湯　菲，王縛鯤，安黎云，賈克然

(解放軍白求恩國際和平醫(yī)院 檢驗科，河北 石家莊050082)

支氣管哮喘患者誘導(dǎo)痰炎性細(xì)胞中Tim-3 mRNA的表達(dá)及作用機(jī)制研究

湯菲，王縛鯤，安黎云，賈克然

(解放軍白求恩國際和平醫(yī)院 檢驗科，河北 石家莊050082)

(ChinJLabDiagn,2015,19:0578)

支氣管哮喘作為呼吸道常見的慢性疾病，是一種由多種炎性細(xì)胞參與的氣道慢性變應(yīng)性炎癥性疾病，其發(fā)病率呈逐漸升高的趨勢，嚴(yán)重地影響患者的健康。T細(xì)胞免疫球蛋白及黏蛋白域蛋白3(Tim-3)作為Tim基因家族的成員，是一種T細(xì)胞功能相關(guān)的表面分子，可在Th1細(xì)胞表面選擇性地表達(dá)的同時參與Th2的免疫應(yīng)答反應(yīng)而增加IFN-γ水平，以緩解病情[1]。本研究通過逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(RT-PCR)檢測支氣管哮喘患者誘導(dǎo)痰炎性細(xì)胞中的Tim-3 mRNA水平，并分析其與IL-4及IFN-γ的關(guān)系，從而探討在支氣管哮喘的發(fā)生發(fā)展中Tim-3的作用。

1資料與方法

1.1　一般資料

選擇2012年5月-2013年8月我院呼吸門診收治的81例支氣管哮喘患者為研究對象，按照病情進(jìn)展將其分為哮喘緩解組和哮喘發(fā)作組，其中哮喘緩解組36例，男21例，女15例；年齡21-65歲，平均(36.4±15.2)歲，病程3個月-13年，平均(3.5±1.2)年；哮喘發(fā)作組(包括輕度至中度急性發(fā)作期)45例，男26例，女19例；年齡20-67歲，平均(37.3±14.9)歲，病程2個月-14年，平均(3.9±1.0)年。納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者符合中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)分會哮喘學(xué)組關(guān)于支氣管哮喘的診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]；②患者不合并有其他肺部疾病如肺炎等；③患者在試驗前的1個月內(nèi)沒有出現(xiàn)上呼吸道的感染癥狀；④患者近半年內(nèi)無肌注糖皮質(zhì)激素史；⑤符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)要求；⑥患者及家屬知情同意，并簽署知情同意書者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①孕產(chǎn)婦、哺乳期婦女；②合并有心功能不全者；③合并有肝、腎功能障礙者；④有吸煙史的患者。同期隨機(jī)抽取120例來我院體檢的健康體檢者為對照組，其中男72例，女48例，年齡22-69歲，平均(36.9±14.8)歲。三組對象基線資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2　支氣管哮喘誘導(dǎo)痰的收集及處理

誘導(dǎo)痰的收集：在收集誘導(dǎo)痰之前，采用超聲霧化器對試驗對象霧化15 min，霧化劑選擇濃度為3%的高滲鹽水；然后試驗對象用清水漱口并將唾液完全吐出，直到咳出痰液為止，收集痰液至消毒平皿中。如果痰液量不足，則采用濃度為4%的高滲鹽水進(jìn)行霧化直到收集到適量的痰液。最后將收集的痰液置于4℃環(huán)境下保存，以備處理。誘導(dǎo)痰的處理：根據(jù)收集到痰液的質(zhì)量，將透明且密度較高的痰液部分放入到事先準(zhǔn)備好的已經(jīng)稱重的EP試管中進(jìn)行稱重，同時在試管中加入4倍體積、濃度為0.1%二流蘇糖醇(DTT)，振蕩10 min，從而使痰液和DTT充分混合，搖勻后將其置于37℃水浴中10分鐘，然后通過200目篩網(wǎng)過濾掉雜質(zhì)部分，最后采用血細(xì)胞計數(shù)盤計算細(xì)胞的總數(shù)量。誘導(dǎo)痰以2 500 r/min轉(zhuǎn)速離心10分鐘后，將上清液置于-80℃的冰箱中保存以待后用。沉淀的細(xì)胞通過RT-PCR技術(shù)檢測誘導(dǎo)痰炎性細(xì)胞中Tim-3 mRNA的水平。

