牛朝霞，李寧寧，陳　潔，李宜培，彭蕤蕤，秦紫芳

河南醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校病理生理學(xué)教研室 鄭州 451191

△女，1979年10月生，碩士，講師，研究方向：惡性腫瘤功能基因組學(xué)，E-mail:nzx99@163.com

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RNA干擾沉默survivin基因?qū)ca-109細(xì)胞增殖與凋亡的影響*

牛朝霞△，李寧寧，陳潔，李宜培，彭蕤蕤，秦紫芳

河南醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校病理生理學(xué)教研室 鄭州 451191

△女，1979年10月生，碩士，講師，研究方向：惡性腫瘤功能基因組學(xué)，E-mail:nzx99@163.com

關(guān)鍵詞RNA干擾；survivin；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡；Eca-109細(xì)胞

摘要目的：通過RNA干擾抑制食管癌細(xì)胞Eca-109 survivin基因的表達(dá)，觀察survivin基因沉默對Eca-109細(xì)胞增殖與凋亡的影響。方法：構(gòu)建靶向survivin基因的siRNA表達(dá)載體并借助脂質(zhì)體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Eca-109細(xì)胞(干擾組)，同時設(shè)轉(zhuǎn)染無關(guān)干擾質(zhì)粒的Eca-109細(xì)胞為陰性對照，未轉(zhuǎn)染細(xì)胞為空白對照。采用Western blot檢測survivin基因沉默效果，MTT、平板克隆形成實驗及流式細(xì)胞術(shù)分析干擾前后Eca-109細(xì)胞增殖與凋亡的變化。結(jié)果：與兩對照組相比，干擾組Survivin蛋白的表達(dá)降低(F=79.397，P<0.001)；MTT檢測結(jié)果顯示，干擾組抑制細(xì)胞增殖效果優(yōu)于兩對照組，而平板克隆形成實驗顯示干擾組克隆形成率低于兩對照組(F=162.026，P<0.001)；流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，干擾組凋亡指數(shù)高于兩對照組(F=2 284.205，P<0.001)。結(jié)論：RNA干擾可特異性沉默survivin基因的表達(dá)，抑制Eca-109細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

AbstractAim: To inhibit endogenous survivin expression by RNA interference technology and investigate the effects on proliferation and apoptosis of Eca-109 cells.Methods: An siRNA expressing vector targeting survivin was constructed and transfected into Eca-109 cells via LipofectamineTM2000 to establish stable transfection cell line.The Eca-109 cells transfected non-sense sequence and those untransfected were used as control.The expression level of Survivin protein was detected by Western blot to observe the interference effect; cell proliferation of Eca-109 cells was determined by MTT assay and colony formation assay; cell apoptosis of Eca-109 cells was measured by flow cytometry analysis.Results: Compared with the 2 control groups, the expression level of Survivin protein in the interference group was significantly reduced(F=79.397，P<0.001); cell proliferation in the interference group was distinctly inhibited(F=162.026，P<0.001); the apoptosis index in the interference group was significantly increased(F=2 284.205，P<0.001). Conclusion: Knockdown of endogenous survivin via specific RNA interference can effectively inhibit cell proliferation and significantly induce cell apoptosis of Eca-109 cells.

Survivin作為一種在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用的凋亡抑制蛋白，廣泛表達(dá)于人類多種腫瘤，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、抑制細(xì)胞凋亡等功能[1-4]。食管癌是我國常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其發(fā)生發(fā)展是多因素參與、多階段進(jìn)展的過程。目前針對食管癌中晚期患者臨床上依然采取手術(shù)根治輔以放化療，但術(shù)后5 a生存率較低，預(yù)后較差[5]。由此，人們嘗試將分子靶向基因治療應(yīng)用于臨床實踐中。目前已證實[6]，survivin基因高表達(dá)于食管癌組織中，而在正常食管組織中基本不表達(dá)。因此，survivin有望成為食管癌患者基因治療的潛在新靶點。該研究選擇survivin基因作為干擾靶點，利用RNA干擾技術(shù)檢測沉默該基因?qū)κ彻馨〦ca-109細(xì)胞增殖與凋亡的影響，為食管癌的診斷與治療提供理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料Eca-109細(xì)胞由上海細(xì)胞生物研究所建株。RPMI 1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清(FBS)購自Gibco公司，MTT、DMSO及LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒購自Invitrogen 公司，引物DNA、T4 DNA連接酶、BamHⅠ/HindⅢ限制性內(nèi)切酶、Taq DNA聚合酶均購自TaKaRa公司，蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)購自Promega公司，BCA蛋白濃度檢測試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒均購自美國Pierce公司，質(zhì)粒抽提試劑盒購自上海華舜生物工程公司，Survivin和β-actin抗體購自Santa Cruz公司，干擾質(zhì)粒pRNAT-U6.1/Neo、陰性對照干擾質(zhì)粒siRNA購自Gencript公司,Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)Eca-109細(xì)胞培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)70%~80%時，以2.5 g/L胰蛋白酶進(jìn)行消化與傳代。

