晁宏圖，李曉鳳，寇馨歆，李　雷，楊曉霞，王莉英，王　莉

河南省腫瘤醫(yī)院(鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院)婦瘤科 鄭州 450003

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LBH589對(duì)OVCAR-3細(xì)胞增殖、侵襲和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響*

晁宏圖，李曉鳳，寇馨歆，李雷，楊曉霞，王莉英，王莉#

河南省腫瘤醫(yī)院(鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院)婦瘤科 鄭州 450003

關(guān)鍵詞組蛋白去乙酰化酶抑制劑；OVCAR-3細(xì)胞；增殖；侵襲；VEGF；PI3K/Akt通路

摘要目的：觀察LBH589對(duì)上皮性卵巢癌OVCAR-3細(xì)胞增殖、侵襲和VEGF表達(dá)的影響。方法：采用MTT法和Transwell實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)1、5、10 μmol/L的LBH589對(duì)OVCAR-3細(xì)胞活性和侵襲細(xì)胞數(shù)的影響，采用Western blot法檢測(cè)Ki67、MMP-2、VEGF、p-PI3K、p-Akt蛋白的表達(dá)水平。采用MTT和Western blot法分別檢測(cè)PI3K抑制劑LY294002對(duì)細(xì)胞活性以及MMP-2、VEGF表達(dá)水平的影響。結(jié)果：LBH589降低OVCAR-3細(xì)胞活性(F=5.324，P<0.001)，減少穿過(guò)Transwell基質(zhì)膜的細(xì)胞數(shù)量(F=84.325，P<0.001)，Ki67、MMP-2、VEGF、p-PI3K、p-Akt蛋白的表達(dá)水平亦降低(F=9.191、7.623、6.340、6.221、4.690，P均<0.001)。與對(duì)照組相比，LY294002抑制MMP-2和VEGF蛋白的表達(dá)，并降低OVCAR-3細(xì)胞活性(P均<0.05)。結(jié)論：LBH589可能通過(guò)調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路下調(diào)MMP-2和VEGF表達(dá)水平，繼而抑制上皮性卵巢癌OVCAR-3細(xì)胞增殖、侵襲和血管生成。

AbstractAim: To observe the effects of LBH589 on the proliferation, invasion and VEGF expression of OVCAR-3 cells.Methods: The effects of 1, 5, and 10 μmol/L LBH589 on the relative viability and invasion of OVCAR-3 cells were determined using MTT and Transwell assay, respectively. The effects of LBH589 on the expression levels of Ki67, MMP-2, VEGF, p-PI3K, and p-Akt were measured using Western blot analysis. Finally, the effects of PI3K inhibitor LY294002 on the relative viability and the expression levels of MMP-2 and VEGF were detected using MTT assay and Western blot analysis, respectively.Results: LBH589 lowered the relative viability of OVCAR-3 cells(F=5.324,P<0.001), reduced the number of transferred cells(F=84.325,P<0.001). Also, the expression levels of Ki67, MMP-2, VEGF, p-PI3K, and p-Akt decreased(F=9.191,7.623,6.340,6.221,4.690,P<0.001). Compared with the control group, LY294002 down-regulated the expressions of MMP-2 and VEGF, and lowered the relative viability of OVCAR-3 cells(P<0.05).Conclusion: LBH589 down-regulates the expressions of MMP-2 and VEGF by mediating the PI3K/Akt signaling pathway, resulting in the inhibition of proliferation, invasion and angiogenesis of OVCAR-3 cells.

LBH589屬新型異羥肟酸類組蛋白去乙?；敢种苿軌蚣せ钐囟ɑ蜣D(zhuǎn)錄，對(duì)多種腫瘤細(xì)胞有明顯的抑制作用[1]。上皮性卵巢癌是婦科惡性程度最高的腫瘤，被發(fā)現(xiàn)時(shí)大多數(shù)患者已處于晚期[2-3]。多烯紫杉醇聯(lián)合鉑類藥物是治療卵巢癌的有效方法，但容易出現(xiàn)耐藥性。前期研究[4]發(fā)現(xiàn)LBH589對(duì)卵巢癌OVCAR-3細(xì)胞有抑制作用，但相關(guān)機(jī)制尚未完全清楚。該實(shí)驗(yàn)觀察了不同劑量LBH589對(duì)上皮性卵巢癌OVCAR-3細(xì)胞增殖、侵襲和VEGF表達(dá)的影響，報(bào)道如下。

