姜曉東，閻政禮，汪耀珠，周桂鳳

（湖南師范大學醫(yī)學院預防醫(yī)學系，湖南長沙 410013）

激活視網(wǎng)膜水平細胞NMDA受體抑制內(nèi)向整流鉀通道活動

姜曉東，閻政禮，汪耀珠，周桂鳳

（湖南師范大學醫(yī)學院預防醫(yī)學系，湖南長沙 410013）

中國圖書分類號：R322.91；R329.24；R348.1；R392.11

摘要：目的 探討視網(wǎng)膜水平細胞上激活NMDA受體對其內(nèi)向整流鉀通道的調控作用。方法 采用酶解分離的視網(wǎng)膜水平細胞進行膜片鉗全細胞記錄，在給藥激活NMDA受體前后，分別記錄內(nèi)向整流鉀通道的電流大?。涣硗庠跓o鈣及螯合胞內(nèi)鈣條件下，觀察NMDA受體對內(nèi)向整流鉀通道的作用。結果 激活NMDA受體后，內(nèi)向整流鉀通道電流減小，灌流洗脫后電流恢復；在無鈣和螯合胞內(nèi)鈣的條件下，激活NMDA受體不能改變內(nèi)向整流鉀通道活動。結論 激活視網(wǎng)膜水平細胞NMDA受體可以通過胞內(nèi)鈣信號抑制內(nèi)向整流鉀通道電流。

關鍵詞：視網(wǎng)膜；內(nèi)向整流鉀通道；鈣，胞內(nèi)鈣庫；NMDA受體；膜片鉗

網(wǎng)絡出版時間：2015－9－14 14：53 網(wǎng)絡出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150914．1453．056．html

視網(wǎng)膜水平細胞是視網(wǎng)膜外網(wǎng)狀層的抑制性中間神經(jīng)元，其接受來自光感受器細胞的谷氨酸能輸入，釋放抑制性神經(jīng)遞質γ-氨基丁酸（GABA），反饋抑制光感受器細胞。同時水平細胞的突起廣泛伸展于外網(wǎng)狀層，橫向調節(jié)視網(wǎng)膜信息傳遞，參與雙極細胞和神經(jīng)節(jié)細胞的感受野的形成［1］。

水平細胞膜上表達豐富的內(nèi)向整流鉀通道，在細胞超極化時開放，促進鉀離子內(nèi)流，使得細胞恢復在靜息電位，對于細胞興奮性的調節(jié)非常重要。同時，也有研究表明，內(nèi)向整流鉀通道的開放可以提升水平細胞對光反應的速率，參與調節(jié)視覺信息調控［2］。視網(wǎng)膜內(nèi)向整流鉀通道的下調同時也參與缺血、糖尿病視網(wǎng)膜病變等很多病理調節(jié)過程［3－4］。

離子型谷氨酸受體可以分為NMDA受體和非NMDA受體（如AMPA受體）。過去認為NMDA受體主要分布在神經(jīng)節(jié)細胞上，水平細胞上表達的谷氨酸受體是AMPA受體。隨后也發(fā)現(xiàn)在水平細胞上也同時表達NMDA受體，但其功能缺少研究［5－6］。NMDA受體在神經(jīng)節(jié)細胞上的功能主要是接受突觸前的谷氨酸輸入，形成動作電位［7］。而水平細胞作為中間神經(jīng)元，不發(fā)放動作電位，作者前期工作表明，激活水平細胞NMDA受體可以抑制GA-BA轉運體活動［8］。在視網(wǎng)膜神經(jīng)膠質細胞（Müller細胞）上NMDA受體的激活，可以抑制內(nèi)向整流鉀通道的活動［9］。在水平細胞上NMDA的該功能尚無研究，基于在鯽魚視網(wǎng)膜水平細胞上的研究基礎，本文NMDA受體的激活對內(nèi)向整流鉀通道是否有調節(jié)作用及相關機制進行了研究。

