李亞平，孫　月，夏美慧，馬麗偉，謝　奇，駱偉麟，于慧美*

(1.吉林省人民醫(yī)院 皮膚科，吉林 長(zhǎng)春130021；2.吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；3.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 婦產(chǎn)科)

二甲雙胍在不同葡萄糖濃度下對(duì)小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16增殖的影響

李亞平1，孫月2，夏美慧3，馬麗偉2，謝奇2，駱偉麟2，于慧美2*

(1.吉林省人民醫(yī)院 皮膚科，吉林 長(zhǎng)春130021；2.吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；3.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 婦產(chǎn)科)

(ChinJLabDiagn,2015,19:0536)

黑色素瘤常見(jiàn)于中老年人，男性多發(fā)于女性，常見(jiàn)于下肢、足部、軀干、頭頸部和上肢，癥狀主要表現(xiàn)為迅速增大的黑色素結(jié)節(jié)[1]。近年來(lái)，腫瘤與代謝性疾病之間的關(guān)系逐漸成為研究的熱點(diǎn)。二甲雙胍是臨床廣泛應(yīng)用的降糖藥物，用于II型糖尿病的治療，其降血糖效果和安全性得到普遍認(rèn)可[2]。近年來(lái)的研究認(rèn)為，該藥物在調(diào)節(jié)機(jī)體糖類(lèi)代謝的同時(shí)，還具有一定程度的抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。研究顯示，體內(nèi)胰島素水平能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)并影響腫瘤的預(yù)后，而二甲雙胍與其他降糖藥相比更能降低糖尿病患者腫瘤的發(fā)生率[3]。目前，關(guān)于二甲雙胍與腫瘤的研究多針對(duì)于肺癌等，且機(jī)制尚未明確[3,4]。缺乏關(guān)于二甲雙胍及葡萄糖缺乏對(duì)黑色素瘤的研究。本研究通過(guò)分析二甲雙胍在不同糖條件下對(duì)小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16形態(tài)、細(xì)胞生存率、凋亡及線粒體膜電位的影響，為今后的研究提供一定的理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1　試劑與細(xì)胞

小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所，胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Clark公司，RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Uibco公司，MTT購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，Hoechst33342染料購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所，Annexin V-PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物公司。B16細(xì)胞株用含10%新生牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液在37℃，5% CO2的孵箱內(nèi)孵育培養(yǎng)，以0.4 %胰酶消化傳代，隔2 d傳代1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞分組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2　方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組細(xì)胞隨機(jī)分組，分別加入不同濃度的葡萄糖(25 mM、4 mM、3 mM、2 mM、1 mM)，分別選擇葡萄糖高劑量組(25 mM)合加二甲雙胍(0、10 mM、20 mM、40 mM)，葡萄糖低劑量組(1 mM)合加二甲雙胍(0、10 mM、20 mM、40 mM)。

1.2.2MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率B16細(xì)胞消化離心后，按1×104個(gè)/孔接種于96孔板，37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20-24 h，使細(xì)胞達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。待細(xì)胞融合度達(dá)到80%左右，設(shè)立對(duì)照組以及不同濃度葡萄糖及二甲雙胍組，每個(gè)濃度6個(gè)重復(fù)孔，CO2培養(yǎng)箱中作用24 h后每孔加入20 μl MTT，繼續(xù)孵育4 h，棄掉孔板中的培養(yǎng)液，每孔加150 μl二甲基亞礬(DMSO)，孔板振蕩器振蕩15 min，充分溶解結(jié)晶物。在BIO TEK酶標(biāo)儀上，選擇490 nm波長(zhǎng)，測(cè)定96孔板各孔光吸收值，記錄結(jié)果，計(jì)算細(xì)胞存活率。對(duì)照組細(xì)胞存活率為100%，其余各組存活率=(各濃度組A值/對(duì)照組A值)×100%。

