齊　麟，李　偉

鐵道警察學(xué)院公安技術(shù)系 鄭州 450053

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人微管蛋白抗體的制備及其用于死亡時間推斷的價值*

齊麟，李偉#

鐵道警察學(xué)院公安技術(shù)系 鄭州 450053

關(guān)鍵詞人微管蛋白；抗體制備；死亡時間；大鼠

摘要目的：制備人微管蛋白抗體，并用其觀察大鼠死亡后腎臟組織中微管蛋白的降解規(guī)律與死亡時間的關(guān)系。方法：通過分子生物學(xué)方法制備小鼠抗人微管蛋白多克隆抗體。取48只大鼠，分為斷頸致死組和溺死組，每組24只，采用Western blot觀察死亡后24、48、72和96 h大鼠腎臟組織中微管蛋白的降解規(guī)律。結(jié)果：制備的小鼠抗人微管蛋白多克隆抗體效價超過18 000；2組大鼠死亡后，腎臟組織中微管蛋白均呈逐步降解的趨勢；斷頸致死組大鼠死后96 h腎臟組織檢測不到微管蛋白；溺死組大鼠死后72 h腎臟組織檢測不到微管蛋白。結(jié)論：大鼠死亡后，腎臟組織中微管蛋白呈逐步降解的趨勢；溺死和斷頸大鼠死亡后腎臟組織中微管蛋白的降解速度存在差異。

AbstractAim: To prepare human tubulin antibody and explore the relationship between degradation of tubulin in rat kidney tissue and postmortem interval(PMI) after death. Methods: Molecular biology methods were used to purity the mouse anti-human tubulin polyclonal antibody. A total of 48 rats were allocated into broken neck death group(n=24) and drowning group(n=24). Western blot was used to investigate the degradation of tubulin at 24,48,72,and 96 h after death.Results: The antibody titer of obtained antibodies reached to 18 000. Tubulin could not be detected in rat kidney tissue at 96 h after death in broken neck death group，while could not be detected at 72 h after death in drowning group.Conclusion: The content of tubulin is decreasing with time,which degradates at different speed in rats with different cause of death.

死亡時間(postmortem interval，PMI)是指從死亡發(fā)生到法醫(yī)學(xué)尸體檢驗時所經(jīng)過的時間間隔，又稱死后經(jīng)過時間[1]。PMI推斷對于確定偵查方向和范圍具有重要意義，一直是法醫(yī)學(xué)研究的重點和難點。推斷PMI的方法很多，傳統(tǒng)的方法主要依據(jù)死后變化(如尸斑、尸冷、尸僵、角膜混濁)，蠅蛆生長發(fā)育規(guī)律，死后胃內(nèi)容物排空等情況，但這些方法的影響因素較多，僅能粗略估計PMI，存在一定的局限性。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展和檢測技術(shù)的更新，機體死亡后蛋白質(zhì)降解規(guī)律被越來越廣泛地用于PMI推斷的研究，時間依賴性的蛋白降解已逐漸成為法醫(yī)學(xué)PMI研究的熱點。該研究在克隆獲得人管家基因——微管蛋白的基礎(chǔ)上，構(gòu)建融合表達載體，在大腸桿菌中表達人微管蛋白并進行純化，將純化蛋白免疫BALB/c小鼠制備多克隆抗體，觀察不同方式致死大鼠死后腎臟微管蛋白的降解規(guī)律，為法醫(yī)病理學(xué)研究中推斷PMI打下基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料原核表達載體PET32a、大腸桿菌原核表達宿主菌BL21購自New England Biolabs公司，pGEM-T載體購自Promega公司，大腸桿菌DH5α為鐵道警察學(xué)院生化快速鑒別實驗室常規(guī)保種，瓊脂糖膠回收試劑盒和小量質(zhì)粒提取試劑盒為Omega公司產(chǎn)品，T4 DNA連接酶、Taq酶、DNA Marker、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ及XhoⅠ為TaKaRa公司產(chǎn)品，蛋白Marker為Fermentas公司產(chǎn)品，堿性磷酸酶羊抗鼠IgG(二抗)、鎳柱購自美國安瑪西亞公司，NC膜購自PALL公司，ECL Western blot顯影試劑盒購自GE Healthcare公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。SPF級BALB/c小鼠、SD大鼠購自鄭州大學(xué)實驗動物中心。人胚腎細胞(HEK293T)由中國科學(xué)院南海海洋研究所向志明博士惠贈。實驗中引物的合成及DNA序列測定由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成。