1.3　采用 RT-PCR技術(shù)檢測Tim-3 mRNA水平

根據(jù)說明書，采用Trizol法提取炎性細(xì)胞中的總RNA，然后在逆轉(zhuǎn)錄的作用下合成cRNA(逆轉(zhuǎn)錄試劑盒由Promega公司提供)，最后通過PCR技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物(PCR試劑盒由天根生化科技有限公司提供)，并將擴(kuò)增的產(chǎn)物置于-80℃條件下保存以待后用。PCR引物序列由Premier Primer 5.0 引物設(shè)計軟件設(shè)計得到，Tim-3引物序列：上游5’-AATTGAACTGGGACCTGCAC-3’,下游5’-CTTTCACCTCAGCACCCAGT-3’，產(chǎn)物的大小為233 bp， 退火溫度為68℃，其中Tim-3 的內(nèi)參照為甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)。擴(kuò)增的條件設(shè)定為：95℃下預(yù)變性3分鐘，95℃下變性10秒，同時退火延伸10秒，再重復(fù)40個循環(huán)。每份標(biāo)本均通過PT-PCR技術(shù)采用GAPDH和Tim-3 的引物來進(jìn)行熒光定量分析，重復(fù)3次后取平均值。

1.4　酶聯(lián)免疫測定法(ELISA)測定IL-4、IFN-γ

將收集的痰上清液采用ELISA嚴(yán)格按照說明書檢測各組的IL-4、IFN-γ(深圳達(dá)科為生物工程有限公司提供ELISA試劑盒)。

1.5　肺通氣功能檢查

試驗對象在安靜的環(huán)境下休息30分鐘后，采用肺功能測定儀分別測量各組對象的1s用力呼氣容積(FEV1)、用力肺活量(FVC)和FEV1/FVC×100%。

1.6　統(tǒng)計學(xué)處理

2結(jié)果

2.1　三組對象肺通氣功能及Tim-3 mRNA水平比較

三組對象的FEV1、FVC和FEV1/FVC水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，兩兩比較，哮喘發(fā)作組和哮喘緩解組的FEV1、FVC和FEV1/FVC水平均低于對照組，哮喘發(fā)作組低于哮喘緩解組；三組對象的Tim-3mRNA水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，哮喘發(fā)作組、哮喘緩解組的Tim-3mRNA水平高于對照組，且哮喘發(fā)作組高于哮喘緩解組,見表1。

組別nFEV1(L)FVC(L)FEV1/FVC(%)Tim-3哮喘緩解組363.51±0.65Δ4.15±0.49Δ76.15±3.17Δ0.25±0.02Δ哮喘發(fā)作組452.60±0.59Δ※3.38±0.51Δ※64.82±3.05Δ※0.39±0.04Δ※對照組1204.02±0.614.73±0.5187.33±2.940.11±0.02F值8.6329.18512.1878.571P值0.0340.0290.0010.036

注：Δ表示與健康對照組比較，P<0.05，※表示與哮喘緩解組比較，P<0.05。

2.2　三組對象痰上清液中IL-4、IFN-γ水平比較

三組對象的IL-4、IFN-γ水平經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；兩兩比較，哮喘發(fā)作組和哮喘緩解組的IL-4水平高于對照組，哮喘發(fā)作組高于哮喘緩解組，并且哮喘發(fā)作組和哮喘緩解組的IFN-γ水平低于對照組，哮喘發(fā)作組低于哮喘緩解組，見表2。

2.3　Tim-3 mRNA與IL-4、IFN-γ及FEV1/FVC的相關(guān)性分析

哮喘緩解組的Tim-3 mRNA與IL-4具有正相關(guān)關(guān)系(r=0.71，P<0.05)，與IFN-γ和FEV1/FVC有負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.86、-0.81，P<0.05)；哮喘發(fā)作組的Tim-3 mRNA與IL-4有正相關(guān)關(guān)系(r=0.65，P<0.05)，與IFN-γ和FEV1/FVC有負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.77、-0.78，P<0.05)，見表3、表4。

