-G604S；下：pcDNA3-hERG。

圖4　真核表達(dá)載體測序圖

2.3G604S-hERG-pEGFP的構(gòu)建pEGFP-C2和G604S-hERG-pcDNA3的酶切電泳結(jié)果見圖5。pEGFP-C2產(chǎn)物大小在4 000 bp和5 000 bp之間；pcDNA3-hERG被切成兩條帶，表明酶切成功。連結(jié)后的DNA測序結(jié)果表明在G604S-hERG-pEGFP上存在突變(圖6)，轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞可見明顯綠色熒光(圖7)，表明綠色熒光表達(dá)載體G604S-hERG-pEGFP構(gòu)建成功。

圖5　pEGFP-C2和G604S-hERG-pcDNA3的雙酶切電泳圖

M:Marker;1:pEGFP-C2雙酶切；2：G604S-hERG-pEGFP雙酶切。

圖6　G604S-hERG-pEGFP測序圖

圖7　G604S-hERG-pEGFP轉(zhuǎn)染HEK293(×10)

3討論

cLQTS發(fā)病突然，猝死率高。我國以LQT2型為主，占到總LQTS的近1/2，為編碼心臟離子通道的hERG基因發(fā)生突變，導(dǎo)致膜蛋白功能異常從而致動作電位復(fù)極時(shí)程延長而表現(xiàn)為暈厥或猝死的一種臨床綜合征[7]。近年來對該疾病基因型和表現(xiàn)型關(guān)系研究的突破性進(jìn)展及分子細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，使LQTS成為心臟離子通道研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。構(gòu)建突變基因表達(dá)載體是研究突變后離子通道功能及個(gè)體化治療研究的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

體外定點(diǎn)誘變技術(shù)是研究基因突變和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及功能之間復(fù)雜關(guān)系的重要方法，已廣泛應(yīng)用于基因的表達(dá)修飾和調(diào)控、結(jié)構(gòu)與功能及蛋白表達(dá)等諸多研究領(lǐng)域。重疊延伸PCR法構(gòu)建突變體目前應(yīng)用最為廣泛，因其不受突變位置及突變類型的限制，不僅能實(shí)現(xiàn)基因點(diǎn)突變，而且能實(shí)現(xiàn)大片段的插入及缺失突變。此方法最大優(yōu)點(diǎn)是構(gòu)建突變簡單易成。作者在該實(shí)驗(yàn)中，首先通過重疊延伸PCR法構(gòu)建了含有G604S突變點(diǎn)的hERG基因片段，然后采用雙酶切法將突變片段和野生型hERG基因切成黏性末端，最后利用基因重組技術(shù)構(gòu)建G604S-hERG-pcDNA3真核表達(dá)載體，通過DNA測序比對證實(shí)真核表達(dá)載體構(gòu)建成功。

近年，基因突變相關(guān)研究中廣泛采用將目的基因插入到pEGFP基因表達(dá)載體中，構(gòu)建成表達(dá)綠色熒光融合蛋白的重組質(zhì)粒，在熒光顯微鏡下直觀目的蛋白的表達(dá)、轉(zhuǎn)運(yùn)和定位的變化。綠色熒光融合蛋白(green fluorescent protein，GFP)是一種新型報(bào)告分子，是目前在細(xì)胞生物學(xué)研究和開發(fā)應(yīng)用中最廣泛的蛋白質(zhì)之一，其敏感性強(qiáng)、性質(zhì)穩(wěn)定，且容易檢測。增強(qiáng)型GFP(EGFP)是一種相對分子質(zhì)量較小并優(yōu)化的GFP，其內(nèi)源熒光基團(tuán)在藍(lán)光激發(fā)時(shí)可高效發(fā)射明亮的綠色熒光，是普通GFP效率的30余倍，EGFP與外源蛋白N端或C端均可融合，且不影響目的蛋白的表達(dá)和轉(zhuǎn)運(yùn)，便于觀察和檢測目的蛋白在活體細(xì)胞或組織中的表達(dá)、定位及細(xì)胞間的轉(zhuǎn)運(yùn)[8]。Huang等[9]在LQT2的研究中也證實(shí)pEGFP對hERG的表達(dá)和定位均無影響。該研究利用雙酶切法和基因重組技術(shù)成功構(gòu)建了綠色熒光真核表達(dá)載體G604S-hERG-pEGFP，為后續(xù)hERG-G604突變基因功能檢測和分析提供了實(shí)驗(yàn)工具。作者采用無內(nèi)源性Ikr通道蛋白表達(dá)的人胚胎腎祖細(xì)胞(HEK293細(xì)胞)[10]，結(jié)果顯示重組的真核表達(dá)載體成功轉(zhuǎn)染入HEK293細(xì)胞中，綠色熒光蛋白表達(dá)豐富，表明突變的目的基因和EGFP形成的融合蛋白在HEK293細(xì)胞中成功表達(dá)。

總之，此突變表達(dá)載體構(gòu)建的成功為進(jìn)一步闡明hERG基因G604S突變導(dǎo)致LQTS發(fā)病機(jī)制及個(gè)體化藥物篩選拯救研究奠定了基礎(chǔ)。

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*國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目31071923

Construction and expression of congenital LQT2 relating hERG gene G604S mutation eukaryotic expression vector

HANWenqi,HUOJianhua,LIGuoliang,JIANGYongrong,WUJin′e,SUNChaofeng

DepartmentofCardiovascularDiseases,theFirstAffiliatedHospital,Xi′anJiaotongUniversity，Xi′an710061

Key wordscongenital long QT syndrome;hERG gene;mutation;eukaryotic expression vector

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2015.06.007

中圖分類號R541

通信作者#，男，1966 年11 月生，博士，教授，研究方向：心臟起搏與電生理，E-mail:csun1@163.com