曾 帆，伍家燕，高 月，張涵韜，白 鑫，劉革力，宋方洲

（重慶醫(yī)科大學分子醫(yī)學與腫瘤研究中心，生物化學與分子生物學教研室，重慶 400016）

ALEX1在宮頸癌中的表達及對宮頸癌細胞生物學行為的影響

曾 帆，伍家燕，高 月，張涵韜，白 鑫，劉革力，宋方洲

（重慶醫(yī)科大學分子醫(yī)學與腫瘤研究中心，生物化學與分子生物學教研室，重慶 400016）

中國圖書分類號：R329．24；R329．28；R737．33；R979．1

摘要：目的 研究ALEX1基因在宮頸癌組織與癌旁組織中的表達情況，探討ALEX1基因對宮頸癌細胞生物學行為的影響。方法 應用免疫組化檢測臨床宮頸癌組織與癌旁組織中ALEX1的表達情況，通過小干擾RNA技術沉默ALEX1，并通過流式細胞儀檢測沉默ALEX1后HeLa細胞的周期、凋亡變化情況，利用CCK-8檢測其增殖情況及對抗癌藥物白藜蘆醇敏感性的影響。結果 免疫組化結果顯示，臨床宮頸癌組織中ALEX1高表達。與對照組HeLa細胞相比，沉默ALEX1實驗組細胞生長受到明顯抑制，并且增強白藜蘆醇對其的抑制作用，細胞周期阻滯在S期。結論 沉默ALEX1能有效阻滯HeLa細胞的生長能力及增強白藜蘆醇對HeLa細胞的抑制作用。

關鍵詞：ALEX1；宮頸癌；白藜蘆醇；RNA干擾；細胞增殖；細胞凋亡；細胞周期

網絡出版時間：2015－9－14 14：53 網絡出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150914．1453．048．html

宮頸癌是一種嚴重影響女性身心健康的疾病，據(jù)世界衛(wèi)生組織報告發(fā)病率占所有癌癥的12%，僅次于乳腺癌［1］。估計到2020年，將有1600萬新增病例，年齡主要集中在15至44歲之間［2］。報道顯示有80%以上宮頸癌是由人類乳頭瘤病毒（HPV）感染引起，HPV可以激活宮頸中原癌基因或抑制抑癌基因，使宮頸腫瘤的病毒DNA整合到染色體DNA中，從而增強細胞增殖能力導致宮頸癌的發(fā)生［3－4］。

ARM重復蛋白家族是指含有多個armadillo re-peat結構的蛋白，其成員在腫瘤形成、細胞間通信以及細胞骨架形成等方面發(fā)揮著重要作用［5］。Arma-dillo repeat結構包含了3個螺旋結構，分別為H1、 H2和H3［5－6］。ALEX蛋白是一個新的ARM重復蛋白家族成員，主要由ALEX1、ALEX2和ALEX3組成。其中ALEX1（arm proteins lost in epithelial canc-ers on chromosome X1）蛋白序列含有兩個Armadillo repeat結構，其N端具有一個疏水的跨膜區(qū)。目前研究表明，在大多正常組織中均有廣泛的表達，在上皮組織來源的腫瘤中低表達或者不表達［7］。有關報道也證明ALEX1參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展［8］，過表達ALEX1能抑制直腸癌細胞的克隆形成［9］。但有關ALEX1在宮頸癌中的作用及其機制尚未見報道。為此我們將探討ALEX1在宮頸癌中的表達情況，并研究其對宮頸癌細胞的相關生物學行為的影響。

1　材料與方法

1．1材料 HeLa細胞由重慶醫(yī)科大學分子醫(yī)學與腫瘤研究中心提供。采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自Hyclon公司；Opti-MEM購自Gibco公司；Lipofectamine RNAiMAX購自Invitrogen公司；siRNA由上海吉瑪公司合成；BCA試劑購自碧云天公司；CCK-8試劑盒購自Promega公司；DAB底物顯色試劑盒購自Beyotime公司；SP9002免疫組化染色試劑購自北京中杉金橋生物技術公司；鼠抗人ALEX1單克隆抗體、兔抗人β-ac-tin多克隆抗體購自Santa Cruz公司；宮頸癌臨床組織來源于重慶醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院。

1．2方法

1．2．1免疫組化檢測宮頸癌及其癌旁組織中的表達水平 收集的臨床組織用4%的多聚甲醛固定24 h，體積分數(shù)為0．5乙醇90 min、體積分數(shù)為0．7乙醇90 min、體積分數(shù)為0.85乙醇90 min、體積分數(shù)為0.9乙醇90 min、無水乙醇60 min脫水，石蠟包埋及切片。切片的免疫組化：烘片、脫蠟與水化、封閉、加一抗、加二抗、DAB顯色、鏡檢。根據(jù)組織的染色強度和染色陽性細胞比例進行綜合性量化評分。染色強度評分標準：陰性（－），0分；弱陽性（＋），1分；中等陽性（），2分；強陽性（），3分。染色陽性細胞比例評分標準：未染色細胞，0分；染