1.2.3Annexin V-PI檢測(cè)細(xì)胞凋亡率B16細(xì)胞按1×107個(gè)/孔接種于培養(yǎng)瓶中，置于37℃，5% CO2的恒溫二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20-24 h。待細(xì)胞達(dá)到80%左右融合時(shí)，加入不同濃度葡萄糖及二甲雙胍，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。棄掉培養(yǎng)液，PBS洗滌2-3次，按凱基Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，先加入Annexin V，混勻后再加入PI，混勻后，利用流式細(xì)胞儀分析各組細(xì)胞的凋亡率。

1.2.4Western blot檢測(cè)Cyt C表達(dá)水平蛋白濃度按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。酶標(biāo)儀測(cè)量630 nm不同孔OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線從而計(jì)算出各組樣本蛋白濃度。利用加樣器向加樣孔中緩慢加入蛋白樣本。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后將PVDF膜放入5%脫脂奶粉中封閉1-2 h。封閉結(jié)束后用PEST洗PVDF膜3次，每次5 min，倒掉PEST將PVDF膜放人自封袋中加入Cyt C一抗，4℃冰箱中過(guò)夜?；厥找豢?，PEST洗膜3次，加入二抗(1∶1 000比例)，室溫1 h?；厥斩?，PEST洗膜3次，DAB顯色液顯色，當(dāng)看到目標(biāo)帶后將膜放人蒸餾水內(nèi)中止顯色。拍照后封存，灰度值掃描分析。

1.3　統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析采用SPSS16.0版統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。

2結(jié)果

2.1　葡萄糖對(duì)B16細(xì)胞存活率的影響

B16細(xì)胞接種于96孔板后培養(yǎng)過(guò)夜，加入含有不同濃度葡萄糖的1640培養(yǎng)液及血清繼續(xù)培養(yǎng)24 h，采用MTT法檢測(cè)不同濃度葡萄糖對(duì)B16細(xì)胞存活率的影響。與對(duì)照組(25 mM)相比，葡萄糖濃度4 mM、3 mM、2 mM、1 mM時(shí)細(xì)胞生存率分別為(74.57±2.52)%、(63.29±4.36)%、(61.61±2.33)%和(56.54±1.56)%，均隨著葡萄糖濃度的降低而降低，且呈劑量依賴(lài)性(圖1)。

2.2　葡萄糖對(duì)B16細(xì)胞形態(tài)的影響

利用倒置顯微鏡觀察不同葡萄糖濃度對(duì)B16細(xì)胞形態(tài)的影響。顯微鏡下可以觀察到，在25 mM葡萄糖濃度下，B16細(xì)胞形態(tài)飽滿，呈多角形，隨著葡萄糖濃度的降低，細(xì)胞形態(tài)逐漸變的皺縮細(xì)長(zhǎng)，尤其是在1 mM葡萄糖條件下，與25 mM葡萄糖相比，視野中細(xì)胞數(shù)量顯著減少，細(xì)胞變小，形狀更加細(xì)長(zhǎng)(圖2)。

2.3　二甲雙胍在不同葡萄糖濃度下對(duì)B16細(xì)胞存活率的影響

分別采用25 mM和1 mM葡萄糖與不同濃度二甲雙胍聯(lián)合作用B16細(xì)胞24 h，比較不同葡萄糖條件下二甲雙胍對(duì)B16細(xì)胞存活率的影響。MTT結(jié)果顯示，不同葡萄糖條件下，二甲雙胍都能抑制B16細(xì)胞的增殖率(圖3)。

