謝秀利，洪海棉，賴文芳，張小琴，洪桂祝

（福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建福州 350122）

紅景天苷對(duì)大腦中動(dòng)脈閉塞模型大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用

謝秀利，洪海棉，賴文芳，張小琴，洪桂祝

（福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建福州 350122）

中國圖書分類號(hào)：R－332；R284．1；R322．81；R363－332；R394.2；R743.310.1

摘要：目的 探討紅景天苷（salidroside，Sal）對(duì)MCAO模型大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用。方法 健康成年，♂，SD大鼠45只，隨機(jī)分成3組：假手術(shù)組（sham）、模型對(duì)照組（MCAO），紅景天苷給藥組（MCAO＋Sal），采用線栓法制作大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞模型（middle cerebral artery occlusion，MCAO），連續(xù)給藥6 d，同時(shí)評(píng)價(jià)神經(jīng)功能損傷，檢測腦梗死體積，基因芯片分析，檢測caspase-3、cleaved caspase-3蛋白和IL-6、Vgf、Hba-a2、Hbb-b1、Hbb、CD44、Pnpla2、Slc6a5、Slc5a7的基因表達(dá)。結(jié)果 與MCAO組比較，紅景天苷能明顯改善大鼠的神經(jīng)功能損傷，降低腦梗死體積；抑制cleaved caspase-3蛋白和IL-6基因的表達(dá)；并能夠促進(jìn)Vgf、Hba-a2、Hbb-b1、Hbb基因的表達(dá)，能夠降低CD44、Pnpla2、Slc6a5、Slc5a7基因的表達(dá)。結(jié)論 紅景天苷能夠降低MCAO模型大鼠神經(jīng)功能評(píng)分，減少腦梗死體積，具有神經(jīng)保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與促進(jìn)Vgf、Hba-a2、Hbb-b1、Hbb的表達(dá)和下調(diào)cleaved caspase-3、IL-6、CD44、Pnpla2、Slc6a5、Slc5a7的表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：紅景天苷；腦缺血／再灌注損傷；聚類分析；基因芯片；炎癥；細(xì)胞凋亡；神經(jīng)保護(hù)

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2015－9－14 14：53 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150914．1453．050．html

腦缺血／再灌注損傷是一種以氧化應(yīng)激反應(yīng)亢進(jìn)造成可逆性腦缺血損傷加重，或使可逆性腦損傷轉(zhuǎn)化為不可逆性損傷的病理過程［1］，國內(nèi)外研究者對(duì)其機(jī)制進(jìn)行了大量的研究并取得一定進(jìn)展，但仍缺乏有針對(duì)性的治療策略［2－3］，即使是目前唯一獲得美國FDA臨床治療腦卒中的組織型纖維蛋白激活劑（tPA）也存在治療有效時(shí)間短，治療窗窄的問題。

紅景天苷（salidroside，Sal）是景天科植物紅景天的主要有效成分，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，Sal能夠抑制細(xì)胞凋亡，增加Nissl細(xì)胞的陽性數(shù)［4］。本研究旨在通過基因芯片結(jié)果，探討Sal對(duì)大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞模型（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型大鼠神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制。

