朱喬燕，王光宇，2，畢亞光，2，張慶勇，魏 盟

（1．上海市第六人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，上海 200233；2．上海交通大學醫(yī)學院，上海 200233）

辛伐他汀通過Akt／eNOS途徑改善心肌梗死后急性期心功能

朱喬燕1，王光宇1，2，畢亞光1，2，張慶勇1，魏 盟1

（1．上海市第六人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，上海 200233；2．上海交通大學醫(yī)學院，上海 200233）

中國圖書分類號：R-332；R322．11；R331．31；R542.22；R972.6

摘要：目的 探討辛伐他?。╯imvastatin，Sim）對急性心肌梗死后心肌內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)的影響及其潛在機制。方法應(yīng)用結(jié)扎大鼠冠狀動脈左前降支的方法模擬急性心肌梗死（AMI），隨機分為心肌梗死組（MI）組和辛伐他汀組（Sim，20 mg·kg－1·d－1），另設(shè)假手術(shù)組（Sham組）。Sim組連續(xù)灌胃7 d，MI組和Sham組給予等劑量的生理鹽水灌胃。7 d后，觀察心肌血流動力學參數(shù)變化；檢測血脂及心肌壞死標記物肌鈣蛋白I（c-TnI）和乳酸脫氫酶（LDH）變化；ELISA法檢測心肌抗氧化系統(tǒng)超氧化物歧化酶（SOD）及谷胱甘肽過氧化物酶（GP）水平。Western blot檢測心肌p-Akt／p-eNOS蛋白表達變化。結(jié)果 急性心肌梗死明顯降低心肌血流動力學參數(shù)，增加血清c-TnI和LDH水平，降低SOD及GP水平，降低p-Akt和p-eNOS蛋白表達。Sim組能明顯改善急性期心功能惡化，減低血清c-TnI和LDH水平，增加SOD及GP水平，增加p-Akt和p-eNOS蛋白表達。結(jié)論 急性心肌梗死后早期應(yīng)用Sim能明顯改善心功能，增加心肌抗氧化系統(tǒng)活性，減少心肌壞死，這可能與提高p-Akt和p-eNOS蛋白表達有關(guān)。

關(guān)鍵詞：辛伐他??；心肌梗死；心功能；氧化應(yīng)激；急性期；p-Akt；p-eNOS

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2015－9－14 14：53 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150914．1453．020．html

他汀類藥物（statins），羥甲基戊二酰輔酶A （HMG-CoA）還原酶抑制劑，已成為臨床上治療高脂血癥和降低心血管疾病發(fā)病率及死亡率的一線藥物。大型臨床數(shù)據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，急性心肌梗死后（AMI）早期使用他汀類藥物能明顯提高AMI后1年生存率［1］。近年研究發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物的一些額外收益并非完全歸功于其降低血脂作用［2］。臨床數(shù)據(jù)和基礎(chǔ)實驗已經(jīng)證實在發(fā)生心衰情況下，活性氧類物質(zhì)增多，其參與脂質(zhì)過氧化物的形成，破壞細胞膜，降低內(nèi)源性的抗氧化防御系統(tǒng)［3－4］。因此，通過有效的干預(yù)手段抑制自由基的產(chǎn)生或增強抗氧化防御系統(tǒng)或許可以改善心功能。

近來實驗發(fā)現(xiàn)，絲氨酸／蘇氨酸激酶（Akt）及其下游靶蛋白eNOS（內(nèi)皮型一氧化氮合酶）參與調(diào)控缺血組織血管再生及改善缺血組織血流動力學異常改變［5－7］。但是在AMI情況下，辛伐他汀對內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)的影響還鮮有報道，同時對他汀類藥物心肌保護作用的研究大多數(shù)集中在心梗后重構(gòu)期［8］。所以本實驗制作大鼠急性心肌梗死模型，觀察辛伐他汀對急性期內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)的影響及其與Akt／eNOS通路的關(guān)系，探討辛伐他汀改善心肌梗死后急性期心功能的潛在分子機制。

