應(yīng)用簡(jiǎn)便的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法檢測(cè)腮腺炎病毒核酸

李宏宇1，王爽2，周劍惠2，陳超2，季尚瑋3*

(1.吉林省腫瘤醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春130012；2.吉林省疾病預(yù)防控制中心；3.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院)

流行性腮腺炎(簡(jiǎn)稱(chēng)腮腺炎)是由腮腺炎病毒(Mumps Virus，MuV)感染引起的急性呼吸道傳染病，經(jīng)空氣飛沫傳播，全年均可發(fā)病,以冬春季高發(fā),人類(lèi)是該病毒的惟一宿主,好發(fā)于兒童和青少年，傳染性?xún)H次于麻疹和水痘，是一種在全球流行的急性傳染病,臨床以腮腺非化膿性腫脹、疼痛伴發(fā)熱為主要癥狀。2004-2006年我國(guó)的腮腺炎爆發(fā)占公共衛(wèi)生事件的20%左右[1，2]。目前對(duì)腮腺炎病毒的檢測(cè)分為病原學(xué)、血清學(xué)和分子生物學(xué)[3-6]。傳統(tǒng)的病原學(xué)和血清學(xué)診斷技術(shù)以及目前廣泛應(yīng)用的核酸診斷技術(shù)都有不同程度的欠缺。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展,逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法RT-LAMP技術(shù)的問(wèn)世[7]，使核酸檢測(cè)更加快速、便捷、特異。國(guó)內(nèi)已報(bào)道將該方法應(yīng)用于麻疹病毒及風(fēng)疹病毒核酸檢測(cè)[8，9]，本文應(yīng)用該方法進(jìn)行腮腺炎病毒的核酸檢測(cè)[10]，獲得滿意結(jié)果，現(xiàn)報(bào)告如下。

1材料與方法

1.1　腮腺炎病毒株

咽拭子經(jīng)組織培養(yǎng)后獲得腮腺炎病毒株。

1.2　試劑及儀器

RNA提取采用羅氏公司的自動(dòng)核酸提取儀及配套試劑盒進(jìn)行提取。RT-PCR： RNA酶抑制劑、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、DTT、BSA、TaqDNA聚合酶等RT-PCR所需試劑由日本TAKARA公司生產(chǎn)，PCR儀為ABI公司型號(hào)為9700。LAMP： Bst DNA polymerase以及AMV逆轉(zhuǎn)錄酶由New England Biolabs公司生產(chǎn)。

1.3　方法

1.3.1病毒分離咽拭子標(biāo)本接種在Vero/SLAM細(xì)胞(淋巴信號(hào)激活因子轉(zhuǎn)染的非洲綠猴腎細(xì)胞)上，36.5℃培養(yǎng)，當(dāng)CPE≥75%時(shí)收集細(xì)胞和培養(yǎng)液。如為陰性，連續(xù)觀察3代，每代7-9 d。

1.3.2核酸提取按操作程序及說(shuō)明書(shū)操作，提取后的RNA若不立即使用，可于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

參考文獻(xiàn)1.3.3RT-PCR引物序列、操作程序見(jiàn)[11]。

1.3.4LAMP的反應(yīng)體系和條件

(1)配置2倍濃度反應(yīng)液(1.0 ml)dNTP(10 mmol/L)0.28 ml,10×Bst Buffer 0.2 ml,MgSO4(0.1 mol/l)0.12 ml，Betain(4 mol/L)0.4 ml。

(2)配置引物混合液(120 μl)BIP(100 μmol/L)8 μl,FIP(100 μmol/L)8 μl,B3(100 μmol/L)1 μl,F3(100 μmol/L)1 μl,Bloop(100 μmol/L)4 μl,Floop(100 μmol/L)4 μl,DDW94 μl。

(3)反應(yīng)體系(25 μl)反應(yīng)混合液12.5 μl,引物混合液6 μl，BST(8 000 U/ml)1 μl,AMV(5 U/μl)0.1 μl,RNA5 μl,DDW0.4 μl。

(4)反應(yīng)條件將反應(yīng)體系于水浴鍋中63℃(±0.5℃)水浴1 h，得到LAMP產(chǎn)物。

1.4　LAMP引物序列及酶切位點(diǎn)

在LAMP反應(yīng)產(chǎn)物中，每形成一個(gè)啞鈴狀莖環(huán)結(jié)構(gòu)，都有腮腺炎病毒特異性酶切位點(diǎn)GTGCAC，因此使用內(nèi)切酶對(duì)LAMP產(chǎn)物進(jìn)行特異性酶切，電泳后根據(jù)是否獲得酶切后的單一條帶來(lái)證實(shí)腮腺炎病毒核酸。

1.5　LAMP產(chǎn)物酶切鑒定及電泳

酶切按10.5 μl體系進(jìn)行鑒定。取LAMP產(chǎn)物0.5 μl、ALw44 I 內(nèi)切酶1.0 μl、10×Buffer 1.0 μl以及DDW8 μl。對(duì)照管取LAMP產(chǎn)物0.5 μl、DDW 10 μl。37℃(±0.5℃)水浴1 h。使用1.7%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，觀察結(jié)果。

2結(jié)果

2.1　病毒分離結(jié)果

對(duì)23份咽拭子進(jìn)行病毒分離，均未觀察到CPE，需進(jìn)行病毒核酸檢測(cè)。

2.2　腮腺炎病毒LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物及其酶切鑒定結(jié)果

圖1所顯示的標(biāo)記為“1、2”的是腮腺炎病毒株，經(jīng)RT-PCR證實(shí)腮腺炎病毒核酸陽(yáng)性，經(jīng)LAMP方法擴(kuò)增、酶切、電泳后出現(xiàn)典型的LAMP梯狀條帶(圖1 A道 )，但經(jīng)特異的限制性?xún)?nèi)切酶ALw44 I酶切后只呈現(xiàn)出單一的條帶(圖1 B道)。

