白雪娟, 趙亞靜, 梁　艷, 吳雪瓊

(解放軍第309醫(yī)院 全軍結(jié)核病研究所 全軍結(jié)核病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/

結(jié)核病診療新技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京, 100091)

結(jié)核潛伏感染蛋白R(shí)v1737c B細(xì)胞、CTL及Th表位預(yù)測(cè)與分析

白雪娟, 趙亞靜, 梁艷, 吳雪瓊

(解放軍第309醫(yī)院 全軍結(jié)核病研究所 全軍結(jié)核病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/

結(jié)核病診療新技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京, 100091)

摘要:目的利用生物信息學(xué)方法建立一套預(yù)測(cè)B細(xì)胞、CTL及Th細(xì)胞免疫功能多肽的方法，用于篩選新型結(jié)核病診斷抗原分子和候選疫苗抗原。方法采用DNAStar軟件包中的Protean軟件從α螺旋、β折疊及轉(zhuǎn)角等二級(jí)結(jié)構(gòu)的數(shù)量和分布、親水性和表面可及性等方面預(yù)測(cè)分析該蛋白序列成為B細(xì)胞表位的可能性，預(yù)測(cè)CTL表位時(shí)，先采用Blast方法分析該序列與人類序列的同源性，然后綜合應(yīng)用SYFPEITHI超基序法、BIMAS量化基序法及NetCTL預(yù)測(cè)其CTL表位，應(yīng)用RANKPEP及SYFPEITHI超基序法遠(yuǎn)程預(yù)測(cè)Th細(xì)胞表位，篩選表位集中、分值較高者作為候選多肽片段。結(jié)果Protean軟件預(yù)測(cè)結(jié)果表明Rv1737c蛋白序列親水性和表面可及性都較弱, α轉(zhuǎn)角、β折疊結(jié)構(gòu)數(shù)目較多且分布廣泛，而轉(zhuǎn)角及卷曲結(jié)構(gòu)較少，B細(xì)胞表位數(shù)目較少; Rv1737c蛋白的CTL及Th表位主要集中于第100位氨基酸之后，其中與HLA-A2表型相對(duì)的CTL表位，與HLA-DRB1*0401及HLA-DRB1*1501表型相對(duì)的Th表位較其他表型數(shù)目較多、分值較高。結(jié)論Rv1737c蛋白可能不利于作為B細(xì)胞抗原，但其可能是一種較好的T細(xì)胞抗原，成為結(jié)核病診斷抗原分子和候選疫苗抗原。

關(guān)鍵詞:結(jié)核分枝桿菌; Rv1737c; 表位預(yù)測(cè); 生物信息學(xué)

Epitope prediction and analysis of Rv1737c protein of

結(jié)核病是因感染結(jié)核分枝桿菌(M.tb)所致的危害全球人類健康的主要傳染病之一[1]。據(jù)報(bào)道[2-3]全球約有20億人感染結(jié)核分枝桿菌，其中約90%感染者為潛伏期感染，而大多數(shù)活動(dòng)性結(jié)核病是由潛伏感染的結(jié)核桿菌重新激活所致。因此，結(jié)核潛伏者感染的篩查與防治對(duì)于控制結(jié)核病的發(fā)生有著重要意義。Rv1737c抗原是Voskuil等[4]利用基因芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)48個(gè)與缺氧相關(guān)的結(jié)核分枝桿菌潛伏感染抗原之一，其編碼一種硝酸鹽和/或亞硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。有研究[5-6]表明，與活動(dòng)性結(jié)核患者相比，該抗原更易被結(jié)核分枝桿菌潛伏感染人群外周血中的淋巴細(xì)胞識(shí)別；另外其在所有卡介苗菌株中表達(dá)缺失，由此推測(cè)如將抗原Rv1737c用于結(jié)核分枝桿菌潛伏感染診斷，有可能與接種卡介苗者相區(qū)分[7]。因此，本研究選擇Rv1737c抗原作為靶點(diǎn)，采用生物信息學(xué)方法，應(yīng)用目前使用較多且較成熟的在線及離線預(yù)測(cè)工具對(duì)其進(jìn)行B細(xì)胞、CTL及Th表位預(yù)測(cè)，試圖找到表達(dá)具有優(yōu)勢(shì)抗原表位的特異性片段。