色陽性細胞比例＜10%，1分；染色陽性細胞比例10%～50%，2分；染色陽性細胞比例＞50%，3分?？偡种担饺旧珡姸确种担旧栃约毎壤种?。

1．2．2siRNA的合成及轉染 利用Promega軟件系統(tǒng)設計ALEX1 mRNA的3條siRNAs序列片段。序列分別為：RNAi-1，正義鏈：5′-CCUGGAGCGA ACAAAUGAUTT-3′，反義鏈：5′-AUCAUUUGUUCGC UCCAGGTT-3′；RNAi-2，正義鏈：5′-GCCUGCUACU-GUGUAUACATT-3′，反義鏈：5′-UGUAUACACAGU AGCAGGCTT-3′；RNAi-3，正義鏈：5′-GCUGGGCU AAGACUGUUAATT-3′，反義鏈：5′-UUAACAGUCU-UAGCCCAGCTT-3′；control siRNA，正義鏈：5′-UU-CUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，反義鏈：5′-ACGUGA CACGUUCGGAGAATT-3′，由上海吉瑪公司合成。干粉siRNA用DEPC水溶解稀釋成20 μmol·L－1，－20℃保存。HeLa細胞在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉染前將細胞制成懸浮液接種于6孔板中在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當細胞生長到50%～60%時，加入4 μL的Lipofectamine和8 μL的siRNA溶液并補齊2 mL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h。實驗共4組：RNAi-1組、RNAI-2組、RNA-3組以及control siRNA組。

1．2．3Western blot檢測siRNA對ALEX1的干擾效率 收集轉染siRNA 48 h后的HeLa細胞，并進行蛋白提取，采用BCA法測定蛋白濃度。按50 μg／孔蛋白量上樣，經8%SDS-PAGE膠分離后，將目的蛋白轉移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，加一抗4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次15 min，再用二抗室溫孵育2 h，ECL化學發(fā)光檢測結果。

1．2．4流式細胞技術檢測細胞周期 SiRNA轉染HeLa細胞48 h后，胰酶消化收集各組細胞，1 000 r ·min－1離心5 min，棄上清液，PBS重懸清洗，1 000 r·min－1離心5 min，重復1次，再加入1 mL PBS混勻，轉移至1.5 mL EP管中。最后加入5 μL An-nexin V-FITC，振蕩均勻后4℃孵育15 min，再加入5 μL碘化丙啶（PI），孵育5 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡的情況，實驗重復3次。

1．2．5流式細胞技術檢測細胞凋亡 SiRNA轉染HeLa細胞48 h后，胰酶消化收集各組細胞，1 000 r ·min－1離心5 min，棄上清液，PBS重懸清洗，1 000 r·min－1離心5 min，棄上清液，重復1次，體積分數(shù)為0.7乙醇重懸細胞，放置冰箱4℃，12 h。離心棄去上清，PBS清洗1次，加入含0.01%NaN 3和 0.1%BSA的緩沖液500 μL復溶細胞。加入2.5 μL RNase（100 mg·L－1），37℃孵育15 min，加入25 μL（10 μg·mL－1）PI染液，避光放置15 min。流式細胞儀檢測分析各組細胞的DNA含量，計算細胞周期，實驗重復3次。

1．2．6CCK-8測定細胞增殖 SiRNA轉染HeLa細胞48 h后，胰酶消化重懸細胞，血球計數(shù)板計數(shù)細胞，以每孔3 000個細胞接種于96孔板中，每組3個復孔，待貼壁后分別測定0、24、48、72、96 h的細胞生長狀況。每孔加入10 μL CCK-8試劑，37℃孵育2 h，酶標儀450 nm測定OD值。

1．2．7CCK-8檢測細胞對白藜蘆醇藥物的敏感性SiRNA轉染HeLa細胞48 h后胰酶消化重懸細胞，血球計數(shù)板計數(shù)細胞，以每孔3 000個細胞接種于96孔板中。配制濃度為1 mmol·L－1的白藜蘆醇溶液，待貼壁后加入0、5、10、15 μL的白藜蘆醇溶液，使其終濃度分別為0、50、100、150 μmol·L－1，按Promega公司的CCK-8測定細胞生長48 h的抑制率，每組3個復孔。每孔加入10 μL CCK-8試劑，37℃孵育2 h，酶標儀450 nm測定OD值。

1．2．8統(tǒng)計學分析 應用SPSS 17．0統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)以±s表示。兩組數(shù)據(jù)間的比較采用獨立樣本t檢驗，多組數(shù)據(jù)間的比較采用單因素方差分析。