1.3靶向survivin的寡核苷酸序列的設(shè)計利用生物信息學(xué)軟件，針對survivin基因487~505 bp的靶位點設(shè)計兩條互補(bǔ)的DNA鏈，其序列分別為：5’-GATCCAGAATTTGAGGAAACTGCGCTGTGAAGCCAC AGATGGGCGCAGTTTCCTCAAATTCTTTTTTA-3’和3’-GTCTTAAACTCCTTTGACGCGACACTTCGGTGTCT ACCCGCGTCAAAGGAGTTTAAGAAAAAATTCGA-5’;兩條DNA鏈的結(jié)構(gòu)均為：BamHⅠ+正義序列+莖環(huán)序列+反義序列+轉(zhuǎn)錄終止子+HindⅢ，在細(xì)胞內(nèi)形成所謂的“發(fā)夾結(jié)構(gòu)”。

1.4siRNA表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建載體pRNAT-U6.1/Neo經(jīng)BamH Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切后與由TaKaRa公司合成的靶向survivin的寡核苷酸退火后連接，并進(jìn)行轉(zhuǎn)化，隨后挑取克隆，進(jìn)行質(zhì)粒抽提、菌落PCR鑒定及測序，得到針對survivin的siRNA表達(dá)質(zhì)粒pRNAT-siRNA-survivin，同法構(gòu)建陰性對照質(zhì)粒：pRNAT-siRNA-control，最后兩質(zhì)粒分別大量抽提后備用。

1.5細(xì)胞轉(zhuǎn)染待Eca-109細(xì)胞達(dá)對數(shù)生長期時，將干擾質(zhì)粒pRNAT-siRNA-survivin和陰性對照質(zhì)粒pRNAT-siRNA-control按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明分別轉(zhuǎn)染Eca-109細(xì)胞，48 h后用G418篩選2~3周，可見典型的抗性克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)，建成穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，分別為干擾組和陰性對照組，同時設(shè)未轉(zhuǎn)染的Eca-109細(xì)胞為空白對照。

1.6survivin基因沉默效果的Western blot檢測

取對數(shù)生長期的上述3組細(xì)胞，按蛋白抽提要求進(jìn)行處置，分別取50 μg總蛋白進(jìn)行不連續(xù)SDS-PAGE電泳；電泳結(jié)束后，用半干石墨電轉(zhuǎn)移2 h，將分離出的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用PBS配制的50 g/L脫脂奶粉溶液在室溫?fù)u床上封閉1~2 h，加入鼠抗人單克隆一抗(按1300稀釋)，4 ℃過夜孵育，洗膜，再加入相應(yīng)二抗，室溫孵育1.5 h，再洗膜，經(jīng)ECL化學(xué)發(fā)光檢測和拍照，以β-actin作為內(nèi)對照，結(jié)果進(jìn)行灰度掃描，以Survivin/β-actin灰度值的比值作為Survivin蛋白的表達(dá)水平。重復(fù)實驗3次。

1.7細(xì)胞增殖的MTT檢測分別將對數(shù)生長期的上述3組細(xì)胞按0.5×104個/孔接種于96孔板，每孔200 μL，每組接種8孔；培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞融合達(dá)80%左右時每孔加MTT 20 μL，繼續(xù)孵育4 h，棄培養(yǎng)液，每孔再加入150 μL DMSO，振蕩10 min；然后在酶標(biāo)儀上測定490 nm處的OD值進(jìn)行比色；如此每隔24 h重復(fù)上述步驟，共檢測6 d。最后以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，間隔時間為橫坐標(biāo)，繪制生長曲線。

1.8細(xì)胞增殖的平板克隆形成檢測取對數(shù)生長期的上述3組細(xì)胞，分別行常規(guī)胰蛋白酶消化，并吹打成單細(xì)胞懸液，按200個/孔接種于6孔板，每種細(xì)胞接種3孔，置37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)2~3周，直至肉眼可見細(xì)胞克隆，終止培養(yǎng)；棄去上清液，用PBS小心浸洗2次；加甲醇5 mL固定15 min，棄去固定液；加Giemsa液室溫染色10~30 min，用清水緩慢洗去染色液，空氣中干燥，將平皿倒置并疊加一張帶網(wǎng)格的透明膠片，用肉眼直接計數(shù)克隆數(shù)，并計算克隆形成率(克隆形成率=克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%)。重復(fù)實驗3次。

1.9細(xì)胞凋亡率的流式細(xì)胞術(shù)檢測取對數(shù)生長期的上述3組細(xì)胞各3瓶，按照Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒說明分別檢測各組細(xì)胞凋亡,計算凋亡指數(shù)(apoptosis index,AI)，AI=凋亡細(xì)胞數(shù)/觀察細(xì)胞數(shù)×100%。重復(fù)實驗3次。

1.10統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 17.0處理數(shù)據(jù)，應(yīng)用單因素方差分析比較3組細(xì)胞Survivin蛋白的表達(dá)水平、克隆形成率及AI的差異，兩兩比較采用LSD-t檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2結(jié)果

