趙丕文，臧金鳳，陶仕英，陳 夢，牛建昭

（北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京 100029）

丹參酮IIA抗乳腺癌T47D細(xì)胞增殖的GPER途徑研究

趙丕文，臧金鳳，陶仕英，陳 夢，牛建昭

（北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京 100029）

中國圖書分類號：R284．1；R329．24；R392．11；；R394．2；R737.902.2

摘要：目的 利用經(jīng)典雌激素受體（estrogenic receptor，ER）和G蛋白偶聯(lián)雌激素受體（G protein-coupled estrogen recep-tor，GPER）陽性乳腺癌T47D細(xì)胞，探索丹參酮IIA（Tanshi-none IIA）對細(xì)胞增殖活性的影響及其GPER介導(dǎo)與調(diào)節(jié)功能。方法 以GPER激動劑G1和GPER拮抗劑G15為工具藥干預(yù)，并應(yīng)用GPER SiRNA轉(zhuǎn)染構(gòu)建GPER基因沉默的T47D細(xì)胞，利用MTT細(xì)胞增殖實驗觀察丹參酮IIA對T47D細(xì)胞增殖速率的影響及GPER的介導(dǎo)作用。利用Western blot方法檢測丹參酮IIA對T47D細(xì)胞GPER表達(dá)情況的影響。結(jié)果 1×10－5mol·L－1～1×10－7mol·L－1丹參酮IIA能夠明顯抑制T47D細(xì)胞增殖，且該抑制作用可被G1拮抗，可被G15增強(qiáng)。丹參酮IIA作用于GPER基因沉默的T47D細(xì)胞，該細(xì)胞表現(xiàn)出更為明顯的生長抑制效應(yīng)。West-ern blot測定結(jié)果表明，1×10－5mol·L－1和1×10－6mol· L－1丹參酮IIA可使T47D細(xì)胞GPER蛋白表達(dá)明顯降低。結(jié)論 丹參酮IIA具有抑制乳腺癌T47D細(xì)胞增殖的作用，該抑制作用可經(jīng)GPER途徑介導(dǎo)；且丹參酮IIA具有對靶細(xì)胞GPER表達(dá)的調(diào)節(jié)功能。

關(guān)鍵詞：丹參酮IIA；乳腺癌；T47D細(xì)胞；細(xì)胞增殖；G蛋白偶聯(lián)雌激素受體；雌激素受體；基因沉默

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2015－9－14 14：53 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150914．1453．052．html

雌激素是女性體內(nèi)最重要的性激素之一。內(nèi)源性雌激素及植物所含具有雌激素活性的化學(xué)成分——植物雌激素（phytoestrogen）發(fā)揮調(diào)節(jié)效應(yīng)的共有關(guān)鍵途徑是經(jīng)典的雌激素核受體（estrogen re-ceptor，ER），包括ERα和ERβ兩種亞型。但隨著相關(guān)領(lǐng)域研究的不斷深入和擴(kuò)展，上述兩種經(jīng)典的ER亞型介導(dǎo)機(jī)制已被發(fā)現(xiàn)無法確切、全面地闡明雌激素樣成分的作用途徑，特別是其所具有的與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能無關(guān)的快速細(xì)胞信號應(yīng)答反應(yīng)和傳導(dǎo)過程［1－3］。其后的進(jìn)一步研究為闡釋上述問題提供了新的線索：20世紀(jì)末多個實驗室在多項研究中相繼報道了一種新型膜受體——膜G蛋白偶聯(lián)受體30 （G protein-coupled receptor 30，GPR30）［4－6］，雖然其在結(jié)構(gòu)上與經(jīng)典ER沒有同源性，但也可特異性結(jié)合雌激素及雌激素樣物質(zhì)并介導(dǎo)其效應(yīng)，因此GPR30之后被賦予了另一與該效應(yīng)更相吻合的名稱——G蛋白偶聯(lián)雌激素受體（G protein-coupled estrogen receptor，GPER）［7］，該受體效應(yīng)的揭示為詮釋雌激素的快速應(yīng)答反應(yīng)提供了新的重要切入點(diǎn)。