1材料與方法

1.1主要材料上皮性卵巢癌OVCAR-3細(xì)胞購(gòu)于美國(guó)菌種保藏中心；LBH589購(gòu)于美國(guó)Selleck Chemicals公司；基質(zhì)膠購(gòu)于美國(guó)BD公司；Transwell侵襲小室購(gòu)于美國(guó)Corning公司；RPMI 1640、胰蛋白酶和胎牛血清購(gòu)于美國(guó)Gibco公司，MTT、SDS和LY294002購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；p-Akt、p-PI3K、VEGF單克隆抗體購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司；兔抗人Ki67單克隆抗體和鼠抗人MMP-2單克隆抗體購(gòu)于英國(guó)Abcam公司；鼠抗人β-actin單克隆抗體購(gòu)于美國(guó)Ambion公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)OVCAR-3細(xì)胞于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2及飽和濕度條件下，培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中，每2~3 d傳代一次。

1.3相對(duì)細(xì)胞活性的檢測(cè)采用MTT法。胰蛋白酶消化對(duì)數(shù)期OVCAR-3細(xì)胞成單細(xì)胞懸液，接種于96 孔培養(yǎng)板(每孔2×103個(gè)細(xì)胞)，孵育24 h后加入1、5、10 μmol/L的LBH589繼續(xù)培養(yǎng)48 h(低、中、高劑量組)。每孔加入5 g/L的MTT 20 μL，37 ℃繼續(xù)孵育4 h后終止實(shí)驗(yàn)。棄上清液，每孔加150 μL DMSO，結(jié)晶紫混勻后用酶標(biāo)儀于560 nm波長(zhǎng)處測(cè)各組OD值。另外，驗(yàn)證PI3K/Akt通路對(duì)細(xì)胞增殖影響時(shí)，加入5 μmol/L的LY294002處理8 h，同樣方法測(cè)定細(xì)胞OD值。相對(duì)細(xì)胞活性=實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4細(xì)胞侵襲能力的檢測(cè)采用Transwell實(shí)驗(yàn)。將OVCAR-3細(xì)胞分為4組，消化成單細(xì)胞懸液并接種于培養(yǎng)板，每組10個(gè)復(fù)孔，加入1、5、10 μmol/L的LBH589，體積分?jǐn)?shù)5% CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)24 h(低、中、高劑量組)。將各組細(xì)胞置于無(wú)血清培養(yǎng)基中重懸，細(xì)胞密度調(diào)整為2.0×105mL-1。取200 μL細(xì)胞懸液接種于Transwell小室的上室，小室中置8 μm PET膜，下室加600 μL含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)12 h后用中性甲醇固定30 min，用棉簽擦去未遷移細(xì)胞，結(jié)晶紫染色后于200倍倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞遷移數(shù)目。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5OVCAR-3細(xì)胞中Ki67、MMP-2、VEGF、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白的檢測(cè)收集經(jīng)不同劑量LBH589處理48 h后的各組細(xì)胞(同1.3)，用蛋白裂解液處理后提取細(xì)胞內(nèi)總蛋白。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳完畢后，轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，用脫脂牛奶于37 ℃封閉30 min，加入Ki67、MMP-2、VEGF、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、β-actin(內(nèi)參)一抗4 ℃過(guò)夜。與二抗反應(yīng)1 h后用洗膜緩沖液清洗3次。用WB成像軟件(Image Quant LAS4000)分析各條帶灰度值，用目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。用5 μmol/L的PI3K抑制劑LY294002作用OVCAR-3細(xì)胞24 h后，同樣方法檢測(cè)MMP-2和VEGF蛋白的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。LBH589處理OVCAR-3細(xì)胞后各指標(biāo)的比較采用單因素方差分析及LSD-t檢驗(yàn)；LY294002處理OVCAR-3細(xì)胞后MMP-2和VEGF蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2結(jié)果

