王君敏，薛敬禮，葛蓓蕾，莊玉偉，杜春燕，薛　昆

1)鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心 鄭州 450052　2)河南省科學(xué)院高新技術(shù)研究中心 鄭州 450002　3)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科 鄭州 450052

△女，1984年10月生，博士，副教授,研究方向：多糖硫酸化修飾及活性研究，E-mail:wangjunmin@zzu.edu.cn

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枸杞多糖及其硫酸酯體外免疫及抗腫瘤活性*

王君敏1)△，薛敬禮1)，葛蓓蕾1)，莊玉偉2)，杜春燕1)，薛昆3)

1)鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心 鄭州 4500522)河南省科學(xué)院高新技術(shù)研究中心 鄭州 4500023)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科 鄭州 450052

△女，1984年10月生，博士，副教授,研究方向：多糖硫酸化修飾及活性研究，E-mail:wangjunmin@zzu.edu.cn

關(guān)鍵詞硫酸化枸杞多糖；脾淋巴細(xì)胞增殖；細(xì)胞因子；EC109 細(xì)胞；細(xì)胞遷移

摘要目的：研究枸杞多糖及其硫酸酯體外免疫和抗腫瘤活性。方法：分別采用水提一步醇沉法和分步醇沉法提取不同的多糖LBPS30、LBPS70和LBPSt，純化后用氯磺酸-吡啶法修飾得到3種硫酸化枸杞多糖sLBPS30、sLBPS70和sLBPSt。采用MTT法檢測(cè)多糖對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖和食管癌EC109細(xì)胞抑制的影響，ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-2、IFN-γ和IL-24的含量，劃痕法檢測(cè)細(xì)胞遷移情況。結(jié)果：sLBPSt和 sLBPS30的淋巴細(xì)胞增殖率和不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)EC109細(xì)胞的抑制率都較高； sLBPSt組細(xì)胞上清液中4種淋巴細(xì)胞因子含量均顯著高于細(xì)胞對(duì)照組(P<0.05)；sLBPSt組細(xì)胞遷移數(shù)顯著低于其余各組(P<0.05)。結(jié)論：硫酸化修飾能顯著增強(qiáng)體外脾淋巴細(xì)胞增殖，促進(jìn)淋巴細(xì)胞四種細(xì)胞因子的分泌，并能抑制EC109細(xì)胞生長(zhǎng)，降低EC109細(xì)胞遷移速率，且與硫酸基含量有一定的關(guān)系。sLBPSt和sLBPS30總體效果較好。

AbstractAim: To screen the effective Lycium barbarum polysaccharides(LBPSs) according to researching the effects of immunity and antitumor activity on LBPSs and their sulfates in vitro. Methods: Three types of LBPSs, LBPS30,LBPS70 and LBPSt were extracted by water decoction and stepwise or one-step ethanol precipitation methods and further modified using the chlorosulfonic acid-pyridine method based on previous experiments, yielding three sulfated LBPSs (sLBPSs), sLBPSt, sLBPS30, sLBPS70, respectively. The effects of six polysaccharides spleen lymphocyte proliferation and their antitumor activities against EC109 cells in vitro were evaluated by MTT method. The contents of TNF-α, IL-2, IFN-γ and IL-24 in cell supernatant were determined by ELISA method. Cell migration model was induced by scratch method and the migrating cells were counted to observe the effects of polysaccharides on EC109 cell migration inhibition. Results: The lymphocyte proliferation ratios and inhibition ratio against EC109 of sLBPSt and sLBPS30 group at different time points were higher than those of other groups, the contents of four cytokines of sLBPSt group were significantly higher than those of the control group(P<0.05), the migrating cells of sLBPSt group were also fewer than those of other group(P<0.05). Conclusion: sLBPSs could increase conA-activated lymphopoiesis, promote the secretion of TNF-α, IL-2, IFN-γ and IL-24. Moreover, they could inhibit the EC109 cells′ viability and reduce the rates of tumor cell migration in vitro, indicating that sulfated modification enhanced the immunoregulatory and antitumor activities of LBPSs. sLBPS30 and sLBPSt showed the best performance, could be used as materials for further research.

