周 軍，張 茉，王 杰

(天津市藥品檢驗(yàn)所，天津 300070)

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益肺清化膏質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

周 軍，張 茉，王 杰

(天津市藥品檢驗(yàn)所，天津 300070)

目的：提高益肺清化膏的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法：采用薄層色譜法對益肺清化膏中的紫菀、拳參、甘草進(jìn)行定性鑒別；采用高效液相色譜法測定黃芪中黃芪甲苷的含量，色譜柱為安捷倫ZORBAX SB-C18柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈-水(36∶64)，柱溫為40 ℃，流速為0.8 ml/min，蒸發(fā)光散射檢測器。結(jié)果：薄層色譜中的特征斑點(diǎn)明顯，重現(xiàn)性好，無干擾；黃芪甲苷在0.515～1.030 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好, 平均回收率為102.39%，RSD為1.5%(n=6)。結(jié)論：本法專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確、快速，可有效控制產(chǎn)品的質(zhì)量，保證了臨床療效。

益肺清化膏，紫菀，拳參，甘草，薄層色譜，黃芪甲苷，高效液相色譜法

益肺清化膏是天津中新藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司達(dá)仁堂制藥廠生產(chǎn)的品種，具有益氣養(yǎng)陰、清熱解毒、化痰止咳的功效，用于氣陰兩虛所致的氣短、乏力、咳嗽、咯血、胸痛，也可用于晚期肺癌見上述癥候者的輔助治療。本品原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《國家食品藥品監(jiān)督管理局國家藥品標(biāo)準(zhǔn)》WS3-460(Z-066)-2001(Z)，標(biāo)準(zhǔn)中包括白花蛇舌草、黨參、甘草、敗醬草的薄層鑒別，黃芪甲苷的薄層掃描定量測定?，F(xiàn)對益肺清化膏質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了提高、完善，在原標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)上，對處方中甘草的TLC鑒別方法進(jìn)行了修訂，新增紫菀和拳參的TLC鑒別；并將原標(biāo)準(zhǔn)中黃芪甲苷的定量方法由薄層掃描法改為ELSD-HPLC法。修訂后的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，簡化了試驗(yàn)提取步驟，提高了藥品的質(zhì)量控制指標(biāo)，具有專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確性高的特點(diǎn)，現(xiàn)該標(biāo)準(zhǔn)已收錄在《中國藥典》2010年版第一增補(bǔ)本。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器 島津LC-20AD高效液相色譜儀，配有LC-20AD 泵、SIL-20自動(dòng)進(jìn)樣器、Alltech ELSD-2000檢測器、CTO-20AC柱溫箱；LC-solution 色譜工作站。METTLER TOLEDO AG135 型及METTLER AE 100型電子天平(瑞士梅特勒-托利多集團(tuán)生產(chǎn))；CAMAG薄層色譜成像系統(tǒng)(瑞士卡瑪公司生產(chǎn))；薄層色譜用普通硅膠G板(煙臺市化學(xué)工業(yè)研究所生產(chǎn))。

1.2 試藥 黃芪甲苷對照品(批號110781-200613，供含量測定用，純度為99.8%)、沒食子酸對照品(批號110831-200302)、紫菀對照藥材(批號120956-200504)、甘草對照藥材(批號121303-201003)，均于中國藥品生物制品檢定所購置。益肺清化膏樣品(天津中新藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司達(dá)仁堂制藥廠，批號5410016、5410021、5410022，規(guī)格為120 g/瓶)。實(shí)驗(yàn)中使用的處方藥材均由天津達(dá)仁堂制藥廠提供，由天津市藥品檢驗(yàn)所吳貴華副主任藥師鑒定，均符合《中國藥典》2010年版一部相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的要求。乙腈、甲醇為色譜純，水為去離子，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 紫菀的TLC鑒別 取益肺清化膏10 g，加乙酸乙酯30 ml，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)右宜嵋阴? ml使溶解，作為供試品溶液。另取紫菀對照藥材0.5 g，照供試品溶液制備方法制成對照藥材溶液。按處方配比取處方藥材10 g(紫菀除外)，按制法制得陰性樣品，再按照供試品溶液制備方法處理，作為陰性樣品溶液。按照《中國藥典》2010年版一部TLC法試驗(yàn)，吸取上述三種溶液各4 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(20∶10∶1∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。結(jié)果供試品色譜中在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性樣品色譜在相應(yīng)位置無干擾，見圖1。