2　結果

2．1宮頸癌及其癌旁組織中ALEX1的表達檢測通過免疫組化對比分析顯示：與癌旁組織相比，癌組織中ALEX1的表達明顯增加。此外，在癌旁組織中ALEX1的表達主要定位在細胞核中，而在癌組織中ALEX1的表達主要定位在細胞質中（Fig 1）。表明ALEX1在宮頸中的表達情況與宮頸是否發(fā)生癌變有關，推測ALEX1參與宮頸癌的發(fā)生和形成。

Fig 1 ALEX1 protein expression in cervical cancer tissues and adjacent non-cancerous tissues

2．2siRNA對ALEX1干擾效率的檢測 Western blot結果顯示：與對照組相比，實驗組RNAi-3中ALEX1的蛋白表達明顯下降（Fig 2）。說明在3組干擾序列中RNA-3的干擾效率最好，后續(xù)實驗干擾

采用RNA-3序列。

Fig 2 Efficiency of siRNA silencing of ALEX1 gene detected by Western blot

2．3沉默ALEX1基因表達，檢測HeLa細胞周期變化 流式細胞檢測周期結果顯示：空白組和對照組中S期細胞比例分別為16.53%和14.41%，G2期細胞比例分別為7.38%和8.30%。實驗組中S期細胞比例為30.00%，G2期細胞比例為1.72%?？瞻捉M與對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義；實驗組與對照組和空白組相比較，S期細胞明顯增多，G2期細胞明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），表明沉默ALEX1的表達阻滯HeLa細胞的周期進程（Fig 3）。

2．4沉默ALEX1基因表達，檢測HeLa細胞凋亡變化 流式細胞檢測凋亡結果顯示：空白組和對照組中凋亡率分別為2.31%和3.15%，實驗組凋亡比例分別為16.41%?？瞻捉M與對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義；實驗組與對照組和空白組相比較，凋亡明顯增多，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），表明沉默ALEX1的表達促進HeLa細胞的凋亡發(fā)生（Fig 4）。

2．5沉默ALEX1基因表達，檢測HeLa細胞增殖變化 CCK-8結果顯示：與對照組和空白組相比較，實驗組在72、96 h細胞生長明顯受抑制，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），表明沉默ALEX1的表達抑制HeLa細胞的增殖（Fig 5）。

2．6沉默ALEX1基因表達，檢測HeLa細胞對白藜蘆醇敏感性變化 CCK-8結果顯示：與對照組和空白組相比較，實驗組在細胞生長明顯受抑制，特別當濃度為50、100 μmol·L－1抑制最為明顯，表明沉默ALEX1的表達能提高HeLa細胞對白藜蘆醇的敏感性，增加白藜蘆醇對HeLa細胞的致死能力（Fig 6）。

3　討論

Fig 3 Cell cycle distribution detected by flow cytometric analysis

Fig 4 Cell apoptosis distribution detected by flow cytometric analysis

Armadillo repeat結構首次發(fā)現(xiàn)于果蠅極性基因armadillo，該基因在果蠅胚胎形成、維持上皮組織完

整性和早期細胞極性形成中起重要作用［10］。Arm repeat結構的特點是在真核和原核生物中都具有保守的三維結構，其結構是由大約42個氨基酸形成3 個α-螺旋，再由前后2個Arm repeat結構相互折疊，形成1個右手超螺旋結構［11］。Arm repeat蛋白家族是指含有多個Armadillo repeat結構的蛋白家族，其家族蛋白在腫瘤形成、發(fā)展、細胞間通訊，維持組織完整性等多方面發(fā)揮著重要作用［12］。

Fig 5 Effects of ALEX1 silence on cell growth in HeLa cells analysed by CCK-8

Fig 6 Effects of ALEX1 silence to resveratrol on cell growth in HeLa cells analysed by CCK-8

ALEX1蛋白是Kurochin在用酵母雙雜交技術尋找與pp110蛋白相互作用時發(fā)現(xiàn)的，屬于Arm re-peat蛋白家族新成員。ALEX1在Xq21.33－q22.2上，其基因全長為4．2 kb，含有4個外顯子，編碼著453個氨基酸，蛋白質分子質量為49 ku，含有兩個arm repeat結構，包括8個潛在的蛋白激酶C和5個酪蛋白激酶Ⅱ結合位點［7－8］。近年來研究表明，ALEX1能夠抑制人直腸癌細胞的克隆形［9］，ALEX1 mRNA在心臟、腦、睪丸、前列腺、卵巢、結腸等大多正常組織組織中高表達，在人腫瘤組織中沒有表達或低于其正常組織的表達。在細胞系中，ALEX1 mRNA在膠質瘤細胞系和骨肉瘤細胞系中有表達，在永生上皮細胞系、肺癌細胞系和乳腺癌細胞系中不表達，而在正常的乳腺上皮細胞系中有表達［7，13］。這些研究表明ALEX1基因有可能參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