近年來的研究表明，多種能夠結(jié)合經(jīng)典雌激素受體的化合物也可結(jié)合、活化GPER［8］。在多種雌激素相關(guān)腫瘤的發(fā)生和演變中，GPER發(fā)揮了重要的介導(dǎo)作用［9］。GPER也成為了特異性雌激素相關(guān)腫瘤細(xì)胞抗腫瘤藥物的候選新靶標(biāo)［10］。本課題組在既往研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，丹參的重要活性成分丹參酮IIA（Tanshinone II-A）可通過ER途徑明顯抑制乳腺癌T47D細(xì)胞的增殖，但ER調(diào)節(jié)和介導(dǎo)功能并不能完全解釋其效應(yīng)［11］，GPER是否也是其抗癌效應(yīng)的重要靶點(diǎn)和介導(dǎo)者？本研究旨在進(jìn)一步探討丹參酮IIA抗乳腺癌效應(yīng)及其GPER靶向和介導(dǎo)機(jī)制，以期為臨床乳腺癌的治療提供更加全面的實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1　材料

1．1試劑 DMEM（高糖）、無酚紅DMEM（高糖）、胎牛血清、活性炭－葡聚糖苷處理的胎牛血清（CDT-FBS）為Hyclone公司產(chǎn)品；雌二醇（Estradiol，E2）、MTT、DMSO為Sigma公司產(chǎn)品；GPER抗體、β-肌動蛋白抗體、對照SiRNA、GPER SiRNA為Santa Cruz公司產(chǎn)品；脂質(zhì)體Lipofectamine-2000購自In-vitrogen公司；GPER特異性激動劑G1、GPER特異性拮抗劑G15為Tocris公司產(chǎn)品；甘氨酸、Tween-20 為Amresco公司產(chǎn)品；BCA蛋白定量試劑盒、RIPA

裂解液、苯甲基磺酰氟（PMSF）、30%丙烯酰胺、濃縮膠緩沖液、分離膠緩沖液、蛋白分子量Marker、三羥甲基氨基甲烷、十二烷基磺酸鈉、脫脂奶粉、TEMED、SDS-PAGE上樣緩沖液、ECL超敏發(fā)光液為普利萊基因有限公司產(chǎn)品；二抗Anti-Rabbit IgG／HRP為北京康為世紀(jì)生物科技有限公司產(chǎn)品。

1．2藥物 丹參酮IIA購自中國生物制品檢定所，純度：98%；實驗時以DMSO溶解，終濃度為：1× 10－5mol·L－1～1×10－7mol·L－1。

1．3細(xì)胞株 人乳腺癌T47D細(xì)胞購自協(xié)和醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞中心。

1．4儀器 CO2培養(yǎng)箱（Binder）；酶聯(lián)免疫檢測儀（Epson LX-800）；倒置顯微鏡（Olympus）；凝膠成像分析儀（Pharmacia）；流式細(xì)胞儀（BD）。

2　方法

2．1細(xì)胞培養(yǎng) 人乳腺癌T47D細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM高糖溶液中，培養(yǎng)條件為37℃，5%CO2，相對飽和濕度。實驗開始前4天將細(xì)胞用PBS洗滌2次后，改為在無酚紅DMEM（含5%CDT-FBS）中培養(yǎng)，以耗盡細(xì)胞內(nèi)儲存的雌激素。

2．2MTT細(xì)胞增殖試驗 T47D細(xì)胞傳代3次，經(jīng)無酚紅DMEM（含5%CDT-FBS）培養(yǎng)4 d后，選取對數(shù)生長期細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化，PBS洗滌2次，加入無血清DMEM，以細(xì)胞密度3×103個／孔接種于96孔板內(nèi)，每孔培養(yǎng)液總體積為200 μL。培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁后，換為含1×10－8mol·L－1雌二醇、1×10－5mol·L－1～1×10－7mol·L－1丹參酮IIA的DMEM培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)；在GPER干預(yù)組中同時加入1×10－8mol·L－1GPER激動劑G1或GPER拮抗劑G15；每種受試物均設(shè)6個復(fù)孔。于48 h后加入MTT（5 g·L－1，15 μL／孔），繼續(xù)孵育4 h，小心吸去培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 150 μL。以DMSO調(diào)零，用酶聯(lián)免疫檢測儀在570 nm下測定各孔光吸收值（A），計算平均A值和增殖率（prolifera-tion rate，PR）。