圖1不同葡萄糖濃度對(duì)小鼠黑色素瘤

細(xì)胞B16生存率的影響

A:25 mM葡萄糖B:4 mM葡萄糖C:2 mM葡萄糖D:1 mM葡萄糖

圖2不同葡萄糖濃度對(duì)小鼠黑色素瘤

細(xì)胞B16形態(tài)的影響

圖3　不同二甲雙胍濃度對(duì)小鼠黑色素瘤

2.4　二甲雙胍在不同葡萄糖濃度下對(duì)B16細(xì)胞凋亡的影響

分別采用25 mM及1 mM葡萄糖聯(lián)合10 mM二甲雙胍作用細(xì)胞24 h，Annexin V-PI 檢測(cè)B16細(xì)胞細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組即25 mM葡萄糖組(2.62±2.89)%相比，1 mM葡萄糖組細(xì)胞凋亡率為(44.15±2.29)%，25 mM葡萄糖+10 mM二甲雙胍組細(xì)胞凋亡率為(22.18±3.72)%，1 mM葡萄糖+10 mM二甲雙胍凋亡率為(61.54±2.84)%,凋亡率最高(圖4)。

圖4　Annexin V-PI 檢測(cè)觀察B16細(xì)胞凋亡率

2.5　二甲雙胍在不同葡萄糖濃度下對(duì)B16細(xì)胞Cyt C表達(dá)的影響

分別采用25 mM及1 mM葡萄糖聯(lián)合10 mM二甲雙胍作用細(xì)胞24 h，Western blot方法檢測(cè)B16細(xì)胞Cyt C的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與對(duì)照組即25 mM葡萄糖組相比，1 mM葡萄糖組Cyt C表達(dá)水平略有上調(diào)。25 mM葡萄糖+10 mM二甲雙胍組Cyt C無(wú)明顯變化，1 mM葡萄糖+10 mM二甲雙胍組Cyt C表達(dá)水平顯著上調(diào)(圖5)。

3討論

黑色素瘤是由異常黑素細(xì)胞過(guò)度增生引發(fā)的常見(jiàn)的皮膚腫瘤，惡性程度非常高，是皮膚腫瘤致死的主要原因之一[5]。主要多發(fā)生于皮膚或接近皮膚的黏膜，其發(fā)病率隨人種、地域、種族的不同而有所差異，白種人的發(fā)病率遠(yuǎn)較黑種人高[6]，我國(guó)雖屬黑色素瘤的低發(fā)區(qū)，但近年來(lái)發(fā)病率卻呈不斷上升趨勢(shì)，逐漸引起醫(yī)療工作者的關(guān)注[7]。本研究首先探討了葡萄糖對(duì)B16細(xì)胞生存率的影響。研究結(jié)果顯示葡萄糖能夠抑制B16細(xì)胞的增殖，并呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性，隨著葡萄糖濃度的降低，B16細(xì)胞增殖率顯著降低。這說(shuō)明葡萄糖是B16細(xì)胞生存所必需。這為從糖饑餓角度治療黑色素瘤提供理論基礎(chǔ)。

圖5　Western blot檢測(cè)B16細(xì)胞Cyt C表達(dá)水平

二甲雙胍作為經(jīng)典的治療糖尿病的藥物，其在臨床上的應(yīng)用價(jià)值正不斷得到發(fā)掘。近年來(lái)，研究者發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍除了能夠改善2型糖尿病患者的血糖控制外，還潛在地降低某些癌癥發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，并有可能改善某些合并癌癥2型糖尿病患者的預(yù)后。越來(lái)越多從流行病學(xué)到臨床研究等方面為二甲雙胍的抗腫瘤作用提供證據(jù)。其可能的抗腫瘤作用機(jī)制包括以下方面：①改善高血糖和高胰島素血癥狀態(tài)[8]；②抑制細(xì)胞線粒體的電子轉(zhuǎn)移，抑制氧化磷酸化，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[9]；③激活A(yù)MP 激活蛋白激酶(AMPK)，抑制哺乳動(dòng)物的雷帕霉素靶蛋白(mTOR)[10]。④通過(guò)抑制CyclinD1表達(dá)而糾正AGEs 誘導(dǎo)的細(xì)胞周期紊亂[11]。本研究結(jié)果顯示，無(wú)論在正常葡萄糖濃度(25 mM)還是低糖(1 mM)濃度下，二甲雙胍均可以顯著抑制B16細(xì)胞增殖率，這可能是由于二甲雙胍抑制了B16細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取。