1　材料與方法

1．1藥物與試劑 辛伐他?。ㄅ?00035）由默沙東公司提供；抗磷酸化的Akt（p-Aktser473）及磷酸化的eNOS（p-eNOSser1177）購自Cell Signaling Technolo-gy公司；BCA蛋白定量試劑盒購自碧云天公司；化學發(fā)光試劑購自Millipore公司。SOD與GP試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1．2動物模型建立與分組 健康SD♂大鼠（上海西普爾－必凱實驗動物有限公司提供），體質(zhì)量200 ～250 g。將5%戊巴比妥鈉（40 mg·kg－1）腹腔注射麻醉大鼠，背位固定，行氣管切開并連接到微型動物呼吸機（ALC-V8，上海奧爾科特生物科技有限公司）行呼吸支持，使用GE Pruka Mac-Lab2000心電生理工作站（GE，美國）實時記錄常規(guī)肢體導聯(lián)及V1、V3、V6胸前導聯(lián)心電圖。于大鼠胸骨左緣第3 －4肋間開胸，暴露心臟，剪開心包膜，于左心耳及肺動脈圓錐之間距左心耳下緣1－2 mm處穿線（6／0絲線）結(jié)扎冠狀動脈左前降支。結(jié)扎成功的標志：心電圖Ⅱ?qū)?lián)J點明顯抬高和結(jié)扎線以下心肌組織顏色由正常變蒼白。另設(shè)假手術(shù)組（Sham組，n＝12），在相同位置只掛線不結(jié)扎。24 h后存活的SD大鼠隨機分為心肌梗死組（MI組，n＝12），辛伐他汀組（Sim組，n＝12，20 mg·kg－1·d－1），劑量參考文獻［8］。Sim組術(shù)后24 h以辛伐他?。ㄅ?00035，默沙東公司）灌胃，連續(xù)7 d。Sham組和MI

組以等量的生理鹽水灌胃。

1．3血流動力學測定 7 d后以同樣的方法進行腹腔麻醉。分離右頸總動脈，經(jīng)右頸總動脈插入PE-20導管至左心室，導管另一端經(jīng)能量轉(zhuǎn)換器連接MPA-2000生理記錄儀，測定心率（HR）、左室收縮壓（LVSP）、左室舒張末壓（LVEDP）、左室壓力最大上升和下降速率（±LVdp／dtmax）。

1．4血脂、心肌損傷標記物及抗氧化系統(tǒng)標記物測定 血流動力學測定完之后開腹，在腹腔靜脈處取血5 mL，離心取上清送至上海市第六人民醫(yī)院檢驗科，測定膽固醇（TG）、甘油三酯（TC）、肌鈣蛋白I （c-TnI）、乳酸脫氫酶（LDH）水平，同時用ELISA試劑盒測定超氧化物歧化酶（SOD）及谷胱甘肽過氧化物酶（GP）水平。

1．5Western blot檢測心肌p-Akt／p-eNOS的表達提取心肌蛋白樣本，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，調(diào)至等濃度后加入上樣緩沖液混合，離心后上樣。恒壓80 V電泳，30 min后改為恒壓120 V至電泳結(jié)束。將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上（恒流250 mA，4℃轉(zhuǎn)膜2 h），用5%脫脂奶粉室溫封閉3 h，加入相應(yīng)一抗，在搖床上4℃孵育過夜，0.1%TBST洗膜3次后加相應(yīng)二抗室溫孵育2 h，洗膜后顯色，使用凝膠成像系統(tǒng)拍照分析，計算各條帶OD值，以靶蛋白與內(nèi)參蛋白的OD值比值代表相應(yīng)蛋白的表達量。

1．6統(tǒng)計學分析 采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以±s表示，多組間比較采用方差檢驗，兩兩比較分析采用LSD-q檢驗。

2　結(jié)果

2．1各組血流動力學比較 與Sham組相比，MI組LVEDP明顯升高，LVdp／dtmax，LVdp／dtmin及LVSP卻明顯降低（P＜0.05）。與MI組相比，Sim組明顯改善心功能，逆轉(zhuǎn)血流動力學這些異常指標（P＜0.05）。HR在各組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見Tab 1。

2．2各組大鼠血脂比較 與Sham組相比，MI組TG和TC均呈上升趨勢，但差異未達到統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與MI組相比，Sim組TG和TC呈下降趨勢，差異也未達到統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2．3各組心肌損傷標記物及抗氧化系統(tǒng)標記物測定 與Sham組相比，MI組血清c-TnI和LDH水平明顯升高（P＜0.05），與MI組相比，Sim組c-TnI和LDH水平明顯降低（P＜0.05），但較Sham組升高（P＜0.05）。與Sham組相比，MI組血清SOD和GP水平明顯降低（P＜0.05），與MI組相比，Sim組SOD和GP水平明顯升高（P＜0.05），但較Sham組降低（P＜0.05），見Tab 2。