PR／%＝（實驗組A值／溶劑對照組A值）×100%

2．3Western blot檢測GPER SiRNA轉(zhuǎn)染效果T47D細(xì)胞傳代3次，經(jīng)無酚紅DMEM（含5%CDT-FBS）培養(yǎng)4 d后，選取對數(shù)生長期細(xì)胞，以2×105個／孔密度將細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中。在細(xì)胞密度達(dá)到80%時進(jìn)行對照SiRNA或GPER SiRNA轉(zhuǎn)染：5 μL siRNA／孔應(yīng)用脂質(zhì)體Lipofectamine-2000按試劑盒說明進(jìn)行轉(zhuǎn)染。培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，并以14 000×g離心20 min，將上清部分進(jìn)行蛋白含量測定后用于免疫印跡分析。蛋白變性后上樣，SDS-PAGE電泳（濃縮膠80 V，分離膠120 V），半干電轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜（60 V，120 min）。5%脫脂奶粉37℃振搖1 h將膜封閉；加入GPER一抗，4℃孵育過夜。HRP標(biāo)記的二抗37℃振搖1 h后，將PVDF膜置ECL混合液中室溫下振蕩孵育5 min，X膠片曝光，顯影、定影、掃描后，以β-肌動蛋白表達(dá)量為對照觀察結(jié)果。

2．4GPER SiRNA轉(zhuǎn)染T47D細(xì)胞增殖試驗T47D細(xì)胞處理及GPER SiRNA轉(zhuǎn)染過程同“2.3”。應(yīng)用上述轉(zhuǎn)染成功的T47D細(xì)胞，以細(xì)胞密度3× 103個／孔接種于96孔板內(nèi)，24 h后按上述“2.2”步驟換為含1×10－8mol·L－1雌二醇、1×10－5mol· L－1～1×10－7mol·L－1丹參酮IIA的DMEM培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)，每種受試物均設(shè)6個復(fù)孔。于48 h后應(yīng)用MTT法檢測藥物對GPER SiRNA轉(zhuǎn)染T47D細(xì)胞增殖的影響。

2．5Western blot檢測丹參酮IIA對細(xì)胞GPER蛋白表達(dá)的影響 取經(jīng)無酚紅DMEM（含5%CDT-FBS）培養(yǎng)4 d的T47D細(xì)胞，以5×105個／瓶的密度接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶中，以無血清DMEM接種24 h待細(xì)胞貼壁后，換為含1×10－8mol·L－1雌二醇、1×10－5mol·L－1或1×10－6mol·L－1丹參酮IIA的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。藥物作用48 h后收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，并以14 000×g離心20 min，將上清部分進(jìn)行蛋白含量測定后用于GPER免疫印跡分析。蛋白變性、SDS-PAGE電泳及結(jié)果檢測方法均與“2.3”步驟相同。

3　結(jié)果

3．1MTT細(xì)胞增殖試驗檢測丹參酮IIA對T47D細(xì)胞增殖的抑制效應(yīng)及G1或G15的干預(yù)作用 從Tab 1可見，陽性藥物（1×10－8mol·L－1雌二醇）在48 h時可使T47D細(xì)胞增殖速率明顯增加（P＜0.01），加入G1后其促增殖作用明顯有所增強(qiáng)，加入G15后其促增殖作用有所減弱（P＜0.05）。而1 ×10－5mol·L－1～1×10－7mol·L－1丹參酮IIA對T47D細(xì)胞增殖均具有明顯抑制作用（P＜0.01）。加入G1后其增殖抑制作用被部分拮抗（P＜0.05）；加入G15后其增殖抑制作用進(jìn)一步增強(qiáng)（P＜0.05）。