1　材料

1．1藥品與試劑 紅景天苷（由北京大學(xué)提供，純度為98%）；2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）（Sig-ma，貨號(hào)T8877）；SYBR Select Master Mix（Applied Biosystems，貨號(hào)R11022）；RNeasyMini Kit（Qia-gen，貨號(hào)74106）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Fermentas，貨號(hào)K1622）；caspase-3抗體（Cell Signaling Technology，貨號(hào)9665）；cleaved caspase-3抗體（Cell Signaling Technology，貨號(hào)9661）；β-actin抗體（碧云天生物技術(shù)研究所，貨號(hào)H105）。PCR引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，參照GenBank中大鼠IL-6、Vgf、Hba-a2、Hbb-b1、Hbb、CD44、Pnpla2、Slc6a5、Slc5a7、GAPDH的引物序列，IL-6引物上游序列5′-AGACT-TCACAGAGGATACCACCCAC-3′；下游序列5′-CAATCAGAATTGCCATTGCACAA-3′，PCR擴(kuò)增片段長度為129 bp。Vgf引物上游序列5′-GCCCTCG-GTCCCTTCTCA-3′；下游序列5′-GGCCAGCCGCTCT-TCTTG-3′，PCR擴(kuò)增片段長度為304 bp。Hba-a2引物上游序列5′-CAGGTCAAGGCTCACGGCAA-3′；下游序列5′-AGCAGGCAGTGGCTCAGGAA-3′，PCR擴(kuò)增片段長度為158 bp。Hbb-b1引物上游序列5′-GCCAGTCTGCTGATTGTCTACCC-3′；下游序列5′-AGTTCACTGAGGCTGGCAAAGG-3′，PCR擴(kuò)增片段長度為188 bp。Hbb引物上游序列5′-CCTGAT-GATGTTGGTGGCGAG-3′；下游序列5′-GCCATCATT-GAAGGCGTTTATC-3′，PCR擴(kuò)增片段長度為165 bp。CD44引物上游序列5′-TGAGAATGAATG-GCAGGGGAA-3′；下游序列5′-CTTGTCCCATTG-GATGTGAGATT-3′，PCR擴(kuò)增片段長度為176 bp。Pnpla2引物上游序列5′-GAACCAACCCAACCCTTT-GCT-3′；下游序列5′-AGGGTGGTCATCAG-

GTCTTTCG-3′，PCR擴(kuò)增片段長度為183 bp。Slc6a5引物上游序列5′-TTGTCAGCGGGAGT-GAAGAGTA-3′；下游序列5′-CAGGACGACATAAG-GAAGGTG-3′，PCR擴(kuò)增片段長度為200 bp。Slc5a7引物上游序列5′-AGACCCGTTTCAACAGATCTAT-GG-3′；下游序列5′-GAATGGCAATGAGTGCGGAGA-3′，PCR擴(kuò)增片段長度為176 bp。GAPDH引物上游序列5′-CAACGGGAAACCCATCACCA-3′；下游序列5′-ACGCCAGTAGACTCCACGACAT-3′，PCR擴(kuò)增片段長度為96 bp。

1．2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠45只，♂，SPF級(jí)，體質(zhì)量（280±20）g，由福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，合格證號(hào)：2007000509960，許可證號(hào)：SCXK（滬）2007－0005，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后用于實(shí)驗(yàn)。

1．3儀器 凝膠成像分析系統(tǒng)（BioRad，型號(hào)ChemiDocXRS＋）；熒光定量PCR儀（美國Applied Biosystems公司，型號(hào)7900HT）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒，型號(hào)DHP-9052）；快速混勻器（常州國華電器，型號(hào)SK-1）；高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)（Thermo Fisher，型號(hào)PrimoR）；PCR儀（美國Bio-rad公司，型號(hào)C1000）

2　方法

2．1分組及給藥方法 實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分成3組（n ＝15）：假手術(shù)組（sham）、模型對(duì)照組（MCAO），紅景天苷給藥組（MCAO＋Sal），同時(shí)，在栓塞2 h后分別腹腔注射生理鹽水和紅景天苷（50 mg· kg－1）［1，4］，連續(xù)給藥6 d，于末次給藥4 h后，取腦，用于實(shí)驗(yàn)。

2．2造模 大鼠腹腔注射10%水合氯醛（3 mL· kg－1體質(zhì)量），沿頸部正中切開皮膚，暴露左總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈，將甲聚硅氧烷涂層的尼龍單絲從左頸總動(dòng)脈插入到大腦中動(dòng)脈的起始端。栓塞2 h后，將尼龍單絲拔出。假手術(shù)動(dòng)物進(jìn)行相同的操作，除了不栓塞中腦動(dòng)脈。

