夏 青 姚 蘭,2 張宏偉 楊海濤,2,*

(1.湖北工業(yè)大學(xué)輕工學(xué)部制漿造紙工程學(xué)院,湖北武漢,430068；2.綠色輕工材料湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北武漢,430068；3.武漢聯(lián)合工程顧問咨詢有限公司,湖北武漢,430071)

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硫酸鹽漿酶解液中LCC的提取及性質(zhì)研究

夏 青1姚 蘭1,2張宏偉3楊海濤1,2,*

(1.湖北工業(yè)大學(xué)輕工學(xué)部制漿造紙工程學(xué)院,湖北武漢,430068；2.綠色輕工材料湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北武漢,430068；3.武漢聯(lián)合工程顧問咨詢有限公司,湖北武漢,430071)

為了探究硫酸鹽漿在酶解過程中是否有小分子LCC溶出及其性質(zhì),以麥草為原料，通過硫酸鹽法制漿得到硫酸鹽麥草漿,并依次進(jìn)行聚木糖酶、纖維素酶酶解。利用凝膠滲透色譜柱分離出酶解液中的小分子LCC,然后對(duì)LCC進(jìn)行FT-IR、2D-HSQC(二維異核單量子碳?xì)湎嚓P(guān))核磁共振分析。結(jié)果表明,從麥草漿聚木糖酶酶解液(XHL)中可分離出小分子LCC,但在纖維素酶酶解液(CHL)中只存在纖維素；2D-HSQC分析表明,從XHL中分離得到的小分子LCC主要是聚木糖和木素通過苯基配糖體鍵、苯甲醚鍵和γ-酯鍵連接在一起的,說明聚木糖酶能同時(shí)對(duì)紙漿中殘余的聚木糖和木素與聚木糖之間的化學(xué)連接鍵進(jìn)行降解。

麥草漿；聚木糖酶；纖維素酶；2D-HSQC

硫酸鹽法制漿是一種常用的制漿方法,通常是在高溫下加入氫氧化鈉和硫化鈉以去除和降解原料中的木素,但硫酸鹽法制漿后會(huì)有部分木素殘留在紙漿中[1- 4]。大量理論研究[5- 6]表明,植物中木素與部分碳水化合物通過化學(xué)鍵相結(jié)合并以木素-碳水化合物復(fù)合體(Lignin-Carbohydrate Complexes,LCC)的形式存在于植物纖維的細(xì)胞壁中。LCC的存在是木素?zé)o法被完全脫除的主要原因。

為了探究硫酸鹽漿殘余木素的性質(zhì),需要對(duì)木素進(jìn)行提取,最常用的提取方法是酶解法。通過該方法可以去除紙漿的纖維素和半纖維素。在紙漿酶解過程中,酶究竟是僅對(duì)紙漿中殘留的聚糖進(jìn)行了降解,還是對(duì)LCC中部分聚糖進(jìn)行了降解,以及這個(gè)過程是否有小分子LCC伴隨溶出和是否有LCC的降解產(chǎn)物存在,至今仍然沒有統(tǒng)一的定論[7-14]。

本實(shí)驗(yàn)以麥草為原料,對(duì)其進(jìn)行硫酸鹽法制漿,對(duì)得到的硫酸鹽麥草漿依次進(jìn)行聚木糖酶和纖維素酶的酶解,再利用凝膠滲透色譜柱分別處理聚木糖酶酶解液(XHL)和纖維素酶酶解液(CHL),并對(duì)分離出的物質(zhì)進(jìn)行紫外光譜、紅外光譜和二維異核單量子碳?xì)湎嚓P(guān)(2D-HSQC)核磁共振譜圖分析,即通過實(shí)驗(yàn)探究酶解過程中是否有小分子LCC伴隨溶出及是否有LCC的降解產(chǎn)物存在。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 麥草漿的制備