1.2人微管蛋白基因開放讀碼框(open reading frame，ORF)的克隆HEK293T總RNA的提取及cDNA一鏈的反轉(zhuǎn)錄合成參照試劑盒說明書，合成的cDNA一鏈加滅菌雙蒸水稀釋6倍用作擴增模板。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫人微管蛋白信息(基因編號：NM_178014)，在微管蛋白 ORF區(qū)設(shè)計引物，進行PCR擴增。第1輪PCR上、下游引物序列分別為：5’-GGTGCCAAGTTCTGGGAGGTGA-3’和5’-CCATCTCGTCCATGCCCTCG-3’。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 20 s，60 ℃30 s，72 ℃ 60 s，共20個循環(huán)；最后72 ℃延伸 10 min。取第1輪PCR產(chǎn)物稀釋5倍后作為巢式PCR模板進行第2輪擴增。上、下游引物分別為：5’-ACCTACCACGGGGA CAGCGAC-3’和5’-AATGAAGGTGACTGCCATCTT GAGG-3’。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 20 s，58 ℃30 s，72 ℃ 45 s，共30個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收后，與pGEM-T載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，通過菌落PCR挑選陽性克隆，經(jīng)上海英駿生物技術(shù)有限公司測序驗證克隆結(jié)果后，將陽性菌株保存于-70 ℃冰箱備用。

1.3原核表達載體的構(gòu)建使用Primer Premier 5.0設(shè)計上、下游引物，以pGEM-T-微管蛋白為模板進行PCR擴增，其中上游引物序列：5’-AAAGGATC CGAACCTGGGACCAT-3’，下游引物序列：5’-TTTCTCGAGCAAAGTAGCTGCTGTTC-3’，PCR擴增片段大小為838 bp，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖膠回收試劑盒回收純化后和PET32a空載體質(zhì)粒進行BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化后于16 ℃連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化原核表達宿主菌BL21，挑取LB平板上的單菌落進行菌落PCR擴增，對擴增產(chǎn)物進行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測驗證后，-70 ℃保存。

1.4重組質(zhì)粒PET32a-微管蛋白的誘導(dǎo)表達及純化

取1.3中的保菌液在含氨芐青霉素的新鮮LB液體培養(yǎng)基中放大培養(yǎng)至OD600 nm=0.6，加入0.1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)3 h以上后，利用鎳柱純化重組蛋白。

1.5鼠抗人微管蛋白血清的制備及效價檢測抗體制備參考劉智勇等[2]的方法進行。取1.4中純化獲得的人微管蛋白100 μg進行SDS-PAGE電泳后，切下目的蛋白并漂洗干凈后加入等體積的弗氏完全佐劑，用注射器反復(fù)抽打使完全乳化。取1 mL乳化抗原溶液通過腹腔注射法注入BALB/c小鼠體內(nèi)作為基礎(chǔ)免疫?；A(chǔ)免疫14 d后使用弗氏不完全佐劑乳化的微管蛋白進行加強免疫，注射間隔為7 d。加強免疫4次后獲得鼠抗人微管蛋白血清。獲得的鼠抗人微管蛋白多克隆抗體血清用斑點酶聯(lián)免疫吸附法確定效價。

1.6動物死亡模型的建立將實驗用SD大鼠48只分成斷頸致死組和溺死組，每組24只。斷頸致死組直接采用斷頸方式使大鼠死亡，溺死組將大鼠放入20 L裝滿水的玻璃缸中溺死。上述2組大鼠均以心搏完全消失為死亡依據(jù)。大鼠致死后存放于室溫(25 ℃)環(huán)境中24、48、72和96 h后，每個時間點取6只，解剖分離腎臟組織，液氮保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7大鼠腎臟組織中微管蛋白的表達檢測參考敬懷志等[3]建立的方法提取大鼠腎臟組織蛋白，根據(jù)楊繼要等[4]建立的方法進行Western blot實驗。提取蛋白后依次進行SDS-PAGE電泳和轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜后的NC膜經(jīng)封閉、一抗孵育、二抗孵育等步驟后按ECL Western blot說明書的操作要求，根據(jù)需要選擇曝光時間，并進行膠片掃描。