硫酸化多糖(SPS) 是指含硫酸基團(tuán)的天然及半合成的酸性多糖，是大分子鏈中單糖分子的某一羥基被硫酸基取代而形成的多功能生理活性物質(zhì)，包括從各種動(dòng)植物中提取分離出來的各種糖復(fù)合物，是含硫酸根水溶性的雜多糖[1]。枸杞是我國(guó)馳名中外的名貴中藥材，藥食同源，其藥用價(jià)值備受歷代醫(yī)家的推崇，在我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中具有重要的地位。枸杞多糖 (Lycium barbarum polysaccharide，LBP) 是枸杞主要的生物活性物質(zhì)之一。研究[2]證明枸杞多糖具有增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能、抑制腫瘤、降血糖、降血脂等多種功能。該實(shí)驗(yàn)采用氯磺酸-吡啶法分別對(duì)一種總枸杞多糖和兩種分級(jí)多糖進(jìn)行硫酸化修飾后，比較硫酸化多糖體外對(duì)脾淋巴細(xì)胞增殖以及抑制EC109細(xì)胞活性的影響，同時(shí)篩選出效果較好的多糖，為下一步研究提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1主要試劑及儀器氯磺酸 (上海實(shí)驗(yàn)試劑有限公司)；吡啶(西隴化工股份有限公司)；DMEM培養(yǎng)基(Hyclone 公司)，GT-T551(TaKaRa公司)，鼠外周血淋巴細(xì)胞分離液(天津?yàn)笊锕?；胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)；MTT、DMSO(美國(guó)Sigma公司)；RPMI 1640、伴刀豆素球蛋白(ConA)均購(gòu)自 Hyclone 公司，ConA使用前用RPMI 1640培養(yǎng)液配制；枸杞(禹州凱旋藥業(yè))。人食管癌EC109細(xì)胞系為鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)室保存。細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo Scientific 8000)，光學(xué)顯微鏡(XDS-1A)，倒置拍照顯微鏡(Leica DMI3000B)，低速離心機(jī)(上海盧湘儀 TDZ4B-WS)，酶標(biāo)檢測(cè)儀(Thermo MK3 型)，搖床(Qilinbeier TS-1000)。

1.2硫酸化多糖的制備

1.2.1多糖的提取和純化取枸杞經(jīng)水煎和一步醇沉得到總枸杞多糖(total LBPS，LBPSt)。將LBPSt稀釋成1 g/mL的溶液，用分步醇沉法依次緩慢加入體積分?jǐn)?shù)95%乙醇使乙醇終體積分?jǐn)?shù)分別達(dá)30%、50%、70%、80%，得到4個(gè)不同的分級(jí)多糖，然后分別將醇沉體積分?jǐn)?shù)為30%、70%的分級(jí)多糖以及總多糖用Sevage法[3]去蛋白，Sephadex G-150柱過濾，冷凍干燥，得到種純化的枸杞多糖(LBPS30、LBPS70、LBPSt)。