M：DL-2000 DNA分子量對(duì)照；1～2：腮腺炎病毒株；3：腮腺炎疫苗株；4：陰性對(duì)照A： LAMP 產(chǎn)物梯形圖譜； B：酶切后的LAMP單一條帶

圖1LAMP電泳條帶

2.3　腮腺炎病毒核酸RT-PCR與RT-LAMP檢測(cè)比較

因23份標(biāo)本的病毒分離均為陰性，故分別利用RT-LAMP和RT-PCR兩種方法進(jìn)行腮腺炎病毒核酸檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果一致，陽(yáng)性率均為30.4%(7/23)。

3討論

腮腺炎病毒感染的診斷主要依靠臨床診斷和實(shí)驗(yàn)室診斷。臨床診斷依據(jù)以是否觀察到腮腺腫大，而對(duì)于不典型腮腺炎患者仍需要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷。實(shí)驗(yàn)室診斷通常采用病毒分離和血清學(xué)檢測(cè)的方法，病毒分離的時(shí)效性依毒株效價(jià)的強(qiáng)弱，且并非全部觀察到CPE，故需進(jìn)行進(jìn)一步核酸鑒定；血清學(xué)通常以間隔28 d采集前后兩份血清，血清IgG抗體呈4倍(或4倍以上)增高的方法進(jìn)行鑒定，其耗時(shí)長(zhǎng)、且28 d后第二份標(biāo)本難采集；急性期腮腺炎患者亦可采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)血清中IgM，但即使腮腺腫大，3 d內(nèi)采集的血清IgM檢測(cè)仍存在陰性的可能[5]。目前RT-PCR 方法被廣泛應(yīng)用于腮腺炎病毒核酸檢測(cè)[3,5,6],其靈敏度高、特異性強(qiáng)，但該方法須使用PCR儀。Nakayama等建立了腮腺炎病毒核酸的LAMP檢測(cè)方法[10]，結(jié)合Mori等[12]研制出的專(zhuān)門(mén)用于LAMP產(chǎn)物檢測(cè)的實(shí)時(shí)監(jiān)控濁度儀對(duì)該方法進(jìn)行了敏感性和特異性證明。由于該濁度儀目前尚無(wú)法在國(guó)內(nèi)購(gòu)得，故本實(shí)驗(yàn)對(duì)LAMP產(chǎn)物采用酶切加電泳的方法，先用特異的限制性?xún)?nèi)切酶對(duì)LAMP產(chǎn)物進(jìn)行酶切，后根據(jù)酶切后的電泳條帶是否單一進(jìn)行鑒定，結(jié)果令人滿意。

RT-LAMP方法易操作，且敏感、特異，特別適用于基層單位進(jìn)行首發(fā)病例的快速診斷，該方法為腮腺炎病毒的快速檢測(cè)提供了一種新的手段。

[1]殷大鵬，樊春祥，曹玲生，等.中國(guó)2004-2006年流行性腮腺炎流行病學(xué)簡(jiǎn)析[J].疾病監(jiān)測(cè)，2007,22(5)：310.

[2]金奇.醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)[M].北京：科學(xué)出版社，2001:449-460.

[3]吳宏偉，崔愛(ài)麗，許松濤，等.一起流行性腮腺炎爆發(fā)的血清學(xué)診斷和基因型別鑒定[J].中國(guó)計(jì)劃免疫，2006,12(5)：399.

[4]卜麗薇，周景林，唐一清.流行性腮腺炎病毒微生物檢驗(yàn)方法的建立[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2009,19(10)：2322.

[5]嚴(yán)菊英，盧亦愚，姚亞萍.RT-PCR快速檢測(cè)腮腺炎病毒[J].中國(guó)公共衛(wèi)生，2003,19(3)：347.

[6]馮燕，盧亦愚，嚴(yán)菊英，等.流行性腮腺炎病毒熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)快速檢測(cè)方法的建立[J].中國(guó)計(jì)劃免疫，2006,12(5)：394.

[7] Notomi T,Okayama H,Masubuchi H,et al.Loop-mediated isothermal amplification of DNA[J].Nucleic Acids Res,2000,28(12):e63.

[8]周劍惠，侯祥，陳超,等.應(yīng)用簡(jiǎn)便逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法檢測(cè)麻疹病毒核酸[J].中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志,2008,22(6):403.

[9]王爽，周劍惠，侯祥，等.應(yīng)用簡(jiǎn)便的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法檢測(cè)風(fēng)疹病毒核酸[J].中國(guó)疫苗和免疫，2009，15(6)：518.

[10]Takao Okafuji,Naoko Yoshida,Motoko Fujino,et al.Rapid Diagnostic Method for Detection of Mumps Virus Genome by Loop-Mediated Isothermal Amplification[J].Journal of Clinical Microbiology,2005,43(4):1625.

[11]王爽，常新，周劍惠，等.吉林省首次分離的流行性腮腺炎野病毒及基因型鑒定[J].中國(guó)疫苗與免疫，2009,15(5):432.

[12]Mori Y,Kitao M,Tomita N,et al.Real-time turbidimetry of LAMP reaction for quantifying template DNA[J].J Biochem Biophys Methods,2004,59(1):145.

收稿日期：(2013-12-25)

文章編號(hào)：1007-4287(2015)04-0555-02

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