1材料與方法

1.1材料

Rv1737c蛋白序列來(lái)源于網(wǎng)站http://www.tbdb.org/, 生物信息學(xué)分析軟件及網(wǎng)站來(lái)源于internet網(wǎng)絡(luò)資源，具體如下所述：

1.1.1B細(xì)胞表位預(yù)測(cè)：采用美國(guó)DNASTAR公司產(chǎn)品DNA Star軟件包中Protean軟件，可將其安裝于計(jì)算機(jī)上進(jìn)行DNA和蛋白質(zhì)分析。

1.1.2CTL表位預(yù)測(cè): Blast分析: http://web.expasy.org/blast/; SYFPEITHI超基序法遠(yuǎn)程預(yù)測(cè)：http://www.syfpeithi.de/; BIMAS量化基序法預(yù)測(cè): http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/; NetCTL預(yù)測(cè): http://www.cbs.dtu.dk/services/NetCTL/。

1.1.3Th表位預(yù)測(cè): RANKPEP預(yù)測(cè)：http://bio.dfci.harvard.edu/RANKPEP/; SYFPEITHI超基序法遠(yuǎn)程預(yù)測(cè): http://www.syfpeithi.de/。

1.2方法

1.2.1DNA star分析：篩選時(shí)依據(jù)親水性好(hydrophilicity), 表面可及性高(accessibility)，柔韌性好(flexibility)，抗原性強(qiáng)(antigenic index), 卷曲(coils)和轉(zhuǎn)角(turns)可能性大的為候選B細(xì)胞表位，盡量避開α螺旋、β折疊結(jié)構(gòu)。

1.2.2CTL表位分析：BLAST分析：采用EXPASY在線軟件(NCBI BLAST2 service)對(duì)Rv1737c蛋白氨基酸序列與人類蛋白質(zhì)的同源性進(jìn)行分析，在EXPASY主頁(yè)http://web.expasy.org/blast/，輸入Rv1737c蛋白的氨基酸序列，選擇Homo sapiens，進(jìn)行blast比對(duì)。

SYFPEITHI超基序法遠(yuǎn)程預(yù)測(cè)CTL表位：進(jìn)入SYFPEITHI主頁(yè)http://www.syfpeithi.de/, 選擇Epitope prediction進(jìn)入CTL表位預(yù)測(cè)界面，對(duì)Rv1737c的HLA-A* 0201、HLA-A*03和HLA-B*0702限制性CTL表位進(jìn)行遠(yuǎn)程預(yù)測(cè)。對(duì)分值較高(≥18分)的九肽做進(jìn)一步分析。

BIMAS量化基序法預(yù)測(cè)CTL 表位：進(jìn)入BIMAS主頁(yè)http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/, 選定預(yù)測(cè)抗原肽長(zhǎng)度為9, MHC類型為HLA-A*0201、HLA-A*3和HLA-B*7, 將已獲得的抗原氨基酸全長(zhǎng)輸入待預(yù)測(cè)序列框，運(yùn)行遠(yuǎn)程預(yù)測(cè)程序，獲得預(yù)測(cè)結(jié)果。

NetCTL預(yù)測(cè)CTL表位：進(jìn)入NetCTL主頁(yè)http://www.cbs.dtu.dk/services/NetCTL/, 選定A2、A3、B7表型，輸入氨基酸序列后進(jìn)行在線預(yù)測(cè)，選取綜合預(yù)測(cè)值(COMB)>0.75的九肽為候選CTL表位。

1.2.3Th表位分析: RANKPEP分析：進(jìn)入RANKPEP主頁(yè)http://imed.med.ucm.es/Tools/rankpep.html, 選擇MHC類型為HLA-DRB1*0101、HLA-DRB1*0301、HLA-DRB1*0401、HLA-DRB1*0701、HLA-DRB1*0801、HLA-DRB1*1101及HLA-DRB1*1501的限制性Th細(xì)胞表位預(yù)測(cè)，選取紅色標(biāo)記的潛在可能表位序列。