2．3大鼠神經(jīng)功能評(píng)分、腦梗死體積測定的統(tǒng)計(jì)按照Longa神經(jīng)行為缺損評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，0級(jí)，無缺陷；1級(jí)，不能伸展對(duì)側(cè)前肢；2級(jí)，對(duì)側(cè)前肢屈曲；3級(jí)，輕度向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；4級(jí)，嚴(yán)重的轉(zhuǎn)圈；5級(jí)，對(duì)側(cè)癱瘓。神經(jīng)功能缺損評(píng)分在3～4級(jí)為模型成功，評(píng)分過程至少由2人參與完成。

連續(xù)給藥6 d后，取大鼠腦組織，在視交叉及其前后各2 mm處，做冠狀切片，置于TTC中避光37℃孵育30 min。正常組織被染成玫瑰紅色，而梗死組織呈白色。染色后對(duì)組織進(jìn)行拍照，采用圖像分析計(jì)算梗死體積。

2．4大鼠腦組織caspase-3、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)的檢測 提取總蛋白，采用SDS-PAGE電泳，總蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離后，將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用封閉液封閉2 h后加入一抗（caspase-3抗體稀釋比例為1∶500，cleaved caspase-3抗體稀釋比例為1∶500，β-actin抗體稀釋比例為1∶5 000），4℃下孵育過夜，次日TBS洗3遍每次10 min加入1∶1 000稀釋HRP標(biāo)記的第二抗體，室溫下孵育2 h 后TBS洗膜。之后加ECL顯色劑經(jīng)凝膠成像分析系統(tǒng)檢測，分析目標(biāo)條帶的灰度值，分別計(jì)算各組與β-actin灰度值的比值，并統(tǒng)計(jì)各組之間的差異。

2．5大鼠基因芯片檢測 大鼠基因芯片由上?？党缮锛夹g(shù)有限公司檢測。

2．6大鼠基因水平檢測 根據(jù)RNeasyMini Kit提取組織總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，通過熒光定量PCR檢測各基因的表達(dá)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性10 min，95℃變性15 s，退火60℃15 s，40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參計(jì)算2－ΔΔCt值。

2．7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)用±s表示，除了神經(jīng)損傷評(píng)分分析（非參數(shù)檢驗(yàn)，Mann-Whitney test），其余各組數(shù)據(jù)間比較采用ANOVA方法分析。

3　結(jié)果

3．1紅景天苷對(duì)MCAO模型大鼠神經(jīng)功能損傷、腦梗死體積的影響 與sham組比較，MCAO組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分和腦梗死體積明顯增大，且差異有顯著性（P＜0.01）；與MCAO組比較，紅景天苷給藥6 d，能明顯降低MCAO大鼠的神經(jīng)功能評(píng)分，能明顯減少腦梗死體積，且差異有顯著性（P＜0.01）（Fig 1）。

3．2紅景天苷對(duì)MCAO模型大鼠caspase-3、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)和IL-6基因表達(dá)的影響與sham組比較，MCAO組大鼠cleaved caspase-3蛋白和IL-6 mRNA的表達(dá)明顯升高，且差異有顯著性（P＜0.01）；與MCAO組比較，紅景天苷給藥6 d后，能夠明顯降低cleaved caspase-3蛋白和IL-6 mR-NA的表達(dá)，且差異有顯著性（P＜0.01）（Fig 2）。

3．3紅景天苷對(duì)MCAO模型大鼠基因芯片的影響 采用基因芯片方法分析腦組織基因表達(dá)圖譜，發(fā)現(xiàn)紅景天苷能逆轉(zhuǎn)MCAO所引起的基因表達(dá)的變化，更重要的是，它能促進(jìn)一系列與神經(jīng)保護(hù)的基