1　材料與方法

1．1細胞分離 根據(jù)文獻［5］，分離的視網(wǎng)膜水平細胞取自成年鯽魚（carassius auratus，體長15～20 cm）。在通O2的Hank′s液中，將鯽魚眼球鞏膜剪開。分離出視網(wǎng)膜，剪成8～12片，置于含有木瓜蛋白酶（2×104U·L－1）和L-半胱氨酸（5 mmol· L－1）的Hanks′s液體中，在室溫下消化20 min。然后用玻璃吸管輕柔吹打視網(wǎng)膜片至溶液渾濁。靜置沉降5 min后，取細胞懸浮液于培養(yǎng)皿內(nèi)鏡下依據(jù)特異形態(tài)觀察H1型水平細胞。

1．2全細胞記錄和給藥 水平細胞的全細胞記錄采用Axon 200B膜片鉗系統(tǒng)（Axon Instruments，USA），鉗制電壓為－60mV。記錄電極（Sutter In-struments，USA）采用水平拉制儀器拉制，電極電阻在5～8 MΩ。灌充電極內(nèi)液后，將電極安裝在膜片鉗夾持器上，之后采用微動操作儀（SD Instruments，USA）操作。參考電極采用Ag／AgCl電極。補償細胞快、慢電容，并適當補償串聯(lián)電阻。數(shù)據(jù)采集軟件采用AxoScope（Axon Instruments，USA），采樣率1kHz。數(shù)據(jù)分析采用Clampfit 9.2（Axon Instru-ments，USA）。

NMDA的快速給藥，采用DAD-12給藥系統(tǒng)（ALA Scientific，USA）。在所有實驗中，NMDA （100 μmol·L－1）與glycine（100 μmol·L－1）共同給藥。

1．3溶液 Hank′s液包括（mmol·L－1）：NaCl

120，MgSO41.0，KCl 3.0，CaCl20.5，HEPES 20.0，Na-pyruvate 1.0，NaH2PO41.0，NaHCO30.5，glu-cose 16.0。無Mg2＋的Ringer′s液含有（mmol· L－1）：NaCl 120.0，KCl 5.0，CaCl22.0，HEPES 10.0，glucose 16.0。Ryanodine和thapsigargin采用DMSO配成母液，臨用前加入Ringer′s液，DMSO終濃度＜0.5%。NMDA和AP-5采用Ringer′s液溶解。Hank′s液和Ringer′s液的pH值采用NaOH調整至7.4。膜片鉗記錄電極內(nèi)液包含（mmol· L－1）：KCl 140.0，MgSO41.0，EGTA 0.5，CaCl20.05，HEPES 10.0。pH值用KOH調整至7.3。所用藥品購買于Sigma公司（St.Louis，MO，USA）。

2　結果

2．1視網(wǎng)膜水平細胞上的NMDA受體和內(nèi)向整流鉀通道 采用急性分離的H1型視網(wǎng)膜水平細胞（Fig 1A）進行全細胞電壓鉗記錄，鉗制電壓為－60 mV。當快速給予NMDA（100 μmol·L－1）和Gly-cine（100 μmol·L－1）時，可以記錄到明顯的內(nèi)向電流，即NMDA受體激活引發(fā)的電流，此電流可以被NMDA受體阻斷劑AP5所阻斷（Fig 1B）。

視網(wǎng)膜水平細胞上的內(nèi)向整流鉀通道可以隨細胞膜的超極化而激活。內(nèi)向整流鉀通道可以被溶液中的Cs＋所抑制。當灌流液中加入Cs＋后，在－120mV超極化所記錄的電流由正常時的－1241.1 pA下降到－185.3 pA（Fig 1C）。