1.2.2氯磺酸-吡啶法[4]硫酸化修飾多糖將帶有攪拌裝置和冷凝裝置的三頸燒瓶置于冰鹽水浴中，加入25 mL預(yù)冷的無(wú)水吡啶，劇烈攪拌，在40 min內(nèi)逐滴勻速加入3.125 mL氯磺酸，待燒瓶中出現(xiàn)大量淡黃色固體時(shí)終止反應(yīng)，酯化試劑制備完成備用。精確稱取純化多糖400 mg加入裝有酯化試劑的三頸燒瓶中，90 ℃水浴振蕩攪拌反應(yīng)2 h。反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，反應(yīng)液加入預(yù)冷的100 mL冰水中，用飽和NaOH 溶液中和至pH 7.5，之后邊攪拌邊緩慢加入3倍體積的無(wú)水乙醇，靜置24 h，離心取沉淀。用自來水流水透析48 h、蒸餾水透析24 h。透析液經(jīng)冷凍干燥，得到3種硫酸化枸杞多糖sLBPS30、sLBPS70和sLBPSt。超聲-酸性鉻酸鋇分光光度法檢測(cè)3種硫酸化枸杞多糖中硫酸鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為542.75、291.71和390.67 mg/g。經(jīng)紅外光譜測(cè)定，sLBPSs在1 235 cm-1和812 cm-1有兩個(gè)特征性吸收峰，證明了硫酸基已經(jīng)和多糖結(jié)合成酯。實(shí)驗(yàn)前，將6種多糖按照凈含量倍比稀釋20、21、22、23、24倍使其質(zhì)量濃度分別為0.391、0.196、0.098、0.049、0.024 mg/L，常規(guī)消毒備用。

1.3多糖體外免疫效果測(cè)定

1.3.1多糖對(duì)體外小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖影響的測(cè)定以頸椎脫臼法處死小鼠，無(wú)菌取出脾臟，置于預(yù)先倒入Hanks液的培養(yǎng)皿中，按照200目鋼網(wǎng)研磨法制備小鼠單細(xì)胞懸液。計(jì)數(shù)活細(xì)胞比例大于95%后，用RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為1×107mL-1，加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100 μL，然后每孔加入從高到低不同濃度多糖100 μL，每個(gè)樣品重復(fù)5孔，另設(shè)ConA對(duì)照組(終濃度為10 mg/L)，細(xì)胞對(duì)照組(CC組，僅加等體積的細(xì)胞培養(yǎng)液)。37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2條件下培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束前4 h，取出加入MTT 30 μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，每孔加入100 μL DMSO，將細(xì)胞板置于微量振蕩器上振蕩混勻5 min使沉淀完全溶解。在570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值(A570)，作為T淋巴細(xì)胞增殖的指標(biāo)。若多糖組A570值顯著大于對(duì)照組，則表明多糖顯著促進(jìn)T淋巴細(xì)胞增殖。同時(shí)計(jì)算淋巴細(xì)胞增殖率。增殖率=(A多糖組-A對(duì)照組)/A對(duì)照組×100%。

1.3.2ELISA檢測(cè)外周血淋巴細(xì)胞細(xì)胞因子的表達(dá)肝素抗凝鼠外周血5 mL，常規(guī)分離淋巴細(xì)胞?；罴?xì)胞計(jì)數(shù)后，用培養(yǎng)液調(diào)整濃度為1×105mL-1，接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔1 mL，24 h后離心去上清，對(duì)照組加入RPMI 1640，實(shí)驗(yàn)組均加入6.25 mg/L的相應(yīng)藥物，500 μL/孔，37 ℃，體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。24 h后取上清液1 000 r/min離心20 min，除去雜質(zhì)及細(xì)胞碎片，取上清檢測(cè)TNF-α、IL-2、IFN-γ和IL-24的含量。嚴(yán)格根據(jù)ELISA試劑盒使用說明書進(jìn)行操作。

1.4多糖體外抗腫瘤效果測(cè)定

1.4.1多糖對(duì)食管癌EC109細(xì)胞增殖的影響EC109細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，置體積分?jǐn)?shù)5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱孵育，2.5 g/L胰酶消化傳代。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的EC109細(xì)胞密度調(diào)整為1×105mL-1，接種于96孔板，每孔100 μL，37 ℃，體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。實(shí)驗(yàn)組加入用RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋成不同濃度的多糖，每孔200 μL；同時(shí)設(shè)單純細(xì)胞對(duì)照組

(CC組)，每組5個(gè)復(fù)孔，分別培養(yǎng)24、48、72 h后每孔加入15 μL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 100 μL，室溫避光震蕩10 min，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)492 nm波長(zhǎng)吸光值(A492)。計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=(1-A多糖組)/A對(duì)照組×100%。