1.紫菀陰性樣品溶液 2.紫菀對照藥材 3.樣品1(批號5410016) 4.樣品2(批號5410021) 5.樣品3(批號5410022) 6.沒食子酸對照品 7.拳參陰性樣品

2.1.2 拳參的TLC鑒別 取“2.1.1”項(xiàng)下的紫菀供試品溶液，作為供試品溶液。另取沒食子酸對照品適量，加甲醇制成每1 ml含0.5 mg的溶液，作為對照品溶液。按處方配比取處方藥材10 g(拳參除外)，按制法制得陰性樣品，再按照供試品溶液制備方法處理，作為陰性樣品溶液。按照《中國藥典》2010年版一部TLC法試驗(yàn)，吸取上述三種溶液各4 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(20∶10∶1∶1)，展開，取出，晾干，噴以5%三氯化鐵乙醇溶液。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性樣品色譜在相應(yīng)位置無干擾，見圖2。

1.紫菀陰性樣品溶液 2.紫菀對照藥材

2.1.3 甘草的TLC鑒別 取“3.2.2”項(xiàng)下30%乙醇洗脫液，蒸至無醇味，放冷，加乙酸乙酯提取3次，每次20 ml，合并乙酸乙酯提取液，蒸干，殘?jiān)蛹状? ml使溶解，作為供試品溶液。另取甘草對照藥材0.2 g，加甲醇20 ml，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? ml使溶解，作為對照藥材溶液。按處方配比取處方藥材10 g(甘草除外)，按制法制得陰性樣品，再按照供試品溶液制備方法處理，作為陰性對照溶液。按照《中國藥典》2010年版一部TLC法試驗(yàn)，取上述供試品溶液4～10 μl、對照藥材溶液和陰性樣品溶液各4 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水(15∶1∶1∶2)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)；置紫外燈(365 nm)下檢視，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性樣品色譜在相應(yīng)位置無干擾，見圖3。

日光下

365 nm紫外光下

3 黃芪甲苷的測定

3.1 色譜條件 色譜柱：安捷倫ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm 5 μm)；流動(dòng)相為乙腈-水(36∶64)；柱溫為40 ℃：流速為0.8 ml/min。蒸發(fā)光散射檢測器，漂移管溫度100 ℃，氣體流速3.0 L/min。理論板數(shù)按黃芪甲苷峰計(jì)算應(yīng)不低于5 000。

3.2 溶液的制備

3.2.1 對照品溶液的制備 取黃芪甲苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 ml中含0.3 mg的溶液，即得。

3.2.2 供試品溶液的制備 取同一批號(5410022)樣品4 g，置燒杯中，精密稱定，加1%氫氧化鈉水溶液30 ml使溶解，加于已處理好的D101大孔樹脂柱上(內(nèi)徑1.5 cm，柱長20 cm)，用1%氫氧化鈉水溶液20 ml洗脫，再用水100 ml洗脫，繼用30%乙醇50 ml洗脫，最后用90%乙醇75 ml洗脫，收集90%乙醇洗脫液，減壓蒸至約1 ml，用50%甲醇定容至10 ml量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻，即得。

3.2.3 陰性樣品溶液的制備 按處方取除黃芪的各味藥材，按制法制得陰性樣品，再按“3.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法，制得陰性樣品溶液。

3.2.4 專屬性試驗(yàn) 分別精密吸取黃芪甲苷對照品溶液10和20 μl，供試品溶液和陰性對照溶液各20 μl，注入HPLC色譜儀，測定，結(jié)果陰性對照無干擾，見圖4。

3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取黃芪甲苷對照品適量，精密稱定，加甲醇分別制成濃度為每1 ml中含黃芪甲苷0.025 75、0.051 5、0.103 0、0.206 0、0.309 0、0.412 0、0.515 0和1.030 mg的對照品溶液，分別精密吸取20 μl，注入液相色譜儀，按“3.1”項(xiàng)下色譜條件分析，分別測定各自峰面積，以對照品進(jìn)樣的量(μg)的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，峰面積的對數(shù)值為縱坐標(biāo)，求得回歸方程：Y=5.398+1.638 4X(r=0.999 6)。結(jié)果表明黃芪甲苷在0.515～1.030 μg范圍內(nèi)線性良好。

1.黃芪甲苷

3.4 精密度試驗(yàn) 取同一批號(5410022)樣品4 g，精密稱定，按照“3.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備操作，按“3.1”項(xiàng)下色譜條件分析，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積，黃芪甲苷峰面積平均值為2 798 397.8，RSD為2.0%。