實(shí)驗(yàn)紙漿為硫酸鹽麥草漿。硫酸鹽法制漿條件：用堿量17%(以Na2O計(jì)),硫化度25%,液比1∶4,最高蒸煮溫度160℃,升溫90 min,保溫60 min。

1.2 麥草漿的聚木糖酶酶解

將20.5 g乙酸鈉溶解在500 mL蒸餾水中,再將14.3 mL乙酸(冰醋酸)溶解在500 mL蒸餾水中,最后按照乙酸鈉與乙酸體積比59∶41的比例混合,調(diào)節(jié)pH值至4.8,制得乙酸/乙酸鈉緩沖溶液,貯存于冰箱備用。

在500 mL三角瓶?jī)?nèi),稱取5 g(絕干)麥草漿,加入200 mL 0.5 mol/L乙酸/乙酸鈉緩沖溶液、0.4 g聚木糖酶、0.1%的疊氮化鈉,在50℃條件下酶解48 h。酶解反應(yīng)完成后,將三角瓶中的物質(zhì)離心分離,固體用蒸餾水反復(fù)沖洗后放置冰箱保存,記為XHS(聚木糖酶酶解后的麥草漿)；液體減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至一定體積得到XHL。

1.3 麥草漿的纖維素酶酶解

稱取13.12 g乙酸鈉,量取乙酸溶液9.28 mL,加入蒸餾水調(diào)至8 L,調(diào)節(jié)pH值至4.5,制得乙酸/乙酸鈉緩沖溶液。取2 g纖維素酶加入到20 mL乙酸/乙酸鈉緩沖溶液中溶解,得到的溶液用100 mL具塞三角瓶裝好放入冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

稱取4 g(絕干)XHS放入250 mL的三角瓶中,加入已配好的纖維素酶溶液4.8 mL、0.1%的疊氮化鈉,再加入乙酸/乙酸鈉緩沖溶液調(diào)至120 mL,最后將配制好的三角瓶在45℃條件下酶解48 h。將酶解后的溶液離心分離,殘留物重復(fù)以上操作2次。最后,將3次離心分離的清液收集起來并減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至一定體積得到CHL。

圖1 硫酸鹽麥草漿XHL凝膠滲透色譜分離譜圖

圖2 硫酸鹽麥草漿CHL凝膠滲透色譜分離譜圖

圖3 硫酸鹽麥草漿CHL凝膠滲透色譜分離物FT-IR譜圖

1.4 酶解液中LCC的分離

用水作為流動(dòng)相,將XHL通過Toyopearl HW- 40S(4.0 cm×45.0 cm)型凝膠滲透色譜柱,每30 mL作為1個(gè)組分。從每一組分中取1 mL樣品進(jìn)行苯酚-濃硫酸染色實(shí)驗(yàn)后,利用Shimadzu UV-vis 2201型紫外分光光度計(jì)在490 nm波長(zhǎng)下進(jìn)行可見光掃描以測(cè)其糖含量[15],再?gòu)拿恳唤M分中取1 mL樣品在280 nm波長(zhǎng)下進(jìn)行掃描以測(cè)其木素含量[16],直至樣品中多糖組分幾乎全部被水洗出后,再改用二氧六環(huán)-水溶液(前者與后者體積比為1∶1)作為流動(dòng)相,將吸附在凝膠表面的物質(zhì)洗出,并繼續(xù)進(jìn)行紫外分光光度檢測(cè)至分離結(jié)束。最后，將收集到的富含LCC的組分減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、冷凍干燥即可得到目標(biāo)產(chǎn)物。CHL中LCC的分離方法同上。

1.5 紅外光譜分析

取1～2 mg樣品與10倍于樣品的無水KBr混合,混合后倒入壓片模具中壓片,采用美國(guó)Thermo Nicolet 360型傅里葉紅外光譜儀用透過法測(cè)定傅里葉變換紅外光譜圖(FT-IR)。