2．2激活視網(wǎng)膜水平細胞上的NMDA受體抑制內(nèi)向整流鉀通道的活動 Fig 2A所示1例細胞在全細胞記錄模式下，給予－40 mV到－120 mV的階梯電壓，可以觀測到內(nèi)向整流鉀通道電流逐漸增強。在－120mV下的電流為－1136.1 pA。當在灌流液中加入NMDA（100 μmol·L－1）和Glycine（100 μmol·L－1），預灌流10 s后，待電流恢復到基線，再改變鉗制電壓觀察內(nèi)向整流鉀通道活動，發(fā)現(xiàn)在各電壓下，內(nèi)向電流均有減弱，在－120mV下，內(nèi)向電流為－583.5 pA。灌流沖洗5 min后，內(nèi)向電流的幅度得以恢復。以－120mV處的內(nèi)向為－954.8 pA。Fig 2B所示5個細胞在不同電壓下的電流變化，其中的條形圖顯示5例細胞在－120mV處以正常條件作為歸一化標準（100%），在激活NMDA受體后，內(nèi)向整流鉀通道電流下降到正常水平的64.1%±6.2%（P＜0.05，paired t-test），灌流沖洗后，恢復到正常水平的84.3%±6.3%（P＞0.05，paired t-test）。Fig 2C所示，在100 μmol·L－1的NMDA受體阻斷劑AP5存在的情況下，給予NMDA后，內(nèi)向整流鉀通道電流為對照水平的95.1%± 2.7%（P＞0.05，paired t-test）；灌流沖洗后，恢復到正常水平的92.5%±6.5%（P＞0.05，paired t-test），AP5阻斷了NMDA對內(nèi)向整流鉀通道電流的調控作用。Fig 3所示不同濃度NMDA對內(nèi)向整流鉀通道抑制效應，劑量－效應曲線采用希爾方程擬合，半效濃度為86.0 μmol·L－1，希爾系數(shù)（n）為0.9。

Fig 1 NMDA receptors and inward rectifying potassium channels on a retinal horizontal cell

2．3細胞內(nèi)鈣信號參與NMDA受體對內(nèi)向整流鉀通道的調控 由于NMDA受體激活時，可以向胞內(nèi)通透鈣離子。而鈣離子作為細胞的第二信使，參與胞內(nèi)信號通路調控。為了研究NMDA受體激活所介導的胞內(nèi)鈣濃度增高是否參與對內(nèi)向整流鉀通道的調控，采用無鈣離子的細胞外液灌流，并在電極內(nèi)液中添加BAPTA螯合胞內(nèi)鈣離子。Fig 4所示1例細胞，在－120mV下測定的內(nèi)向整流鉀通道電流為－1467.2 pA，在給予NMDA（100 μmol·L－1）和Glycine（100 μmol·L－1）3 min后，電流為1439.5

pA，灌流沖洗后，電流為1353.8 pA。Fig 4的條形小圖表示5例細胞在－120mV處以正常條件作為歸一化標準（100%），在激活NMDA受體后，內(nèi)向整流鉀通道電流為到正常水平的96.4%±2.0%（P＞0.05，paired t-test），灌流沖洗后，恢復到正常水平的88.0%±4.2%（P＞0.05，paired t-test）。

Fig 2 Inhibition of inward potassium currents by activation of NMDA receptors

Fig 3 Dose-effect curve of NMDA on inward potassium currents was fitted by Hill equation，in which each point with 5 cells

Fig 4 When calcium was removed，I－V curves of a horizontal cell were established under control，application of NMDA and wash con-ditions．Small figure showed NMDA modulation of normalized cur-rents from 5 cells under－120mV．

3　討論

在視網(wǎng)膜水平細胞上的谷氨酸受體，早期研究集中于AMPA受體的研究，后來發(fā)現(xiàn)NMDA受體也共同表達在水平細胞上，但功能尚需缺乏研究［6］。本文在鯽魚視網(wǎng)膜水平細胞上發(fā)現(xiàn)，激活NMDA受體后，內(nèi)向整流鉀通道電流受到抑制。由于NMDA

受體是鈣離子通透的，為了驗證該離子作為第二信是否參與NMDA受體對內(nèi)向整流鉀通道的調控，在去除灌流液的鈣離子的同時，在電極內(nèi)液中加入鈣離子的快速螯合劑BAPTA后，發(fā)現(xiàn)激活NMDA受體對內(nèi)向整流鉀通道的抑制作用消失，表明鈣信號參與了這個調控過程。根據(jù)前期工作，激活視網(wǎng)膜水平細胞NMDA受體的內(nèi)流鈣離子可以通過觸發(fā)胞內(nèi)鈣庫的以鈣釋鈣過程，提升胞內(nèi)鈣離子濃度。鈣作為第二信使，進而通過鈣調蛋白及其依賴的蛋白激酶信號通路，調節(jié)鈉離子通道和鈣離子通道的功能。在視網(wǎng)膜膠質細胞（Müller細胞）上，激活NMDA受體也是通過鈣離子信號途徑調節(jié)內(nèi)向整流鉀通道活動的［9］。因此，在本文研究的水平細胞上，激活NMDA受體后，鈣信號參與了對內(nèi)向整流鉀通道的抑制調控過程。