3．2Western blot檢測GPER SiRNA轉(zhuǎn)染對T47D細(xì)胞GPER蛋白表達(dá)的沉默效應(yīng) Fig 1顯

示，GPER SiRNA轉(zhuǎn)染可使T47D細(xì)胞GPER蛋白表達(dá)水平明顯降低，與正常對照組相比差異有顯著性（P＜0.01），即GPER SiRNA轉(zhuǎn)染可構(gòu)建GPER蛋白表達(dá)水平明顯降低的T47D細(xì)胞。

Tab 1 Effect of tanshinone IIA on proliferation of T47D cells（±s，n＝6）

Tab 1 Effect of tanshinone IIA on proliferation of T47D cells（±s，n＝6）

P＜0．05，P＜0．01 vs EtOH control；△P＜0．05 vs same concentration of estradiol or tanshionoe IIA without G1 or G15

Treatment　48 h　48 h＋G1 1×10－8mol·L－148 h＋G15 1×10－8mol·L－1EtOH　0．2%　0．524±0．017　0．517±0．024　0．514±0．018 Estradiol　1×10－8mol·L－1　0．652±0．013　0．672±0．011　0．586±0．008△Tanshinone IIA　1×10－7mol·L－1　0．452±0．022　0．487±0．018△　0．409±0．028△Tanshinone IIA　1×10－6mol·L－1　0．393±0．027　0．451±0．018△　0．356±0．016△Tanshinone IIA　1×10－5mol·L－1　0．292±0．024　0．364±0．020△　0．266±0．026

Fig 1 Effect of GPER SiRNA transfection on GPER protein expression in T47D cells

3．3GPER SiRNA轉(zhuǎn)染對丹參酮IIA抑制T47D細(xì)胞增殖效應(yīng)的干預(yù)作用 從Tab 2可見，與“3.1”結(jié)果一致，1×10－8mol·L－1雌二醇在48 h時可使T47D細(xì)胞增殖速率明顯增加（P＜0.01），GPER SiRNA轉(zhuǎn)染后其促增殖作用明顯減弱（P＜0.01）。而1×10－5mol·L－1～1×10－7mol·L－1丹參酮IIA 對T47D細(xì)胞增殖具有明顯抑制作用（P＜0.05或0.01），GPER SiRNA轉(zhuǎn)染促進(jìn)了丹參酮IIA抗增殖作用的進(jìn)一步增強(qiáng)，與相應(yīng)濃度未轉(zhuǎn)染組相比差異有顯著性（P＜0.05或0.01）。

3．4丹參酮IIA對T47D細(xì)胞GPER蛋白表達(dá)的影響 Fig 2顯示，藥物作用48 h后，1×10－8mol· L－1雌二醇可使T47D細(xì)胞GPER蛋白表達(dá)水平稍有降低，但與正常對照組相比差異沒有顯著性。1× 10－5mol·L－1和1×10－6mol·L－1丹參酮IIA可誘導(dǎo)T47D細(xì)胞GPER蛋白表達(dá)水平明顯下降（P＜0.01）。

Tab 2 Effect of tanshinone IIA on proliferation of T47D cells transfected with GPER SiRNA（±s，n＝6）

Tab 2 Effect of tanshinone IIA on proliferation of T47D cells transfected with GPER SiRNA（±s，n＝6）

P＜0．05，P＜0．01 vs EtOH control；△P＜0．05，△△P＜0．01 vs same concentra-tion of estradiol or tanshionoe IIA in untransfected group

Treatment　48 h　48 h＋SiRNA EtOH　0．2%　0．516±0．022　0．498±0．006 Estradiol　1×10－8mol·L－1　0．633±0．007　0．544±0．013△△Tanshinone IIA 1×10－7mol·L－1　0．466±0．011　0．372±0．029△△Tanshinone IIA 1×10－6mol·L－1　0．407±0．030　0．344±0．029△Tanshinone IIA 1×10－5mol·L－1　0．296±0．007　0．256±0．005△△