表2　三組對象誘導(dǎo)痰的上清液中IL-4、IFN-γ水平

注：※與健康對照組比較，P<0.05，Δ與哮喘緩解組比較，P<0.05。

表3　哮喘緩解組Tim-3 mRNA與IL-4、IFN-γ

表4　哮喘發(fā)作組Tim-3 mRNA與IL-4、IFN-γ

3討論

支氣管哮喘作為臨床常見的氣道慢性炎癥性疾病，主要是在炎性細(xì)胞如嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞以及氣道結(jié)構(gòu)細(xì)胞如氣道平滑肌細(xì)胞和細(xì)胞組分等的參與下發(fā)生[3]?，F(xiàn)有的病理生理學(xué)機(jī)制認(rèn)為，支氣管哮喘的發(fā)生主要與Th1和Th2細(xì)胞亞群的功能失衡有關(guān)，支氣管哮喘的免疫反應(yīng)主要以Th2型應(yīng)答為主。目前相關(guān)的研究表明，增強(qiáng)Th1細(xì)胞的分化功能可以有效地抑制支氣管哮喘以及其他相關(guān)的變態(tài)反應(yīng)性疾病的進(jìn)程，而增強(qiáng)Th2細(xì)胞的分化功能則可以抑制自身免疫性疾病的進(jìn)展[4]。因此，通過調(diào)節(jié)Th1和Th2細(xì)胞表面分子中免疫調(diào)節(jié)治療的靶分子可以改善Th1/Th2的失衡狀態(tài)，使其恢復(fù)平衡[5]。Tim-3 是Tim家族中新近發(fā)現(xiàn)的一種與T細(xì)胞功能有關(guān)的表面分子，它可以在小鼠體內(nèi)的Th1中優(yōu)先表達(dá)，并且Tim-3和配體通過作用可以負(fù)調(diào)節(jié)Th1細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答[6]。因此，臨床上可通過Tim-3抗體來阻斷Tim-3的表達(dá)，增強(qiáng)Th1的免疫應(yīng)答反應(yīng)來抑制Th2的表達(dá)，并最終控制相關(guān)疾病的發(fā)生及發(fā)展。誘導(dǎo)痰作為一種安全、有效且重復(fù)性較好的實(shí)驗標(biāo)本，通過檢測誘導(dǎo)痰中炎性細(xì)胞的計數(shù)可以準(zhǔn)確地反映氣道的炎癥性反應(yīng)。

Th1/Th2細(xì)胞的功能失衡導(dǎo)致支氣管哮喘的發(fā)生，但是關(guān)于Tim-3在支氣管哮喘患者Th1/Th2細(xì)胞失衡中的機(jī)制相關(guān)的研究還較少。本研究顯示，哮喘發(fā)作組、哮喘緩解組的FEV1、FVC和FEV1/FVC均低于對照組，并且哮喘發(fā)作組低于哮喘緩解組，說明支氣管哮喘患者存在不同程度的氣道阻塞，與有關(guān)研究結(jié)果一致[7]。結(jié)果還顯示，哮喘發(fā)作組和哮喘緩解組的Tim-3/β-actin高于對照組，并且哮喘發(fā)作組高于哮喘緩解組，說明Tim-3 在哮喘發(fā)作期具有一定的作用，提示我們可通過檢測Tim-3來預(yù)測疾病的發(fā)生及發(fā)展過程。

有研究表明，通過檢測IFN-γ和IL-4的變化可以有效的反映Th1/Th2的免疫應(yīng)答狀態(tài)[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，哮喘發(fā)作組、哮喘緩解組的IFN-γ水平低于對照組，且哮喘發(fā)作組低于哮喘緩解組，哮喘發(fā)作組和哮喘緩解組的IL-4水平高于對照組，且哮喘發(fā)作組高于哮喘緩解組，說明支氣管哮喘患者中Th2細(xì)胞因子表達(dá)增強(qiáng)，而Th1細(xì)胞因子表達(dá)相對減弱，Th1/Th2細(xì)胞免疫失衡，與有關(guān)研究結(jié)果一致[9]。本研究通過分析Tim-3 mRNA與IL-4、IFN-γ和FEV1/FVC的相關(guān)關(guān)系發(fā)現(xiàn)，哮喘發(fā)作組和哮喘緩解組的Tim-3 mRNA與IL-4成正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.71、0.65，與IFN-γ成負(fù)相關(guān)，r分別為-0.86、-0.77，與FEV1/FVC成負(fù)相關(guān)，r分別為-0.77，-0.78。結(jié)果提示，我們通過檢測Tim-3可以反映支氣管哮喘的嚴(yán)重程度，在臨床有重要的參考意義。