1.6 2D-HSQC核磁共振譜圖分析

將60 mg分離得到的LCC溶于0.5 mL二甲亞砜(DMSO-d6),用直徑5 mm的核磁管在BREKER- 600核磁共振儀對(duì)每個(gè)樣品進(jìn)行1H、13C連續(xù)掃描得到HSQC譜圖。實(shí)驗(yàn)條件為：碳?xì)漶詈铣?shù)145 Hz,1H和13C 2個(gè)維度譜寬分別為5000 Hz和20000 Hz,1H維度采樣點(diǎn)數(shù)量1024、13C維度采樣點(diǎn)數(shù)量256。

2 結(jié)果與討論

2.1 凝膠滲透色譜分離結(jié)果分析

圖1和圖2分別為麥草漿XHL和CHL中LCC分離時(shí)的凝膠滲透色譜分離譜圖。從圖1和圖2可以清楚地看到,XHL和CHL在280 nm和490 nm 處都有吸收。分離后期,當(dāng)多糖組分幾乎全被蒸餾水洗出后,改用二氧六環(huán)-水溶液作為流動(dòng)相,將殘留在凝膠中的物質(zhì)洗出。從圖1可知,流出組分(1500 mL左右)在280 nm和490 nm處均有吸收,說明該組分中既有木素,又有碳水化合物,可能為木素-碳水化合物復(fù)合體(LCC),但這需要利用核磁共振進(jìn)行進(jìn)一步分析。改用二氧六環(huán)-水溶液作流動(dòng)相時(shí)分離出來的組分中,木素含量比碳水化合物含量高,這表明麥草漿在聚木糖酶酶解過程中,更多的碳水化合物降解成水溶性的多糖組分,在分離初期被水洗出。圖2表明,流出組分在280 nm和490 nm處均有微弱吸收,為了確定流出組分的結(jié)構(gòu),需要進(jìn)行進(jìn)一步分析。

表1 硫酸鹽麥草漿CHL凝膠滲透色譜分離物FT-IR譜圖官能團(tuán)歸屬

圖4 硫酸鹽麥草漿XHL凝膠滲透色譜分離物2D-HSQC核磁共振譜圖

2.2 紅外光譜分析

2.3 2D-HSQC核磁共振譜圖分析

圖4為硫酸鹽麥草漿XHL凝膠滲透色譜分離物的2D-HSQC核磁共振譜圖,其主要的13C-1H相關(guān)歸屬見表2。

從2D-HSQC譜圖的側(cè)鏈區(qū)和碳水化合物異頭碳區(qū)可知木素和與木素相連的碳水化合物的相關(guān)信號(hào)。硫酸鹽麥草漿XHL凝膠滲透色譜分離物中β-O- 4′結(jié)構(gòu)Cγ-Hγ位于δC/δH 60.17/3.43[18],而芳香環(huán)內(nèi)的愈創(chuàng)木基(G)型結(jié)構(gòu)單元C5-H5和C6-H6分別位于δC/δH 115.06/6.64和δC/δH 119.19/7.04[19],對(duì)羥苯基(H)型結(jié)構(gòu)單元C2,6-H2,6的相關(guān)信號(hào)在δC/δH 123.12/7.00,其對(duì)應(yīng)的C3,5-H3,5相關(guān)信號(hào)與G型結(jié)構(gòu)單元C5-H5的相關(guān)信號(hào)重疊。