1：EtOH；2：1×10－8mol·L－1estradiol；3：1×10－5mol·L－1tanshinone IIA；4：1×10－6mol·L－1tanshinone IIA．P＜0．01 vs EtOH control

4　討論

丹參酮為中藥丹參的一組脂溶性菲醌類有效成分，丹參酮IIA是其中的代表性化合物，是丹參發(fā)揮藥效的重要活性成分，其抗腫瘤作用，包括抗乳腺癌

細(xì)胞生長的作用已為實驗所證實［12－13］。本課題組在以前的研究中曾發(fā)現(xiàn)，丹參酮IIA對ER陽性T47D細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用［11］；而且已證明了丹參酮IIA在發(fā)揮該抗癌效應(yīng)過程中經(jīng)過了ER介導(dǎo)途徑，并具有升高ERα／ERβ比值的作用。但值得注意的是，據(jù)文獻(xiàn)報道，與ERβ相比，ERα在激活促增殖相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄上作用明顯，而ERβ在抑制相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄上活性更強(qiáng)［14－15］；而丹參酮IIA可升高ERα／ERβ比值，故推測其發(fā)揮抗癌效應(yīng)還有其他的作用靶點(diǎn)和相關(guān)途徑的參與。

如前所述，已有研究證實，多種能夠與經(jīng)典ER結(jié)合的化合物也可結(jié)合、活化GPER，而且GPER在多種雌激素相關(guān)腫瘤的發(fā)生及演變中發(fā)揮了重要介導(dǎo)作用，GPER也成為了特異性雌激素相關(guān)腫瘤細(xì)胞抗腫瘤藥物的候選新靶標(biāo)。本實驗結(jié)果顯示：丹參酮IIA對T47D細(xì)胞的增殖抑制作用可被GPER激動劑減弱、被GPER抑制劑增強(qiáng)，說明GPER可介導(dǎo)丹參酮IIA抗T47D細(xì)胞增殖作用，而且GPER活性與丹參酮IIA的抗增殖活性成負(fù)相關(guān)。同時，從Wester blot結(jié)果中可見，丹參酮IIA還具有降低GPER表達(dá)量，即GPER表達(dá)調(diào)節(jié)功能，這與某些既往研究結(jié)果具有一致性。例如，有研究發(fā)現(xiàn)TAM的活性代謝產(chǎn)物4-OHT（4-hydroxytamoxifen）可通過GPER途徑上調(diào)子宮內(nèi)膜癌Ishikawa和HEC1A細(xì)胞的c-fos表達(dá)、促進(jìn)兩種細(xì)胞的增殖；而拮抗GPR30的作用可導(dǎo)致OHT促增殖作用的消失［16－17］。Filardo等［18］曾發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌細(xì)胞GPER有過量表達(dá)且表達(dá)量與腫瘤大小成正比。Smith等［19］也發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中有GPER過量表達(dá)，而且表達(dá)量與癌癥的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，患者生存率隨著GPER的超量表達(dá)明顯降低。本研究中基因沉默實驗結(jié)果也進(jìn)一步證實，GPER表達(dá)減少可致丹參酮IIA抗T47D細(xì)胞增殖活性增強(qiáng)。Che-valier等［20］在2012年也曾報道，GPER基因沉默可致其介導(dǎo)的人精原細(xì)胞癌增殖效應(yīng)受到明顯抑制。Scaling等［21］在2014年也曾發(fā)現(xiàn)G1誘導(dǎo)的MCF10A乳腺癌細(xì)胞增殖活性可因GPER基因沉默而明顯降低。