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摘要：目的探討支氣管哮喘患者誘導(dǎo)痰炎性細(xì)胞中Tim-3 mRNA的表達(dá)及作用機(jī)制，并分析其與上清液中IL-4、IFN-γ和肺功能指標(biāo)的相關(guān)性。方法將2012年5月-2013年8月我院收治的支氣管哮喘患者分為哮喘緩解組和哮喘發(fā)作組，并于同期隨機(jī)選取120例健康體檢者為對照組，通過逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(RT-PCR)檢測三組的誘導(dǎo)痰炎性細(xì)胞中Tim-3 mRNA的水平，同時采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測上清液中IL-4、IFN-γ，分析其與Tim-3 mRNA的相關(guān)性。結(jié)果哮喘發(fā)作組、哮喘緩解組FEV1、FVC、FEV1/FVC低于對照組，哮喘發(fā)作組低于哮喘緩解組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，哮喘發(fā)作組、哮喘緩解組的Tim-3/β-actin水平高于健康對照組，且哮喘發(fā)作組高于哮喘緩解組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；哮喘發(fā)作組、哮喘緩解組IL-4高于健康對照組，哮喘發(fā)作組高于哮喘緩解組，哮喘發(fā)作組、哮喘緩解組IFN-γ低于健康對照組，哮喘發(fā)作組低于哮喘緩解組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；哮喘緩解組Tim-3 mRNA與IL-4有正相關(guān)關(guān)系(r=0.71，P<0.05)，與IFN-γ和FEV1/FVC有負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.86、-0.81，P<0.05)，哮喘發(fā)作組Tim-3 mRNA與IL-4有正相關(guān)關(guān)系(r=0.65，P<0.05)，與IFN-γ和FEV1/FVC有負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.77、-0.78，P<0.05)。結(jié)論通過檢測Tim-3 mRNA水平可以有效評估支氣管哮喘的發(fā)生與發(fā)展，臨床有重要參考價值。

關(guān)鍵詞：支氣管哮喘；誘導(dǎo)痰；炎性細(xì)胞；Tim-3 mRNA

Expression and mechanism of Tim-3 mRNA of inflammatory cells in induced sputum of patients with bronchial asthmaTANGFei，WANGFu-kun，ANLi-yun，etal.(Departmentofclinicallaboratory,Thepeople'sLiberationArmyHepingHospitalBethuneInternational,Shijiazhuang050082,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the expression and mechanism of inflammatory cells in induced sputum of patients with bronchial asthma and the correlation between IL-4 and IFN-γ in supernatant.MethodsThe patients with bronchial asthma in our hospital from 2012 May to 2013 August were divide into asthma remission group and asthma group,and 120 of health volunteers as control group were randomly selected in the same period.The Tim-3 mRNA of inflammatory cells in induced sputum was detected by RT-PCR,and the IL-4、IFN-γ were detected by ELISA,and the correlation was analyzed.ResultsThe FEV1、FVC、FEV1/FVC of asthmatic group and asthma remission group were lower than those of control group when its were lower than those in asthma remission group,the difference was statistically significant(P<0.05),Tim-3/β-actin of asthmatic group and asthma remission group were higher than that of control group when it was higher than that in asthma remission group,the difference was statistically significant(P<0.05);The IL-4 of asthmatic group and asthma remission group were higher than those of control group when its were higher than those in asthma remission group,The IFN-γ of asthmatic group and asthma remission group was lower than that of control group when it was lower than that in asthma remission group,the difference was statistically significant(P<0.05);There was a positive correlation between Tim-3 mRNA and IL-4(r=0.71，P<0.05) in asthma remission group when a negative correlative with IFN-γ and FEV1/FVC(r=-0.86、-0.81，P<0.05)，and there was a positive correlation between Tim-3 mRNA and IL-4(r=0.65，P<0.05) in asthmatic group when a negative correlative with IFN-γ and FEV1/FVC(r=-0.77、-0.78，P<0.05).ConclusionDetecting Tim-3 mRNA can effectively evaluate the occurrence and development of bronchial asthma,and it has an important reference value in clinical.

Key words:Bronchial asthma;Induced sputum;Inflammatory cells;Tim-3 mRNA

收稿日期：(2014-03-27)

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

中圖分類號：R562.2+5

文章編號：1007-4287(2015)04-0578-04