2010年日本學者Iseki等［9］在直腸癌中研究ALEX1基因時發(fā)現(xiàn)：在直腸癌和胰腺癌中環(huán)腺苷反應元件和E-box基因定點突變會削弱ALEX1基因啟動子的活性，過表達反應元件結合蛋白和過表達β-catenin能促進ALEX1基因的表達。表明環(huán)腺苷反應元件和E-box是調控ALEX1基因啟動子的重要元件，ALEX1基因本身是被反應元件結合蛋白和β-catenin蛋白調節(jié)的。除此之外ALEX1也受Wntβ-catenin信號通路的調控［8］。

為了探討ALEX1基因在宮頸癌中的表達情況以及對宮頸癌細胞生物學作用的影響。本研究采用免疫組化檢測ALEX1在宮頸癌及其癌旁組織中的表達情況，應用siRNA干擾技術研究ALEX1對宮頸癌HeLa細胞的生物學形態(tài)影響。研究結果發(fā)現(xiàn)，ALEX1在宮頸癌組織中的表達高于其對應癌旁組織，沉默ALEX1表達后，HeLa細胞的周期、增殖受到抑制、促進HeLa細胞凋亡的發(fā)生，同時增強了白藜蘆醇對HeLa細胞的抑制作用，說明ALEX1與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展有著密切聯(lián)系。Wnt／β-catenin信號通路異?；罨悄[瘤重要發(fā)病原因之一，Wnt／β-catenin通路可以通過調控核內β-catenin的累積，激活Wnt相關靶基因［14］。ALEX1基因在宮頸癌中的激活，也有可能是Wnt／β-catenin異常活化所導致的。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，沉默ALEX1后能增強白藜蘆醇對HeLa細胞增殖的抑制作用，這可能是因白藜蘆醇降低了細胞內的β-catenin蛋白水平，從而抑制了Wnt／β-catenin通路的活性［15］，導致ALEX1的表達受抑制，促進了細胞的凋亡。

本研究首次證明，ALEX1在宮頸癌組織中高表達于其癌旁組織，沉默ALEX1能夠抑制宮頸癌細胞的增殖能力，這些結果為進一步研究ALEX1在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中的作用及其機制奠定了理論基礎。同時，ALEX1有望能作為一個新的宮頸癌標志物，用于臨床診斷和基因藥物的開發(fā)。

（致謝：本實驗完成于重慶醫(yī)科大學分子醫(yī)學與腫瘤研究中心，在此感謝本實驗室的老師及實驗管理人員，同時也

感謝我的指導老師宋方洲教授在實驗過程的指導及幫助。）

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ALEX1 expression in cervical cancer tissues and effect of ALEX1 on cervical cancer cell biology behavior

ZENG Fan，WU Jia-yan，GAO Yue，ZHANG Han-tao，BAI Xin，LIU Ge-li，SONG Fang-zhou
（Dept of Biochemistry and Molecular Biology，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China）

Abstract：Aim To investigate ALEX1 gene expres-sion in cervical cancer tissues and adjacent non-can-cerous tissues，and to explore the ALEX1 genetic influ-ence on cell proliferation，cycle and apoptosis of human cervical cancer cell line HeLa．Methods ALEX1 protein expression in cervical cancers and in non-can-cerous cervical tissues was evaluated using immunohis-tochemical method．A small interference RNA targeting ALEX1 gene was transfected into HeLa cells′，and the effect of ALEX1 interference on HeLa cells′cycle and apoptosis was analysed by flow cytometry．The effect of ALEX1 interference on HeLa cells′proliferation and sensitivity to resveratrol was analysed by CCK-8 assay．Results ALEX1 protein expression was significantly increased in cervical cancer tissues compared with non-cancerous tissues．HeLa cells′proliferation was inhibi-ted compared with control group and blank group．He-La cells′sensitivity to resveratrol was enhanced com-pared with control group blank group．Conclution SiRNA silencing of ALEX1 gene could significantly in-hibit HeLa cells′proliferation and enhance resveratrol ability of inhibiting HeLa cells′proliferation．

Key words：ALEX1；cervical cancer；resveratrol；siRNA；cell proliferation；cell apoptosis；cell cycle

作者簡介：曾 帆（1988－），男，碩士，研究方向：腫瘤基因功能，E-mail：zengf719＠163．com；宋方洲（1956－），男，博士，教授，博士生導師，研究方向：腫瘤基因功能，通訊作者，Tel：023-68485958

基金項目：高等學校博士學科點專項科研基金資助課題（No 20125503110012）

收稿日期：2015－06－29，修回日期：2015－07－20

文獻標志碼：A

文章編號：1001－1978（2015）10－1447－05

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．10．024