2.13組細(xì)胞Survivin蛋白的表達(dá)見圖1?？瞻讓φ战M、陰性對照組及干擾組Survivin蛋白的表達(dá)水平分別為(46.20±2.62)、(44.17±3.15)和(18.75±3.12)，3組間相比，F(xiàn)=79.397，P<0.001；與兩對照組相比，干擾組Survivin蛋白的表達(dá)水平降低(P<0.05)。

圖1　3組細(xì)胞中Survivin蛋白的表達(dá)

2.23組細(xì)胞增殖的變化見圖2、3，表1。由圖2可知，從第4天開始，干擾組Eca-109細(xì)胞的生長活力比陰性對照組和空白對照組降低，而后兩者的細(xì)胞生長活力無明顯變化。由圖3、表1可知，與兩對照組相比，干擾組的細(xì)胞克隆生長速度較慢，形成的克隆較小，克隆數(shù)較少；干擾組克隆形成率較陰性對照組及空白對照組低。

圖2　3組細(xì)胞的生長曲線

圖3　3組細(xì)胞的平板克隆形成情況

2.33組細(xì)胞AI的比較見表1。由表1可知，與兩對照組相比，干擾組細(xì)胞的AI升高。

表1　3組細(xì)胞平均克隆形成率和AI的比較　%

*：與兩對照組相比，P<0.05。

3討論

survivin作為一種抗凋亡基因，與腫瘤的生長、腫瘤血管生成、腫瘤細(xì)胞對放化療藥物的敏感性以及腫瘤的診斷、治療、預(yù)后及復(fù)發(fā)等密切相關(guān)；抑制survivin基因的表達(dá)能夠在一定程度上誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，進(jìn)而提高細(xì)胞對放化療藥物的敏感性[7]。同時survivin基因具有高度保守性，幾乎高表達(dá)于人類所有的腫瘤組織中，與惡性腫瘤的關(guān)系尤為密切，而在分化成熟的成年組織及癌旁正常組織中均無表達(dá)[8]。針對該特點，研究者[9-11]開展了大量有關(guān)食管癌與survivin的研究，結(jié)果均表明survivin在食管癌組織中高表達(dá)，可能作為癌基因參與食管癌的發(fā)生、發(fā)展與形成，而在正常食管組織中基本不表達(dá)。因此，survivin有望成為食管癌基因治療的特異性靶點，進(jìn)而更好地實現(xiàn)包括手術(shù)、放化療及基因治療等在內(nèi)的理想的綜合治療措施。

RNA干擾技術(shù)作為近年來研究哺乳動物細(xì)胞功能基因組學(xué)的一個新工具，具有高度序列專一性，可以特異地產(chǎn)生由雙鏈DNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后特定基因沉默的效果[12]；依據(jù)該原理，針對siRNA的RNA干擾技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)及藥物研究等眾多研究領(lǐng)域中，同時也為臨床眾多惡性腫瘤尤其是中晚期腫瘤患者開辟了基因治療的新路徑。

該研究中作者利用RNA干擾和重組體技術(shù)構(gòu)建靶向survivin基因的siRNA表達(dá)質(zhì)粒pRNAT-siRNA-survivin，并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Eca-109細(xì)胞，結(jié)果顯示干擾后Survivin蛋白的表達(dá)水平較轉(zhuǎn)染陰性對照質(zhì)粒的陰性對照組及未轉(zhuǎn)染的空白對照組下調(diào)，亦證實了構(gòu)建的pRNAT-siRNA-survivin表達(dá)質(zhì)粒具有高度特異性；MTT和平板克隆形成實驗結(jié)果表明干擾后Eca-109細(xì)胞較兩對照組的細(xì)胞活力明顯下降，生長緩慢，其克隆形成較小，數(shù)量較少，證實沉默survivin基因的表達(dá)能夠抑制Eca-109細(xì)胞的增殖；流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果同時證實了抑制survivin基因的表達(dá)也可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

總之，該研究主要通過體外實驗證實了沉默survivin基因可抑制Eca-109細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；為了更好地指導(dǎo)臨床實踐，作者擬進(jìn)一步探索沉默survivin基因?qū)κ彻馨┘?xì)胞重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響，以及通過動物實驗更直觀地觀察靶向survivin的siRNA與食管癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。

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*國家留學(xué)基金委河南省地方合作項目201308410293；河南省教育廳科學(xué)技術(shù)研究重點項目(基礎(chǔ)研究計劃)13A320436；河南省科技廳基礎(chǔ)與前沿科技研究項目132300410464；河南省衛(wèi)生廳及鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院共建項目；河南省衛(wèi)生科技創(chuàng)新型人才工程中青年科技創(chuàng)新人才項目4099；河南省醫(yī)學(xué)科技攻關(guān)計劃項目2011020038

Effects of silencing survivin gene by RNA interference on proliferation and apoptosis of Eca-109 cells

NIUZhaoxia,LINingning,CHENJie,LIYipei,PENGRuirui,QINZifang

DepartmentofPathophysiology,HenanMedicalCollege，Zhengzhou451191

Key wordsRNA interference;survivin;cell proliferation;cell apoptosis;Eca-109 cell

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2015.06.003

中圖分類號R735.1