2結(jié)果

2.1人微管蛋白的制備及純化經(jīng)過巢式PCR后，擴增出單一的條帶(圖1)，與目的片段大小一致，測序結(jié)果證實獲得人微管蛋白基因ORF片段。在LB平板上隨機挑選6個克隆，經(jīng)菌落PCR擴增，大小約830 bp(圖2)，與預(yù)計相符。經(jīng)誘導(dǎo)后，在45 000~66 000有明顯的蛋白條帶出現(xiàn)，相對分子質(zhì)量和預(yù)測的人微管蛋白融合蛋白相同，利用鎳柱純化重組蛋白，獲得較為單一的蛋白條帶(圖3)。

2.2鼠抗人微管蛋白多克隆抗體的制備斑點酶聯(lián)免疫吸附法結(jié)果證實：小鼠抗人微管蛋白多克隆抗體的效價達到18 000以上(圖4)。

2.3大鼠死后腎臟組織中微管蛋白的降解情況結(jié)果見圖5。兩種死亡原因致死后大鼠腎臟組織中微管蛋白均呈逐步降解的趨勢。致死后24 h，2組大鼠腎臟組織中微管蛋白的降解均不明顯，致死后48 h開始迅速降解。斷頸致死組大鼠死亡后72 h仍可檢測到微管蛋白，96 h時檢測不到；溺死組大鼠微管蛋白的降解更加迅速，48 h仍可檢測到，72 h后檢測不到。

圖1　人微管蛋白基因克隆

圖2　PET32a-微管蛋白陽性克隆的PCR檢測

圖3　人微管蛋白的原核表達及純化

圖4　鼠抗人微管蛋白血清效價的測定

圖5　2組大鼠死亡后腎臟組織中微管蛋白的降解情況

3討論

由于影響PMI的因素較多，單一指標(biāo)尚不能完全反映PMI的變化情況。因此，選擇多個指標(biāo)綜合判斷PMI是研究的關(guān)鍵。目前，運用分子生物學(xué)技術(shù)進行PMI研究的方法主要有單細胞凝膠電泳定量技術(shù)[5]和流式細胞儀技術(shù)[6]等，這些方法通過分析死亡后機體DNA含量下降的趨勢以及管家基因mRNA隨時間變化的規(guī)律來推斷PMI。

蛋白是機體的重要組成部分，機體個體死亡后，由于新陳代謝的停止而發(fā)生了巨大的病理生理學(xué)變化，具體表現(xiàn)為：細胞內(nèi)環(huán)境紊亂，溶酶體破裂導(dǎo)致包括水解酶、蛋白酶以及核酸酶在內(nèi)的多種酶類釋放激活，細胞發(fā)生自溶，逐漸失去生物學(xué)功能。細胞自溶的發(fā)生使得蛋白被分解，含量逐漸減少直至消失，并表現(xiàn)出時間依賴性，因此，研究機體死亡后蛋白的降解規(guī)律，利用蛋白的含量變化可推斷PMI。

微管蛋白是細胞骨架的重要組分[7]，與細胞間物質(zhì)運輸[8]、細胞運動[9]、細胞增殖分化[10]、維持細胞形態(tài)構(gòu)建[11]及細胞信號傳導(dǎo)[12]等生物學(xué)功能密切相關(guān)。微管蛋白是管家基因的重要組成部分。機體死亡后，管家基因蛋白由于含量較高，受外界影響較小而呈現(xiàn)較慢的衰變率，從而非常適用于PMI的推斷。

該研究中斑點酶聯(lián)免疫吸附法結(jié)果顯示，當(dāng)多克隆抗體血清稀釋8 000倍時，蛋白顯色斑點明顯減弱，獲得的小鼠抗人微管蛋白多克隆抗體效價不高可能與微管蛋白的高度保守性有關(guān)，保守度較高的外來蛋白對實驗用BALB/c小鼠免疫效應(yīng)的激活不利導(dǎo)致獲得的抗體血清效價偏低。同時，微管蛋白在各物種中高度保守和高度同源性表明其功能的一致性，為法醫(yī)學(xué)PMI的推斷提供了理論依據(jù)。