Fig 1 Effect of simvastatin on lipid level in rats（n＝12）

2．4Western blot檢測各組心肌p-Akt和p-eNOS水平變化 與Sham組相比，MI組p-Akt水平明顯降低（P＜0.05），與MI組相比，Sim組p-Akt水平明顯升高（P＜0.05）。與Sham組相比，MI組p-eNOS水平明顯降低（P＜0.05），與MI組相比，Sim組p-eNOS水平明顯升高。

Tab 1 Effect of simvastatin on hemodynamics parameters in rats（±s，n＝12）

Tab 1 Effect of simvastatin on hemodynamics parameters in rats（±s，n＝12）

P＜0.05 vs Sham group；＃P＜0.05 vs MI group

Group　LVSP／kPa　LVEDP／kPa　LVdp／LVdtmax／kPa·s－1　LVdp／LVdtmin／kPa·s－1　HR／bpm·min－1Sham　15．86±0．98　0．39±0．09　1243．82±104．51　810．06±78．51　438．00±5．20 MI　12．26±0．88　0．77±0．15　739．95±28．39　574．12±30．66　456．00±19．40 Sim　15．32±0．79?！?．43±0．11?！?179．44±79．98＃　785．27±94．78＃451．00±13．10

Tab 2 Effect of simvastatin on myocardial injury and antioxidant system markers in rats（±s，n＝12）

Tab 2 Effect of simvastatin on myocardial injury and antioxidant system markers in rats（±s，n＝12）

P＜0.05 vs Sham；＃P＜0.05 vs MI

Group　c-TnI／ng·L－1LDH／U·L－1SOD／U·L－1　GP／U·L－1Sham　750±230　6122±120　325±15　8327±674 MI　18210±8670　8562±236　184±21　5458±745Sim　8530±3960＃　7383±153?！?41±14＃　7247±695＃

Fig 2 Effect of simvastatin on p-Akt and p-eNOS expression in rats（n＝12）

3　討論

本實驗觀察到急性心肌梗死后急性期心功能明顯降低，LVSP，±LVdp／LVdtmax明顯降低，LVEDP升高，用辛伐他汀20 mg·kg－1連續(xù)灌胃7 d可以明顯改善心功能。急性心肌梗死后，細胞壞死釋放大量肌鈣蛋白I［9－10］，急性心肌梗死后使用辛伐他汀可以明顯降低c-TnI水平［11］。LDH也是診斷心肌損傷的標志物，當細胞膜通透性升高或者破裂，胞質(zhì)內(nèi)的LDH就會釋放到細胞外，血清濃度也隨之升高。前期研究也表明發(fā)生心肌梗死大鼠，血清LDH濃度會明顯升高，本次研究結(jié)果和前期研究結(jié)果一致［12］。使用辛伐他汀可以明顯減少LDH水平，表明辛伐他汀可以保持細胞膜完整性，從而限制胞質(zhì)內(nèi)LDH外溢。所以，辛伐他汀改善心功能或許和穩(wěn)定細胞膜完整相關(guān)，減少心肌細胞的破壞。

急性心肌梗死可引起嚴重的氧化應(yīng)激反應(yīng)，進而導致心肌細胞的壞死?；钚匝躅愇镔|(zhì)的增多或者抗氧化防御系統(tǒng)能力的減弱都會加重心肌細胞的壞死，加重心肌病理生理變化［13］。Zhou等［14］報道氟伐他汀可以減少心肌細胞氧化物質(zhì)產(chǎn)生，增加抗氧化系統(tǒng)性能。這和此次試驗結(jié)果一致，SOD和GP 在MI組都明顯降低，辛伐他汀處理可以明顯提升SOD和GP水平，表明急性期使用辛伐他汀可以增強內(nèi)源性抗氧化防御系統(tǒng)，加快應(yīng)激狀態(tài)下自由基的清除，減少心肌損傷，從而改善心梗急性期心功能，此外也表明辛伐他汀的心臟保護作用機制可能與增加SOD和GP水平有關(guān)。