SYFPEITHI超基序法遠(yuǎn)程預(yù)測(cè)Th表位：進(jìn)入SYFPEITHI主頁(yè)http://www.syfpeithi.de/, 選擇Epitope prediction進(jìn)入CTL表位預(yù)測(cè)界面，主要對(duì)HLA-DRB1*0401、HLA-DRB1*0701、HLA-DRB1*08、HLA-DRB1*1101、HLA-DRB1*13及HLA-DRB1*15限制性Th細(xì)胞表位進(jìn)行預(yù)測(cè)。對(duì)分值較高(≥18分)的由15個(gè)氨基酸構(gòu)成的表位多肽作分析。

2結(jié)果

2.1Rv1737c蛋白B細(xì)胞抗原表位的DNA star預(yù)測(cè)分析結(jié)果

利用DNA star軟件包中的Protean軟件，結(jié)合Gamier-Robson和Chou-Fasman兩種方法預(yù)測(cè)Rv1737c蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，以β折疊較多，分布較均勻，分值較高且位置集中的氨基酸殘基位于6-23、72-92、97-118、142-171、173-184、204-224、229-243、300-312、364-385位; α螺旋結(jié)構(gòu)也較多，主要集中位于33-42、70-80、162-186、196-203、249-259、274-293、386-395位氨基酸殘基；轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)相對(duì)較少，位于120-124、130-132、190-191、261-263、344-345；無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)位于25-29、107-108、158-163、192-193、228-230、291-295、313-314、325-327位氨基酸殘基，數(shù)目也較少，分布比較散。用Kyte-Doolittle方法分析Rv1737c蛋白的疏水性和親水性，結(jié)果顯示該蛋白主要表現(xiàn)為疏水性，親水性區(qū)域較短且分散，僅以1-5、32-42、64-70、127-132、195-203、243-247、268-271、323-327、357-363、384-395位氨基酸殘基處的親水性指數(shù)較高，提示這些區(qū)域暴露于表面的幾率較大，作為抗原表位的可能性也最大。用Emini方法預(yù)測(cè)蛋白的表面可及性，顯示該蛋白呈現(xiàn)在表面可能性較大的區(qū)域主要僅集中于1-34、63-65、123-131、184-192、268-270、292-295、323-325、355-363、385-390、392-395位氨基酸殘基，其他部位展示的可能性較小或表現(xiàn)為負(fù)值。Rv1737c蛋白含有較多的柔韌性區(qū)域且分布較均勻，位于27-32、39-41、60-70、126-134、183-185、190-199、246-248、260-263、292-296、313-316、331-334、342-344、365-363、386-392位氨基酸殘基，提示該蛋白肽段的柔韌性較大，發(fā)生扭曲、折疊的概率較高，能形成豐富的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

圖1 應(yīng)用DNAstar軟件分析Rv1737c蛋白序列結(jié)果

2.2Rv1737c蛋白CTL表位預(yù)測(cè)分析結(jié)果

對(duì)Rv1737c蛋白氨基酸序列與人類蛋白質(zhì)的同源性進(jìn)行blast分析，結(jié)果表明該蛋白與人類蛋白質(zhì)序列一致率低，同源性較差。將Rv1737c蛋白序列輸入3種CTL表位分析軟件，選擇HLA-A2、HLA-A3和HLA-B7三種MHC限制類型，預(yù)測(cè)9個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的T細(xì)胞表位，表1列出由3種方法預(yù)測(cè)的分值較高且有候選意義的CTL表位數(shù)目情況；表2綜合考慮3個(gè)軟件的預(yù)測(cè)結(jié)果，針對(duì)每一種表型，篩選出分值較高的多肽序列。

2.3Rv1737c蛋白Th表位預(yù)測(cè)分析結(jié)果

將Rv1737c蛋白序列輸入2種Th表位分析軟件，選擇HLA-DRB1*0101、HLA-DRB1*0301、HLA-DRB1*0401、HLA-DRB1*0701、HLA-DRB1*0801、HLA-DRB1*1101及HLA-DRB1*1501限制性Th細(xì)胞表位預(yù)測(cè)，獲得9個(gè)或15個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的T細(xì)胞表位，表3列出由2種方法預(yù)測(cè)的分值較高且有候選意義的Th表型表位數(shù)目情況；表4綜合考慮2個(gè)軟件的預(yù)測(cè)結(jié)果，篩選出針對(duì)某個(gè)表型分值均較高的Th表位序列。