2.1LBH589對(duì)OVCAR-3細(xì)胞增殖能力和Ki67蛋白表達(dá)的影響結(jié)果見(jiàn)圖1和表1。

圖1　各組細(xì)胞Ki67蛋白的表達(dá)

組別n相對(duì)細(xì)胞活性Ki67蛋白對(duì)照組31.00±0.032.13±0.19低劑量組30.82±0.09*1.52±0.06*中劑量組30.70±0.08*1.21±0.15*高劑量組30.59±0.12*0.61±0.08*#F5.3249.191P<0.001<0.001

*：與對(duì)照組比較，P<0.05；#：與中劑量組比較，P<0.05。

2.2LBH589對(duì)OVCAR-3細(xì)胞侵襲能力和MMP-2蛋白表達(dá)的影響結(jié)果見(jiàn)圖2、3和表2。

圖2　各組細(xì)胞MMP-2蛋白的表達(dá)

圖3　各組細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)的變化(×200)

組別n侵襲細(xì)胞數(shù)MMP-2蛋白對(duì)照組396.6±6.71.16±0.04低劑量組374.3±7.1*0.66±0.08*中劑量組363.7±8.5*0.59±0.06*高劑量組345.6±5.3*0.31±0.12*#F84.3257.623P<0.001<0.001

*：與對(duì)照組比較，P<0.05；#：與中劑量組比較，P<0.05。

2.3LBH589對(duì)OVCAR-3細(xì)胞VEGF蛋白表達(dá)的影響結(jié)果見(jiàn)圖4和表3。

圖4　各組細(xì)胞VEGF蛋白的表達(dá)

組別nVEGF蛋白對(duì)照組31.26±0.05低劑量組30.67±0.09*中劑量組30.72±0.06*高劑量組30.26±0.07*#

F=6.340，P<0.001；*：與對(duì)照組比較，P<0.05；#：與中劑量組比較，P<0.05。

2.4LBH589對(duì)OVCAR-3細(xì)胞PI3K/Akt信號(hào)通路的影響結(jié)果見(jiàn)圖5和表4。

圖5　LBH589處理后各組細(xì)胞PI3K、p-PI3K、Akt和p-Akt蛋白的表達(dá)

表4　不同劑量LBH589對(duì)

*：與對(duì)照組比較，P<0.05；#：與中劑量組比較，P<0.05。

2.5LY294002對(duì)MMP-2和VEGF蛋白表達(dá)及相對(duì)細(xì)胞活性的影響結(jié)果見(jiàn)圖6和表5。

圖6　LY294002處理后各組細(xì)胞MMP-2和VEGF蛋白的表達(dá)

組別nMMP-2蛋白VEGF蛋白相對(duì)細(xì)胞活性對(duì)照組31.03±0.041.64±0.061.00±0.06LY294002處理組30.52±0.090.21±0.080.49±0.10t8.96924.62413.267P0.006<0.0010.002

3討論

該實(shí)驗(yàn)觀察到LBH589明顯抑制上皮性卵巢癌OVCAR-3細(xì)胞增殖、侵襲，MMP-2蛋白的表達(dá)量亦隨LBH589作用劑量的增加而降低。MMP-2是MMPs家族的重要成員之一，其作用是降解基底膜和基質(zhì)的主要成分、促進(jìn)血管和淋巴管生成以及調(diào)控細(xì)胞間黏附作用，在腫瘤的浸潤(rùn)、侵襲和轉(zhuǎn)移中起重要作用[5]。作為卵巢癌轉(zhuǎn)移的早期調(diào)控因子，MMP-2普遍表達(dá)于卵巢癌中，參與卵巢癌的侵襲轉(zhuǎn)移[6]。MMP-2可降解細(xì)胞外基質(zhì)中的纖連蛋白和玻連蛋白，降解成分可與卵巢癌細(xì)胞結(jié)合并增強(qiáng)與腹膜中有關(guān)受體結(jié)合能力，促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[7]。因此推測(cè)，該實(shí)驗(yàn)中LBH589對(duì)OVCAR-3細(xì)胞增殖和侵襲的影響可能是通過(guò)調(diào)控MMP-2實(shí)現(xiàn)的。