1.4.2細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)將制備好的EC109細(xì)胞接種于6孔板，然后，用200 μL槍頭在每個(gè)孔板中央輕輕垂直進(jìn)行“一”字劃痕，PBS 緩沖液沖洗細(xì)胞表面 3 次。各組(每組3個(gè)復(fù)孔)分別迅速加入6.25 mg/L的不同藥物和淋巴細(xì)胞，淋巴細(xì)胞對(duì)照組(CC組)不加藥物，只加入淋巴細(xì)胞，空白對(duì)照組(BC組)加入等量的GT-T551，每孔2.5 mL，放進(jìn)細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后將細(xì)胞培養(yǎng)板取出，在相差倒置顯微鏡下放大100 倍觀察細(xì)胞遷移情況并拍照，利用 IPP 計(jì)數(shù)軟件計(jì)算越過劃痕的細(xì)胞數(shù)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 13.0分析，各組淋巴細(xì)胞細(xì)胞因子和EC109細(xì)胞遷移的差異采用單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2結(jié)果

2.1多糖體外免疫測(cè)定結(jié)果

2.1.1多糖對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的影響見圖1。sLBPSt組的淋巴細(xì)胞增殖效果最好，其次為sLBPS30與LBPS30組。

圖1　各組脾淋巴細(xì)胞的增殖率

2.1.2細(xì)胞因子測(cè)定結(jié)果見表1。

表1　各組細(xì)胞因子測(cè)定結(jié)果　ng·L-1

*：與sLBPS30組比較，P<0.05； #:與sLBPS70組比較，P<0.05；△：與sLBPSt組比較，P<0.05。

2.2多糖體外抗腫瘤效果測(cè)定結(jié)果

2.2.1多糖作用于EC109細(xì)胞24 h后的抑制作用

抑制率結(jié)果(圖2)顯示，sLBPS30的總體平均抑制率最高(26.74%)，其次為sLBPSt(24.21%)與LBPS70(23.53%)。

圖2　多糖作用24 h后EC109細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率

2.2.2多糖作用于細(xì)胞48 h后的抑制效果抑制率結(jié)果(圖3)顯示，除了LBPSt和LBPS30外，其余多糖的抑制率均隨著濃度的逐漸增大而升高，其中sLBPSt的總體平均抑制率最高(36.95%)，其次為sLBPS30(32.33%)與LBPSt(28.86%)。

圖3　多糖作用48 h后EC109細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率

2.2.3多糖作用于細(xì)胞72 h后的抑制效果抑制率結(jié)果(圖4)顯示，除了LBPSt和LBPS30外，其余多糖的抑制率均隨著濃度的逐漸增大而升高，其中sLBPS30的總體平均抑制率最高(48.83%)，其次為sLBPSt(46.35%)與LBPSt(40.47%)。

圖4　多糖作用72 h后EC109細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率

2.2.4多糖對(duì)EC109細(xì)胞遷移的影響結(jié)果(表2)顯示所有枸杞多糖組的細(xì)胞遷移數(shù)量均小于空白對(duì)照組和淋巴細(xì)胞對(duì)照組(P<0.05)，其中細(xì)胞遷移數(shù)最低的是sLBPSt。

表2　各組EC109細(xì)胞遷移數(shù)的比較

F=375.171,P<0.001;*：與BC和CC組比較，P<0.05。

3討論

淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)是在淋巴細(xì)胞有絲分裂原ConA刺激下，淋巴細(xì)胞的蛋白質(zhì)及核酸合成增加，體積增大最終轉(zhuǎn)化為具有分裂能力的淋巴母細(xì)胞，其增殖反應(yīng)能力是反映機(jī)體細(xì)胞免疫功能最直接的指標(biāo)[5-6]。該體外淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，幾種枸杞多糖在一定濃度范圍內(nèi)均能顯著促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)，其中sLBPSt、sLBPS30的增殖效果最好。