另有報道也證實［22］：GPER對于甲狀腺癌等雌激素相關(guān)內(nèi)分泌系統(tǒng)腫瘤的治療具有重要應(yīng)用價值，特別是應(yīng)用于ER陰性、GPER陽性的病例。因此，針對GPER蛋白的研究對于解析疾病的發(fā)生、發(fā)展并據(jù)此進(jìn)行患者的個體化治療和預(yù)后均具有重要意義。與上述實驗結(jié)果和分析一致，本項研究不但表明丹參酮IIA可以通過GPER途徑抑制T47D乳腺癌細(xì)胞增殖，而且還可通過降低GPER表達(dá)水平進(jìn)一步促進(jìn)其抑癌效應(yīng)。

針對靶向經(jīng)典雌激素受體治療中遇到的組織選擇性或特異性問題，以及在某些治療中存在的抗藥性問題，目前也迫切需要尋找更好的作用靶點(diǎn)和更廣泛而有效的治療策略來抑制乳腺癌細(xì)胞中的雌激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)體系。隨著對GPER的深入研究和認(rèn)識，以GPER作為靶標(biāo)，為乳腺癌治療提供了新的重要切入點(diǎn)。同時，綜合本研究結(jié)論及課題組先期研究成果，提示靶細(xì)胞內(nèi)ERα、ERβ含量及比值的變化必須與GPER的改變情況及其介導(dǎo)效應(yīng)綜合考慮，才能對雌激素樣活性調(diào)節(jié)成分影響細(xì)胞增殖、發(fā)揮雌激素樣效應(yīng)的最終結(jié)果、趨勢和程度進(jìn)行較為全面的分析和預(yù)測，為臨床婦科腫瘤的治療提供更加可靠的實驗依據(jù)。

（致謝：本文實驗在北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物化學(xué)實驗室完成，謹(jǐn)此致謝?。?/p>

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Research on anti T47D breast cancer activity and its G protein-coupled estrogen receptor pathway of tanshinone IIA

ZHAO Pi-wen，ZANG Jin-feng，TAO Shi-ying，CHEN Meng，NIU Jian-zhao
（School of Preclinical Medicine，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China）

Abstract：Aim To explore the effects of tanshinone IIA on cell proliferation via G protein-coupled estrogen receptor inductive and regulative pathway in typical es-trogen receptor and G protein-coupled estrogen receptor positive T47D breast cancer cells．Methods The pro-liferation rate of T47D cells influenced by tanshinone IIA was analyzed by MTT assay．G protein-coupled es-trogen receptor agonist G1 and GPER antagonist G15 were employed as tools．GPER SiRNA was applied to build GPER gene silence T47D cells．GPER expres-sion influenced by tanshinone IIA was measured by Western blot．Results The proliferation rates of T47D cells treated with 1×10－5mol·L－1－1×10－7mol· L－1of tanshinone IIA were decreased significantly． Such effects could be attenuated by G1 or enhanced by G15．Growth of GPER SiRNA transfected T47D cells were significantly inhibited by 1×10－5mol·L－1－1 ×10－7mol·L－1of tanshinone IIA treating．Result of Western blot showed that tanshinone IIA at 1×10－5mol·L－1and 1×10－6mol·L－1could induce de-crease of GPER protein expression in T47D cells．Conclusions Tanshinone IIA shows inhibitory effects on proliferation rate of T47D breast cancer cells via GPER pathway．Tanshinone IIA could perform regula-tive function on GPER expression level in target cells．

Key words：tanshinone IIA；breast cancer；T47D cell；cell proliferation；G protein-coupled estrogen re-ceptor；estrogen receptor；gene silence

作者簡介：趙丕文（1967－），女，博士，教授，研究方向：婦科常用中藥的作用機(jī)制，Tel：010-64286976，E-mail：pwzhao＠263．net；牛建昭（1945－），女，碩士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合防治重大疾病的基礎(chǔ)，通訊作者，Tel：010-64286813，E-mail：niujjzz＠263．net

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目（No 81273887）；高等學(xué)校創(chuàng)新引智計劃（No B07007）；北京中醫(yī)藥大學(xué)自主科研課題（No JYBZZ-JS014）

收稿日期：2015－05－11，修回日期：2015－07－14

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1001－1978（2015）10－1458－05

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．10．026