神經(jīng)系統(tǒng)中，內(nèi)向整流鉀通道對于細胞內(nèi)外的鉀離子平衡很重要。內(nèi)向整流是指該通道在細胞膜超極化時候的內(nèi)向電流大于去極化時的外向電流。內(nèi)向整流鉀通道在視網(wǎng)膜水平細胞上當膜電位負于－30 mV時開放，并隨著超極化程度的增強，電流增大。而在細胞去極化時，內(nèi)向整理鉀通道關閉。在視網(wǎng)膜水平細胞上，同時表達延遲整流鉀通道、電壓門控鈉通道和鈣通道，這些通道分別處于膜電位高于－20 mV、－30 mV及－40 mV的去極化狀態(tài)才開放［10］。本文中內(nèi)向整流鉀通道的電流在－120 mV下的超極化下測定，可以排除這些電壓門控通道的影響。

在生理條件下，水平細胞內(nèi)向整流鉀通道在去極化（高于－40 mV）時，內(nèi)向整流鉀通道幾乎關閉，在－60mV以下開放，鉀離子內(nèi)流，避免細胞過度超極化，有助于細胞穩(wěn)定在靜息電位，參與細胞興奮性的調控。也有文獻報道［2］，內(nèi)向整流鉀通道的開放可以提高水平細胞的對光反應速率，調節(jié)水平細胞的生理功能。本文中，谷氨酸可以通過激活NMDA受體抑制內(nèi)向整流鉀通道?？梢酝茰y，在暗中，光感受器細胞持續(xù)釋放谷氨酸，通過抑制內(nèi)向整流鉀通道，降低水平細胞對光反應速率，來提高暗中的敏感度；在明亮中，光感受器釋放谷氨酸降低，水平細胞內(nèi)向整流鉀通道的抑制解除，對光反應速率提高，進而提升在明亮環(huán)境下的視覺的時間分辨率。

在病理條件下，內(nèi)向整流鉀通道促進鉀內(nèi)流，具有保護作用。視網(wǎng)膜在缺血／再灌注條件下［11］，Müller細胞內(nèi)向整理鉀通道電流下降；在大鼠糖尿病視網(wǎng)膜病變中，視網(wǎng)膜內(nèi)向整流鉀通道表達下調，導致神經(jīng)遞質重攝取等功能損害［12－13］。在缺血等狀態(tài)下，視網(wǎng)膜中谷氨酸累積增加，NMDA受體激活［14］，抑制內(nèi)向整流鉀通道，可能會加劇損害作用。而避免NMDA受體的過度激活，減弱其對內(nèi)向整流鉀通道的抑制，可能是緩解視網(wǎng)膜病理損傷的潛在靶點。

參考文獻：

［1］ Hoon M，Okawa H，Della Santina L，et al．Functional architec-ture of the retina：development and disease［J］．Prog Retin Eye Res，2014，42：44－84．

［2］ Dong C J，Werblin F S．Inwardly rectifying potassium conductance can accelerate the hyperpolarizing response in retinal horizontal cells［J］．J Neurophysiol，1995，74（6）：2258－65．

［3］ Pannicke T，F(xiàn)rommherz I，Biedermann B，et al．Differential effects of P2Y1 deletion on glial activation and survival of photore-ceptors and amacrine cells in the ischemic mouse retina［J］．Cell Death Dis，2014，5：e1353．

［4］ Zhang Y，Xu G，Ling Q，et al．Expression of aquaporin 4 and Kir4．1 in diabetic rat retina：treatment with minocycline［J］．J Int Med Res，2011，39（2）：464－79．