肖俊輝等[13]的研究證實，大鼠乙醚麻醉死亡48 h后，肝臟中微管蛋白已檢測不到。該研究發(fā)現(xiàn)，斷頸死亡和溺死后大鼠腎臟組織中微管蛋白的降解速度不同，斷頸死亡模型中，微管蛋白在機體死亡后96 h檢測不到，但機體死亡72 h時仍有較高表達；溺死模型中，微管蛋白在機體死亡后72 h即檢測不到。溺死模型中微管蛋白降解快，可能是由于大量溺液進入體內(nèi)，引起組織滲透壓的改變，細胞腫脹，溶酶體釋放，從而使蛋白降解加速，提示法醫(yī)學(xué)實踐中應(yīng)用蛋白質(zhì)學(xué)的相關(guān)技術(shù)進行PMI的推斷時，應(yīng)注意死亡原因?qū)Φ鞍捉到馑俣鹊挠绊憽?/p>

參考文獻

[1]Siddhamsetty AK,Verma SK,Kohli A,et al.Exploring time of death from Potassium,Sodium,chloride,glucose & Calcium analysis of postmortem synovial fluid in semi arid climate[J].J Forensic Leg Med,2014,28(4):11

[2]劉智勇,孫錦峰.抗抗總黃曲霉毒素單抗F(ab')2多克隆抗體的制備及特性[J].鄭州大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版,2012,47(3):335

[3]敬懷志,邱峰,陳世知,等.非小細胞肺癌中TRIM25和PKM2蛋白表達[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2015,35(3):437

[4]楊繼要,馮若,金輝,等.混合血清孵育的肺腺癌組織雙向蛋白印跡圖譜的建立[J].鄭州大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版,2014,49(1):45

[5]Zheng J,Li X,Shan D,et al.DNA degradation within mouse brain and dental pulp cells 72 hours postmortem[J].Neural Reg Res,2012,7(4):290

[6]Boy SC，Bernitz H，Van Heerden WF.Flow cytometric evaluation of postmortem pulp DNA degradation[J].Am J Forensic Med Pathol,2003,24(2):123

[7]Kundu K, Banerjee PS, Garg R, et al. Cloning and sequencing of beta-tubulin and internal transcribed spacer-2 (ITS-2) of Eimeria tenella isolate from India[J].J Parasit Dis,2015,39(3):539

[8]Liu XY,Yang JL,Chen LJ,et al.Comparative proteomics and correlated signaling network of rat hippocampus in the pilocarpine model of temporal lobe epilepsy[J].Proteomics,2008,8(3):582

[9]Boggs AE,Vitolo MI,Whipple RA,et al.α-Tubulin acetylation elevated in metastatic and basal-like breast cancer cells promotes microtentacle formation, adhesion, and invasive migration[J].Cancer Res,2015,75(1):203

[10]Janke C.The Tubulin code: molecular components, readout mechanisms, and functions[J].J Cell Biol,2014,206(4):461

[11]Ogden A,Rida PC,Aneja R.Heading off with the herd: how cancer cells might maneuver supernumerary centrosomes for directional migration[J].Cancer Metastasis Rev,2013,32(1/2):269

[12]Alli E,Yang JM,Ford JM,et al.Reversal of stathmin-mediated resistance to paclitaxel and vinblastine in human breast carcinoma cells[J].Mol Pharmacol,2007,71(5):1233

[13]肖俊輝,陳玉川.蛋白質(zhì)降解與死亡時間推斷的初步研究[J].法醫(yī)學(xué)雜志,2005,21(2):110

*河南省科技廳重點衛(wèi)生科技攻關(guān)項目122102310159；河南省衛(wèi)生廳醫(yī)學(xué)科技攻關(guān)項目201203095

Antibody preparation of human tubulin and its value in evaluating postmortem interval

QILin，LIWei

DepartmentofPublicSecurityTechnology,RailwayPoliceCollege，Zhengzhou450053

Key wordshuman tubulin；antibody preparation；postmortem interval；rat

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2015.06.033

中圖分類號DF795.1

通信作者#，男，1973年5月生，碩士，副教授，研究方向：法醫(yī)病理學(xué)，E-mail：leewei22868@163.com