線粒體細(xì)胞色素C具有調(diào)控細(xì)胞能量代謝和凋亡的雙重功能，它既通過(guò)對(duì)細(xì)胞能量代謝的調(diào)節(jié)，

調(diào)控細(xì)胞死亡方式；又能通過(guò)對(duì)凋亡信號(hào)的傳導(dǎo)和放大作用，直接介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示無(wú)論是低糖條件還是聯(lián)合二甲雙胍均能促進(jìn)Cyt C的表達(dá)，這也從另一方面提示二甲雙胍可能通過(guò)抑制葡萄糖吸收在調(diào)控細(xì)胞能量代謝過(guò)程中發(fā)揮作用。

綜合以上結(jié)果顯示，二甲雙胍在不同葡萄糖濃度下通過(guò)細(xì)胞凋亡的方式引起小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16生存率下降，而二甲雙胍可能通過(guò)抑制葡萄糖攝取，促進(jìn)細(xì)胞線粒體細(xì)胞色素C釋放引起細(xì)胞凋亡，這為從糖攝取及能量代謝方面治療黑色素瘤提供實(shí)驗(yàn)與理論依據(jù)。

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摘要：目的研究二甲雙胍在不同葡萄糖濃度下對(duì)小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16增殖的影響并初步探討其可能機(jī)制。方法體外培養(yǎng)小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16，采用不同糖濃度和二甲雙胍濃度作用，光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，MTT法檢測(cè)細(xì)胞生存率， 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，Western blot檢測(cè)Cyt C表達(dá)。結(jié)果與對(duì)照組相比，隨著糖濃度的降低，B16細(xì)胞形態(tài)變的皺縮細(xì)長(zhǎng)，細(xì)胞生存率逐漸降低并呈濃度劑量依賴(lài)性。在正常糖濃度和低糖濃度下，二甲雙胍均能抑制細(xì)胞生存率，隨著二甲雙胍濃度的增高，細(xì)胞凋亡率顯著增加，Cyt C表達(dá)水平增高。結(jié)論葡萄糖是小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16細(xì)胞生存所必需條件之一，二甲雙胍在不同糖條件下均能顯著抑制B16細(xì)胞的生長(zhǎng)，可能通過(guò)改變線粒體穩(wěn)定性促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

關(guān)鍵詞：二甲雙胍；葡萄糖；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡

Effect of Metformin and Glucose on the proliferation in mouse melanoma B16 cellsLIYa-ping,SUNYue,XIAMei-hui,etal.(People′sHospitalofJilinProvince,Changchun130021,China)

Abstract:ObjectiveTo study the effect of Metformin and Glucose on the proliferation in mouse melanoma B16 cells and discuss its functional mechanism.MethodsB16 cells were cultured with different concentration of metformin and glucose in vitro.Cells morphology,viability,apoptosis and the expression of Cyt C protein were evaluated by light microscopy,MTT assay,flow cytometry and western blot respectively.ResultsCompared with the control group,morphology of B16 cells became wrinkled elongated,and the cell viability decreased in a concentration dose-dependent manner with the decrease of sugar concentration.Under normal glucose concentration and sugar concentration,metformin inhibited cell survival,significantly increased apoptosis rate,increased expression level of Cyt C.ConclusionGlucose is necessary for cell survival conditions of mouse melanoma B16 cells,metformin could significantly inhibit the growth of B16 cells and promote apoptosis by altering mitochondria under different sugar conditions.

Key words:Metformin；Glucose；Cell proliferation；Cell apoptosis

收稿日期：(2014-06-20)

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

中圖分類(lèi)號(hào)：R739.5

文章編號(hào)：1007-4287(2015)04-0536-04

通訊作者*

基金項(xiàng)目：吉林省衛(wèi)生廳課題(20122Z126) ；中國(guó)博士后基金(2013M540256)；吉林省科技廳青年基金(20140520018JH)