［5］ Jiang X D，Sun Y，Wang X L，et al．Suppression of gamma-ami-nobutyric acid transporter current by activation of ionotropic gluta-mate receptors on retinal horizontal cells［J］．Sheng Li Xue Bao，2009，61（4）：299－304．

［6］ Shen Y，Zhang M，Jin Y，et al．Functional N-methyl-D-aspartate receptors are expressed in cone-driven horizontal cells in carp reti-na［J］．Neurosignals，2006，15（4）：174－9．

［7］ Atoji Y．Expression of ionotropic glutamate receptors，AMPA，kainite and NMDA，in the pigeon retina［J］．Exp Eye Res，2015，136：72－7．

［8］ Jiang X D，Wang X L，Sun Y，et al．NMDA modulation of GABA transporter current in carp retinal horizontal cells［J］．Brain Res，2008，1240：105－10．

［9］ Puro D G，Yuan J P，Sucher N J．Activation of NMDA receptor-channels in human retinal Muller glial cells inhibits inward-rectif-ying potassium currents［J］．Vis Neurosci，1996，13（2）：319－26．

［10］Malchow R P，Qian H H，Ripps H，et al．Structural and function-al properties of two types of horizontal cell in the skate retina［J］．J Gen Physiol，1990，95（1）：177－98．

［11］Wurm A，Iandiev I，Uhlmann S，et al．Effects of ischemiareperfusion on physiological properties of Muller glial cells in the porcine retina［J］．Invest Ophthalmol Vis Sci，2011，52（6）：3360－7．

［12］Bringmann A，Pannicke T，Uhlmann S，et al．Membrane con-ductance of Muller glial cells in proliferative diabetic retinopathy ［J］．Can J Ophthalmol，2002，37（4）：221－7．

［13］Pannicke T，Iandiev I，Wurm A，et al．Diabetes alters osmotic swelling characteristics and membrane conductance of glial cells in rat retina［J］．Diabetes，2006，55（3）：633－9．

［14］白 雙，于 鑫，杜瑛培，等．枸杞多糖對NMDA致大鼠視網(wǎng)膜損傷保護作用的研究［J］．中國藥理學通報，2013，29（5）：670－4．

◇實驗方法學◇

［14］Bai S，Yu X，Du Y P，et al．Protective effect of lycium barbarum polysaccharides against NMDA-induced retinal damage in rats［J］．Chin Pharmacol Bull，2013，29（5）：670－4．

Inhibition of inward rectifying potassium channels by activation of NMDA receptors on retinal horizontal cell

JIANG Xiao-dong，YAN Zheng-li，WANG Yao-zhu，ZHOU Gui-feng
（Dept of preventive medicine Medical College，Hunan Normal University，Changsha 410013，China）

Abstract：Aim To study modulation of NMDA recep-tors on inward rectifying potassium channels through investigation of retinal horizontal cells．Methods Whole cell recording was conducted on isolated retinal horizontal cells for observation of inward-rectifying po-tassium currents before and after application of NMDA．Modulation of inward-rectifying currents by NMDA re-ceptor was also tested under calcium-free and chelation of intracellular calcium condition．Results Reduction of inward rectifying potassium currents was induced by activation of NMDA receptors．The effect was attenua-ted when calcium was removed．Conclusion Inhibi-tion of inward rectifying potassium channels can be in-duced by activation of NMDA receptors via intracellular calcium signals．

Key words：retina；inward-rectifying channel；calci-um，intracellular calcium store；NMDA receptor；patch clamp

作者簡介：姜曉東（1977－），男，博士，講師，研究方向：神經(jīng)毒理學，E-mail：mailofjxd＠gmail．com；周桂鳳（1958－），女，博士，教授，研究方向：神經(jīng)毒理學，E-mail：56946349＠qq．com

基金項目：湖南省教育廳青年基金（No 12B074）；湖南省衛(wèi)生廳基金資助（No B2012-62）；湖南師范大學教改課題“基于網(wǎng)絡課程《毒理學基礎》的PBL教學方法實證研究”

收稿日期：2015－06－10，修回日期：2015－07－20

文獻標志碼：A

文章編號：1001－1978（2015）10－1469－05

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．10．028