蛋白激酶B（PKB／Akt）是一種多功能調(diào)控因子，參與內(nèi)皮細胞的生長、生存等調(diào)節(jié)。在缺血／再灌注動物模型中，激活A(yù)kt可以減少心肌細胞凋亡［15］。Kureishi等［7］研究表明，在正常血脂的動物中，辛伐他汀可以明顯改善缺血肢體的血流動力學參數(shù)，促進血管再生。進一步研究發(fā)現(xiàn)，Akt／eNOS信號通路在此過程中扮演著舉足輕重的作用。在本次實驗中，我們也觀察到辛伐他汀改善急性期心肌梗死大鼠血流動力學參數(shù)，同時也發(fā)現(xiàn)辛伐他汀組提高p-Akt和p-eNOS水平。所以據(jù)此推測辛伐他汀促進心梗后大鼠心肌Akt激活，從而使血管內(nèi)皮細胞生成NO增加，促進血管擴張，增加缺血心肌的灌注，從而改善心功能。NO還可以抑制血小板的聚集、炎癥反應(yīng)和平滑肌細胞增殖。此外，Akt是血管內(nèi)皮細胞生長因子（VEGF）下游靶蛋白，在Kure-ishi等研究中發(fā)現(xiàn)激活A(yù)kt發(fā)揮血管再生作用，因此，在本次實驗中不能排除Akt也發(fā)揮同樣的作用進而改善心功能。故激活A(yù)kt途徑加快再內(nèi)皮化和增加NO合成體現(xiàn)了心肌梗死早期使用他汀類藥物保護益處。總之，這些潛在的心臟保護作用機制或許可以部分解釋辛伐他汀改善急性期心功能的分子機制。當然還有其他許多機制，如辛伐他汀減少心梗后心肌細胞凋亡和減輕心肌細胞水腫參與心功能

的改善［16］。

綜上所述，本實驗證實辛伐他汀對心肌梗死大鼠急性期具有重要的保護作用，增加血清SOD和GP水平，降低c-TnI和LDH水平和激活A(yù)kt／eNOS信號通路都參與其中。這為早期使用他汀類藥物治療急性心肌梗死改善心功能提供了重要的實驗依據(jù)。至于辛伐他汀調(diào)節(jié)Akt磷酸化和Akt促進eNOS磷酸化增加NO釋放的具體過程還是不清楚，需要以后的進一步研究。

（致謝：本文所有實驗過程及數(shù)據(jù)都是在上海市第六人民醫(yī)院心血管內(nèi)科實驗室完成，在此感謝實驗室研究員卿艷維老師在實驗中給予的幫助。）

參考文獻：

［1］ Stenestrand U，Wallentin L．Early statin treatment following acute myocardial infarction and 1-year survival［J］．JAMA，2001，285 （4）：430－6．

［2］ Adameova A，Harcarova A，Matejikova J，et al．Simvastatin alle-viates myocardial contractile dysfunction and lethal ischemic injury in rat heart independent of cholesterol-lowering effects［J］．Physi-ol Res，2009，58（3）：449－54．

［3］ Rajadurai M，Prince P S．Preventive effect of naringin on isoprot-erenol-induced cardiotoxicity in Wistar rats：an in vivo and in vitro study［J］．Toxicology，2007，232（3）：216－25．

［4］ Rajadurai M，Stanely Mainzen Prince P．Preventive effect of nar-ingin on cardiac markers，electrocardiographic patterns and lysoso-mal hydrolases in normal and isoproterenol-induced myocardial in-farction in Wistar rats［J］．Toxicology，2007，230（2－3）：178 －88．

［5］ Fujio Y，Walsh K．Akt mediates cytoprotection of endothelial cells by vascular endothelial growth factor in an anchorage-dependent manner［J］．J Biol Chem，1999，274（23）：16349－54．

［6］ Datta S R，Brunet A，Greenberg M E．Cellular survival：a play in three Akts［J］．Genes Dev，1999，13（22）：2905－27．

［7］ Kureishi Y，Luo Z，Shiojima I，et al．The HMG-CoA reductase inhibitor simvastatin activates the protein kinase Akt and promotes angiogenesis in normocholesterolemic animals［J］．Nat Med，2000，6（9）：1004－10．

［8］ 胥雪蓮，覃 數(shù)，雷 寒，等．辛伐他汀改善大鼠心肌梗死后心室重塑與p-ERK1／2的關(guān)系［J］．中國藥理學通報，2008，24（2）：258－61．

［8］ Xu X L，Qin S，Lei H，et al．Simvastatin ameliorates rat ventricu-lar remodeling after myocardial infarction：the role of phosphoryla-ting extracellular signal-regulated kinase1／2［J］．Chin Pharmacol Bull，2008，24（2）：258－61．