3討論

表1　不同在線預(yù)測(cè)工具對(duì)抗原Rv1737c的CTL表位綜合分析結(jié)果

表2　綜合分析Rv1737c蛋白獲得的候選CTL表位序列信息

表3　不同在線預(yù)測(cè)工具對(duì)Rv1737c抗原Th細(xì)胞表位的綜合分析

表4　綜合分析Rv1737c蛋白獲得的候選Th表位信息

隨著生物信息學(xué)的快速發(fā)展，通過(guò)生物信息學(xué)軟件和網(wǎng)站對(duì)相關(guān)信息進(jìn)行分析、處理、模擬，最終預(yù)測(cè)抗原表位的模式，已為越來(lái)越多的研究者所采用[8-9]。因?yàn)檫@樣的研究方式可以減少實(shí)驗(yàn)的盲目性，加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)的目的性，大大提高實(shí)驗(yàn)的成功率[10]。表位是抗原分子中決定抗原特異性的特殊化學(xué)基團(tuán)，表位的免疫學(xué)特性研究可以幫助研究者們更好地認(rèn)識(shí)抗原在機(jī)體內(nèi)的免疫機(jī)制，以之為基礎(chǔ)的診斷試劑和疫苗開發(fā)也成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)[11-12]。開發(fā)結(jié)核潛伏感染相關(guān)抗原表位為深入研究潛伏感染機(jī)制，發(fā)現(xiàn)新的潛伏感染診斷標(biāo)志物及有效的潛伏感染表位疫苗的研究奠定了基礎(chǔ)。

蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)與B細(xì)胞表位關(guān)系密切。維持α螺旋、β折疊結(jié)構(gòu)的化學(xué)鍵能較高，穩(wěn)定性強(qiáng)，造成這些結(jié)構(gòu)很難較好地與抗體嵌合，且經(jīng)常處于蛋白質(zhì)內(nèi)部，因而很少成為抗原表位。β轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)單元是比較松散的柔性結(jié)構(gòu)，易于扭曲、盤旋并展示在蛋白表面，有利于抗體嵌合，常含有B細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)表位[13-14]。通過(guò)DNAstar分析，作者發(fā)現(xiàn)蛋白R(shí)v1737c整體親水性和表面可及性都較弱，α轉(zhuǎn)角、β折疊結(jié)構(gòu)數(shù)目較多且分布廣泛，而轉(zhuǎn)角及卷曲結(jié)構(gòu)較少，這些因素都不利于將其作為B細(xì)胞抗原。將Rv1737c蛋白序列輸入3種CTL表位分析軟件，選擇不具種族特異性的高頻MHC-I類等位基因HLA-A2[15-17], 聯(lián)合HLA-A3和HLA-B7限制類型，預(yù)測(cè)CTL細(xì)胞表位，發(fā)現(xiàn)CTL表位集中于第100位氨基酸之后，且與HLA-A3和HLA-B7兩種表型相比較，針對(duì)HLA-A2表型的表位數(shù)目最多，分值較高。組合HLA-A2、HLA-A3和HLA-B7這3個(gè)超型的限制性表位，在黑人、白人和亞裔人中涵蓋率達(dá)到90%[18-19]。因此，聯(lián)合應(yīng)用HLA-A2、HLA-A3和HLA-B7 3個(gè)超型的限制性表位，可以誘導(dǎo)針對(duì)不同HLA基因位點(diǎn)的CTL反應(yīng)，從而大大拓寬免疫反應(yīng)人群。SYFPEITHI和BIMAS數(shù)據(jù)庫(kù)篩選是進(jìn)行CTL表位預(yù)測(cè)運(yùn)用最多的方法，但這兩種方法并沒(méi)考慮抗原肽提呈效率因素，而NetCTL考慮到了這一因素，因此將這三種方法綜合進(jìn)行分析，可以提高表位預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確率，減少后續(xù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的表位數(shù)目[18]。