3.5 重現(xiàn)性試驗(yàn) 取同一批號(5410022)樣品適量，共6份，取4 g，按照“3.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備操作，按“3.1”項(xiàng)下色譜條件分析。結(jié)果樣品中黃芪甲苷平均含量為0.454 7 mg/g，RSD為1.5%。

3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取本品(批號5410022)樣品4 g，精密稱定，按照“3.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備操作，按“3.1”項(xiàng)下色譜條件分析。分別在0、2、4、8、12和18 h進(jìn)樣，測定，黃芪甲苷峰面積平均值為2 749 823.8，RSD為3.5%。

3.7 回收率試驗(yàn) 取黃芪甲苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 ml含黃芪甲苷0.091 6 mg的對照品溶液，精密量取10 ml，共6份，分別置圓底燒瓶中，減壓蒸干。取同一批號(5410022)樣品2 g，置上述圓底燒瓶中，精密稱定，按照“3.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備操作，制得供回收率用供試品溶液，按“3.1”項(xiàng)下色譜條件分析。計(jì)算回收率，結(jié)果黃芪甲苷平均回收率為102.39%，RSD為1.5%(n=6)。結(jié)果見表1。

3.8 樣品測定 取3個(gè)批號的樣品，按照“3.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備操作，按“3.1”項(xiàng)下色譜條件分析。結(jié)果見表2。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果

表2 3批樣品測定結(jié)果

4 討論

4.1 益肺清化膏原標(biāo)準(zhǔn)中黃芪甲苷的定量方法為薄層掃描法，前處理方法極為煩瑣，完成整個(gè)提取流程大約需要3 d的時(shí)間，為有效提高檢驗(yàn)的效率，現(xiàn)對原方法進(jìn)行修改，新起草的方法大約需要4～5 h即可完成樣品的提取工作，極大地節(jié)省了試劑和時(shí)間，提高了工作效率。

4.2 黃芪甲苷的測定方法通常采用正丁醇萃取后加堿性溶劑洗滌，再將正丁醇提取液蒸干后，用甲醇溶解定容測定的方法[1-3]。黃芪中的皂苷類成分在堿性環(huán)境和加熱的條件下，能夠轉(zhuǎn)化成黃芪甲苷，不能真實(shí)反應(yīng)樣品中黃芪的量[4-6]。本文采用大孔樹脂吸附的方法既簡化了步驟，又可以避免水解成分的產(chǎn)生，對控制藥品質(zhì)量有重要意義[7，8]。

4.3 提取方法的確定與考查

4.3.1 提取方式的考查 比較用 D101大孔樹脂和正丁醇提取兩種方法，結(jié)果正丁醇提取樣品中黃芪甲苷的量低于過D101大孔樹脂提取，因此采用過柱提取。

4.3.2 大孔樹脂柱相關(guān)參數(shù)的考查 對D101大孔樹脂柱的內(nèi)徑和柱長分別進(jìn)行考查，結(jié)果確定內(nèi)徑為1.5 cm，柱長20 cm，樣品中黃芪甲苷的量最高。

4.3.3 乙醇洗脫液濃度及體積的考查 經(jīng)試驗(yàn)洗脫除去雜質(zhì)時(shí)用30%乙醇50 ml效果最好；大孔樹脂柱中吸附的黃芪甲苷用70%的乙醇即可洗脫下來，但90%乙醇比70%乙醇更容易蒸干，因此將70%乙醇調(diào)整為90%。

4.3.4 氫氧化鈉溶液用量的考查 經(jīng)試驗(yàn)用1%氫氧化鈉水溶液30 ml可將樣品完全溶解，再加于已處理好的D101大孔樹脂柱上，繼用1%氫氧化鈉水溶液20 ml洗脫，可以減少氫氧化鈉的用量，同時(shí)除去大部分的雜質(zhì)干擾。

4.3.5 洗脫液流速的控制 用1%氫氧化鈉溶液上柱時(shí)，為保證樣品被充分吸附在大孔樹脂柱上，流速控制在1 ml/min左右；用水和30%乙醇洗脫時(shí)，速度可稍快，流速為2～3 ml/min。用90%乙醇洗脫時(shí)，流速為1 ml/min。

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2014-12-09

R927.11

A

1006-5687(2015)04-0010-04