［9］ Li X D，Yang Y J，Geng Y J，et al．The cardioprotection of simv-astatin in reperfused swine hearts relates to the inhibition of myo-cardial edema by modulating aquaporins via the PKA pathway ［J］．Int J Cardiol，2013，167（6）：2657－66．

［10］Yao H C，Zhao A P，Han Q F，et al．Correlation between serum high-mobility group box-1 levels and high-sensitivity C-reactive protein and troponin I in patients with coronary artery disease［J］．Exp Ther Med，2013，6（1）：121－4．

［11］Yao H C，Yang L J，Han Q F，et al．Postconditioning with simv-astatin decreases myocardial injury in rats following acute myocar-dial ischemia［J］．Exp Ther Med，2015，9（4）：1166－70．

［12］Gurgun C，Ildizli M，Yavuzgil O，et al．The effects of short term statin treatment on left ventricular function and inflammatory mark-ers in patients with chronic heart failure［J］．Int J Cardiol，2008，123（2）：102－7．

［13］Nakamura T，Nishi H，Kokusenya Y，et al．Mechanism of antioxi-dative activity of fluvastatin-determination of the active position ［J］．Chem Pharm Bull（Tokyo），2000，48（2）：235－7．

［14］Zhou R，Xu Q，Zheng P，et al．Cardioprotective effect of fluvasta-tin on isoproterenol-induced myocardial infarction in rat［J］．Eur J Pharmacol，2008，586（1－3）：244－50．

［15］Fujio Y，Nguyen T，Wencker D，et al．Akt promotes survival of cardiomyocytes in vitro and protects against ischemia-reperfusion injury in mouse heart［J］．Circulation，2000，101（6）：660－7．

［16］Luo K Q，Long H B，Xu B C．Reduced apoptosis after acute myo-cardial infarction by simvastatin［J］．Cell Biochem Biophys，2015，71（2）：735－40．

Simvastatin improves cardiac function in acute phase after myocardial infarction through Akt／eNOS pathway

ZHU Qiao-yan1，WANG Guang-yu1，2，BI Ya-guang1，2，ZHANG Qing-yong1，WEI Meng1
（1．Cardiovascular Dept，the Sixth People’s Hospital of Shanghai，Shanghai 200233，China；2．Shanghai Jiaotong University School of Medicine，Shanghai 200233，China）

Abstract：Aim To investigate the effect of simvastatin （Sim）on endogenous antioxidant system after acute myocardial infarction（AMI）and its potential mecha-nisms．Methods The acute myocardial infarction （AMI）rat models were made by ligation left anterior descending of coronary artery．Then the successful models were randomly divided into myocardial infarc-tion group（MI group）and simvastatin group（Sim，20 mg·kg－1·d－1），another group without ligation left anterior descending of coronary artery served as sham group（Sham group）．The Sim group was administered simvastatin by gavage for 7 days．MI group and Sham

group received saline．Hemodynamic parameters，lipid levels，troponinI（c-TnI）and lactate dehydrogenase （LDH）concentrations were examined after 7days，and the levels of superoxide dismutase（SOD）and glutathi-one peroxidase（GP）of myocardial antioxidant system were detected by ELISA．The expression of cardiac p-Akt and p-eNOS protein were detected by Western blot．Results Acute myocardial infarction significant-ly lowered cardiac hemodynamic parameters，increased serum c-TnI and LDH levels，lowered levels of SOD and GP，and lowered the expression of p-Akt and p-eNOS protein．However，Sim could effectively prevent the deterioration of cardiac function，reduce serum c-TnI and LDH levels，increase levels of SOD and GP，and increase p-Akt and p-eNOS protein expression．Conclusion Early using Sim can effectively improve heart function after acute myocardial infarction，acti-vate myocardial antioxidant system，and reduce myocar-dial necrosis，which may be related to increasing the expression of p-Akt and p-eNOS．

Key words：simvastatin；myocardial infarction；cardi-ac function；oxidative stress；acute phase；p-Akt；p-eNOS

作者簡介：朱喬燕（1981－），女，碩士，研究方向：心律失常發(fā)病機制，E-mail：513387804＠qq．com；張慶勇（1972－），男，博士，副教授，碩士生導師，研究方向：糖尿病心律失常發(fā)病機制，E-mail：zhang＿qingyong71＠hotmail．com

基金項目：上海自然科學基金資助項目（No 13ZR1431500）

收稿日期：2015－05－11，修回日期：2015－08－16

文獻標志碼：A

文章編號：1001－1978（2015）10－1375－05

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．10．010