HLA-DRB1*0101、HLA-DRB1*0301、HLA-DRB1*0401、HLA-DRB1*0701、HLA-DRB1*0801、HLA-DRB1*1101及HLA-DRB1*1501是中國(guó)人群常見的表型[20-21]，用兩種Th表位分析軟件對(duì)上述表型進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)RANKPEP較SYFPEITHI提供更多的預(yù)測(cè)表位類型，綜合兩種方法預(yù)測(cè)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)得分較高的候選Th型表位多數(shù)(14/20)亦集中于100位氨基酸之后；針對(duì)HLA-DRB1*0401及HLA-DRB1*1501表型的表位數(shù)目最多，分值較高；對(duì)于HLA-DRB1*0401表型, SYFPEITHI較RANKPEP預(yù)測(cè)獲得表位數(shù)目更多，且兩種方法獲得得分高的表位序列的一致性較高。由此可見，Rv1737c蛋白序列以T細(xì)胞表位為主，且Th與CTL表位位置集中于100位氨基酸之后，這一結(jié)果與DNAstar初步分析結(jié)果一致，這兩種表位之間僅有一條序列一致，其余都不相同。

Riano等[5]發(fā)現(xiàn)DosR抗原Rv1737c能在潛伏感染個(gè)體中誘導(dǎo)產(chǎn)生較之活動(dòng)性結(jié)核患者中更高水平的IFN-γ; 在南非烏干達(dá)結(jié)核分枝桿菌潛伏感染者中免疫原性也比較好, ELISA方法檢測(cè)顯示外周血中IFN-γ的水平較高[6]。這些結(jié)果提示該抗原可能與潛伏感染維持和保護(hù)結(jié)核再感染相關(guān)。Rv1737c蛋白有可能是一種較好的T細(xì)胞抗原，本研究預(yù)測(cè)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道比較一致。

本文通過(guò)生物信息學(xué)方法對(duì)Rv1737c蛋白進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，盡可能多地搜索和了解該蛋白的結(jié)構(gòu)與功能的信息。在表位預(yù)測(cè)和結(jié)合力分析方面充分考慮了多種軟件對(duì)MHC-I及Ⅱ類分子對(duì)多肽的限制性問(wèn)題，權(quán)衡分析各項(xiàng)結(jié)果，為結(jié)核病防治篩選新的診斷抗原分子和候選疫苗抗原，為實(shí)驗(yàn)研究和應(yīng)用前景分析提供信息，但篩選得到的候選表位肽是否能有效刺激T細(xì)胞免疫應(yīng)答，還有待于下一步體外、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步驗(yàn)證。

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mycobacterium tuberculosis dormant infection

on B cell, CTL and Th cells cells n on

BAI Xuejuan, ZHAO Yajing, LIANG Yang, WU Xueqiong

(InstituteforTuberculosisResearch,ArmyTuberculosisPreventionandControlKey

Laboratory,BeijngKeyLaboratoryofNewTechniquesofTuberculosisDiagnosisand

Treatment,the309thHospitalofPeople′sLiberationArmy,Beijing, 100091)

ABSTRACT:ObjectiveTo establish a method of predicting immune function polypeptides of B cells, CTL and Th cells for screening new TB diagnostic antigens and vaccine candidates by means of bioinformatics.MethodsSequences of proteins of B cell epitopes predicted by Protean software of DNAstar software package by the quantity and distribution from two dimensional structures of α-helix, β-pleated sheet and rotation structures. To predicte CTL epitopes, the sequence homology with the human sequence using Blast method, then the CTL epitopes were predicted by means of combination analysis of SYFPEITHI supermotif method, BIMAS quantitative motif method and NetCTL prediction method. The Th epitopes were predicted by RANKPEP and SYFPEITHI supermotif prediction method. The epitopes with higher concentration and higher scores were taken as the candidate polypeptides. ResultsProtean software showed that the hydrophilicity and surface accessibility of Rv1737c protein sequence were weak, the alpha angle and beta folding structures were more in number and distributed widely, and the angle and coil structure was less, the B cell epitopes were rare. The epitopes of Rv1737c protein on CTL and Th were concentrated after the 100th amino acid, in which

phenotypes of HLA-A2 corresponding with CTL, HLA-DRB1*0401 and HLA-DRB1*1501

corresponding with Th had more numbers and higher scores. ConclusionRv1737c protein may not benefit to be B cell antigen, but it may be a better T cell antigen for tuberculosis diagnosis marker and vaccine candidate.

KEYWORDS:mycobacterium tuberculosis; Rv1737c; epitopes prediction;bioinformatics

通信作者:吳雪瓊, Email: wu-xueqiong@263.net

收稿日期:2014-12-21

中圖分類號(hào):R 519

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):1672-2353(2015)03-005-05

DOI:10.7619/jcmp.201503002