VEGF是目前所發(fā)現(xiàn)的各種促血管形成因子中作用最強(qiáng)的一種，其通過(guò)旁分泌及自分泌的方式與血管內(nèi)皮細(xì)胞上的酪氨酸受體特異性結(jié)合，使內(nèi)皮細(xì)胞快速分裂、增殖，最終形成新血管，腫瘤獲得血液灌注而加快生長(zhǎng)速度[8]。該實(shí)驗(yàn)中，LBH589作用于OVCAR-3細(xì)胞48 h后，VEGF蛋白表達(dá)降低，表明LBH589有抑制OVCAR-3細(xì)胞血管生成的作用。OVCAR-3細(xì)胞受到VEGF刺激后，增加OVCAR-3細(xì)胞以及周圍纖維細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞MMP-2等的表達(dá)，消除基質(zhì)膜和細(xì)胞間基質(zhì)的屏障，使OVCAR-3細(xì)胞更易移出和轉(zhuǎn)移[9]。另一方面，VEGF與MMP-2協(xié)同參與腫瘤細(xì)胞血管形成、侵襲和轉(zhuǎn)移[10-11]。因此，LBH589通過(guò)降低MMP-2和VEGF表達(dá)水平共同抑制OVCAR-3細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移和腫瘤血管形成，對(duì)卵巢癌起治療作用。

該實(shí)驗(yàn)觀察到，LBH589顯著降低上皮性卵巢癌OVCAR-3細(xì)胞中p-PI3K和p-Akt的表達(dá)，說(shuō)明LBH589抑制PI3K/Akt信號(hào)通路。PI3K下游的靶蛋白Akt是信號(hào)通路中重要的一種蛋白激酶，其活化強(qiáng)度與腫瘤的發(fā)生發(fā)展緊密關(guān)聯(lián)，持續(xù)激活A(yù)kt可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的凋亡耐受性，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖、代謝的異?；钴S[12]。研究[13]表明，PI3K/Akt通路還可上調(diào)MMP-2 mRNA和蛋白表達(dá)水平，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。此外，PI3K/Akt信號(hào)的激活可通過(guò)其他途徑增加低氧誘導(dǎo)因子的表達(dá)水平，從而啟動(dòng)VEGF轉(zhuǎn)錄，增加VEGF表達(dá)水平，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞新生血管形成，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、運(yùn)動(dòng)、侵襲和轉(zhuǎn)移[14-18]。該研究采用LY294002抑制PI3K/Akt通路后，OVCAR-3細(xì)胞的活性受到顯著抑制。基于以上實(shí)驗(yàn)，推斷LBH589通過(guò)抑制PI3K/Akt信號(hào)通路降低MMP-2和VEGF的表達(dá)，繼而調(diào)控OVCAR-3細(xì)胞增殖、侵襲和血管生長(zhǎng)。

綜上，LBH589抑制OVCAR-3細(xì)胞增殖、侵襲和VEGF表達(dá)水平。此作用可能是通過(guò)調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路，降低MMP-2和VEGF的表達(dá)水平而實(shí)現(xiàn)。

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*河南省醫(yī)學(xué)科技攻關(guān)基金資助項(xiàng)目200903006；鄭州大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目101045907

Effects of LBH589 on proliferation,invasion,and VEGF expression of OVCAR-3 cells

CHAOHongtu,LIXiaofeng,KOUXinxin,LILei,YANGXiaoxia,WANGLiying,WANGLi

DepartmentofGynecologicOncology,HenanCancerHospital(theAffiliatedCancerHospital，ZhengzhouUniversity),Zhengzhou450003

Key wordshistone deacetylase inhibitor;OVCAR-3 cell;proliferation;invasion;VEGF;PI3K/Akt pathway

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2015.06.011

中圖分類號(hào)R737.31

通信作者#，女，1964年8月生，本科，主任醫(yī)師，研究方向：婦科腫瘤，E-mail：13837196622@163.com