TNF-α、IL-2、 IFN-γ均是生物體內(nèi)具有免疫調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子，具有廣泛的生物活性，在機(jī)體抗腫瘤免疫中起著重要的作用，尤其與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)移具有密切關(guān)系，不僅能夠在一定程度上間接反映腫瘤的生長(zhǎng)狀況，同時(shí)也參與了與腫瘤相關(guān)的免疫調(diào)節(jié)活動(dòng)，直接或間接發(fā)揮抗腫瘤作用[7-9]。IL-24是最近發(fā)現(xiàn)的、具有細(xì)胞因子樣特性的腫瘤抑制基因，經(jīng)研究證實(shí)它不但能選擇性地抑制多種腫瘤生長(zhǎng)、誘導(dǎo)凋亡，還能抑制腫瘤血管形成、抑制腫瘤轉(zhuǎn)移，而且還不會(huì)影響正常細(xì)胞[10-11]。ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明6.25 mg/L的各多糖組4種抗腫瘤因子的含量均大于細(xì)胞對(duì)照組，其中sLBPSt能對(duì)淋巴細(xì)胞的TNF-α、IL-2、 IFN-γ、IL-24分泌可以達(dá)到明顯的促進(jìn)作用，sLBPS30對(duì)TNF-α、IFN-γ、IL-24分泌促進(jìn)作用明顯。說明這兩種硫酸化多糖能夠通過較好的誘導(dǎo)細(xì)胞因子的分泌加強(qiáng)機(jī)體免疫。

細(xì)胞增殖失控是惡性腫瘤重要的生物學(xué)特征。該實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明不同濃度的各多糖對(duì)EC109細(xì)胞作用不同時(shí)間后，細(xì)胞受到不同程度的抑制，且具有一定的時(shí)效和量效關(guān)系，相關(guān)性分析顯示

EC109細(xì)胞抑制率與藥物濃度及作用時(shí)間呈顯著正相關(guān)性。枸杞多糖硫酸化后抗腫瘤效果活性明顯增強(qiáng)，其中sLBPS30和sLBPSt在不同時(shí)間段的抑制率都比較高，即抑制EC109細(xì)胞增殖效果較好。以往的研究[12]也證實(shí)枸杞多糖硫酸化后能顯著提高脾淋巴細(xì)胞增殖，提高機(jī)體的抗體效價(jià)。腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力對(duì)于腫瘤轉(zhuǎn)移來說至關(guān)重要，該研究發(fā)現(xiàn)各多糖組均能夠顯著降低腫瘤細(xì)胞遷移速率，抑制腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散。其中sLBPSt遷移細(xì)胞數(shù)量最小，表明其抑制細(xì)胞增殖和遷移能力最強(qiáng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡效果最明顯。

硫酸化多糖的性質(zhì)不僅與硫酸根的含量有關(guān)，還有相對(duì)分子質(zhì)量、結(jié)構(gòu)有一定的關(guān)系。研究[13]表明，多糖硫酸酯的生物活性與其取代度在一定范圍內(nèi)呈正相關(guān)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，sLBPS30硫酸基含量最高，其次為sLBPSt。sLBPSt和sLBPS30具有較明顯的體外增強(qiáng)免疫和抗腫瘤活性，sLBPS70則效果不顯著，可能與其硫酸基含量較低有直接關(guān)系。sLBPSt的綜合效果優(yōu)于sLBPS30，可能與相對(duì)分子質(zhì)量和一級(jí)結(jié)構(gòu)有關(guān)，具體還需要進(jìn)行下一步研究。

以上結(jié)果表明，硫酸化修飾能顯著增強(qiáng)枸杞多糖體外的增強(qiáng)免疫和抗腫瘤活性。3個(gè)硫酸化枸杞多糖相比，sLBPSt和sLBPS30組的效果優(yōu)于sLBPS70，可以作為下一步研究的材料。

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Immunomodulatory and antitumor activities of Lycium barbarum polysaccharides in vitro and their sulfates

WANGJunmin1),XUEJingli1),GEBeilei1),ZHUANGYuwei2),DUChunyan1),XUEKun3)

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