除了上述木素分子的主要相關(guān)信號(hào)外,與木素相連的碳水化合物的信號(hào)十分明顯。其中,β-D-木吡喃糖苷結(jié)構(gòu)2、3、4、5號(hào)位的相關(guān)信號(hào)分別位于δC/δH 69.95/3.15、δC/δH 72.16/3.41、δC/δH 72.02/3.54、δC/δH 62.86/3.40和δC/δH 62.87/3.74[20]。(1- 4)-α-D-木吡喃糖苷結(jié)構(gòu)異頭碳的相關(guān)信號(hào)出現(xiàn)在δC/δH 90.61/4.56,還發(fā)現(xiàn)聚木糖基C4、非還原性末端基聚木糖基C5的相關(guān)信號(hào)分別位于δC/δH 69.78/3.52和δC/δH 66.65/4.02。上述相關(guān)信號(hào)峰的出現(xiàn)表明,硫酸鹽麥草漿在聚木糖酶酶解過程中,聚木糖酶不僅對(duì)紙漿中殘余的聚木糖進(jìn)行降解,還對(duì)木素與聚木糖之間的化學(xué)連接鍵進(jìn)行了降解。得到的小分子LCC主要是由聚木糖和木素形成的,且根據(jù)來自于δC/δH 97.46/4.25、δC/δH 78.96/3.25和δC/δH 61.28/4.29處的信號(hào)峰可以判斷聚木糖和木素之間是通過苯基配糖體鍵、苯甲醚鍵和γ-酯鍵連接在一起的[21],并且通過信號(hào)峰的強(qiáng)弱判斷連接鍵以苯基配糖體鍵為主。

表2 硫酸鹽麥草漿XHL凝膠滲透色譜分離物2D-HSQC核磁共振譜圖主要13C-1H相關(guān)歸屬

注 X1為木糖的1號(hào)碳原子。

3 結(jié) 語

硫酸鹽法麥草漿纖維素酶酶解液(CHL)中沒有分離出小分子木素-碳水化合物復(fù)合體(LCC),而聚木糖酶酶解液(XHL)經(jīng)過凝膠滲透色譜柱分離得到的物質(zhì)中含有LCC。2D-HSQC(二維異核單量子碳?xì)湎嚓P(guān))核磁共振譜圖分析表明,硫酸鹽法制漿過程中,聚木糖酶不僅對(duì)紙漿中殘余聚木糖進(jìn)行降解,還對(duì)木素與聚木糖之間的化學(xué)連接鍵進(jìn)行了降解,而且,得到的小分子LCC主要是聚木糖和木素通過苯基配糖體鍵連接在一起。

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(責(zé)任編輯：關(guān) 穎)

Isolation and Characteristic Research of LCC from Enzymatic Hydrolysis Liquor of Kraft Wheat Straw Pulp

XIA Qing1YAO Lan1,2ZHANG Hong-wei3YANG Hai-tao1,2,*

(1.InstituteofPulpandPapermakingEngineering,HubeiUniversityofTechnology,Wuhan,HubeiProvince, 430068；2.HubeiProvincialKeyLabofGreenMaterialsforLightIndustry,Wuhan,HubeiProvince, 430068；3.WuhanUnionEngineeringConsultingCo.,Ltd.,Wuhan,HubeiProvince, 430071)

(*E-mail： yaolislan1982@aliyun.com)

In the study, wheat straw kraft pulp was prepared, then it was treated by xylanase and cellulase sequentially. The low molecular weight LCC was isolated from the enzymatic hydrolysis liquor using Gel Penetration Chromatography column. FT-IR and 2D-HSQC were employed to study the characteristic of the LCC. The results showed that LCC existed only in xylanase hydrolysis liquor (XHL).The analysis results of 2D-HSQC indicated that the LCC was formed by xylan and lignin connected by benzyl ether, phenyl glycoside andγ-ester bonds.It could also conclude that in xylanase hydrolysis process, xylan and the linkages of lignin-xylan in the kraft pulp could be degraded.

wheat straw pulp； xylanase； cellulase； 2D-HSQC

2014-12-10

國(guó)家自然科學(xué)基金(31500496)；綠色輕工材料湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室2013年開放基金。

夏 青,女,1989年生；在讀碩士研究生；主要從事生物質(zhì)能源化工的研究工作。

*通信聯(lián)系人：楊海濤,E-mail:yaolislan1982@aliyun.com。

TS71+1；

A

1000- 6842(2015)03- 0005- 05