因表達(dá)（Fig 3）?；蛐酒Y(jié)果均存放在開放數(shù)據(jù)庫NCBI GEO：GSE52001。

Fig 1 Effects of salidroside treatment on neurological score（A）and infarct size（B）in MCAO rats（n＝6）

3．4紅景天苷對(duì)MCAO模型大鼠Vgf、Hba-a2、Hbb-b1、Hbb基因的影響 與sham組比較，MCAO組大鼠Vgf、Hba-a2、Hbb-b1 mRNA的表達(dá)明顯降低，且差異有顯著性（P＜0.01），MCAO組大鼠Hbb mRNA的表達(dá)也降低，且差異有顯著性（P＜0.05）；與MCAO組比較，紅景天苷給藥6 d后，能夠明顯提高Vgf mRNA的表達(dá)，且差異有顯著性（P＜0.01），同時(shí)也能提高Hba-a2、Hbb-b1、Hbb mRNA的表達(dá)，且差異有顯著性（P＜0.05）（Fig 4）。

3．5紅景天苷對(duì)MCAO模型大鼠CD44、Pnpla2、Slc6a5、Slc5a7基因的影響 與sham組比較，MCAO組大鼠CD44、Pnpla2、Slc6a5、Slc5a7 mRNA的表達(dá)明顯降低且差異有顯著性（P＜0.01）；與MCAO組比較，紅景天苷給藥6 d后，能夠降低CD44、Pnpla2 mRNA的表達(dá)，且差異有顯著性（P＜0.05），同時(shí)也能夠降低Slc6a5、Slc5a7 mRNA的表達(dá)，且差異有顯著性（P＜0.01）（Fig 5）。

Fig 2 Effects of salidroside treatment on caspase-3，cleaved caspase-3 protein（A）and IL-6 mRNA（B）in MCAO rats（n＝6）

Fig 3 Difference in expressions of related neuroprotective genes be-tween salidroside treatment and MCAO rats in cluster analysis

4　討論

Fig 4 Effects of salidroside treatment on Vgf（A），Hba-a2（B），Hbb-b1（C），Hbb（D）mRNA in MCAO rats（n＝6）

本研究發(fā)現(xiàn)紅景天苷能夠促進(jìn)MCAO模型大鼠Vgf、Hba-a2、Hbb-b1、Hbb基因的表達(dá)水平。Vgf是一種由神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞表達(dá)的多肽，不僅廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)中，且在嗅覺系統(tǒng)、大腦皮質(zhì)、下丘腦、海馬也有大量Vgf mRNA表達(dá)［5］，有研究表明，Vgf具有增加海馬突觸的可塑性、增強(qiáng)海馬齒狀回神經(jīng)元的增殖和再生作用［6］。腦對(duì)缺血缺氧損傷極為敏感，Hba-a2、Hbb-b1、Hbb是血紅蛋白（hemoglobin，Hb）的亞基，Hb對(duì)氧的結(jié)合、貯存、運(yùn)輸、釋放具有重要的生理作用，其亞基與氧的結(jié)合能力有關(guān)。有文獻(xiàn)報(bào)道，在高原上生存的生物有依靠增加Hb的量來適應(yīng)低氧環(huán)境，也有通過改善Hb結(jié)構(gòu)與功能來增強(qiáng)對(duì)氧的親和力［7］。

Caspases是細(xì)胞凋亡過程中最重要的蛋白酶，凋亡的最后實(shí)施是通過caspases的激活而實(shí)現(xiàn)的。而caspase-3是caspases級(jí)聯(lián)反應(yīng)中下行的最關(guān)鍵的凋亡執(zhí)行蛋白酶，caspase-3正常以酶原的形式存

在于胞質(zhì)中，在凋亡的早期階段，它被激活，活化的caspase-3由兩個(gè)大亞基和兩個(gè)小亞基組成［8］。缺血后的腦損傷通常伴隨著炎癥反應(yīng)的發(fā)生并介導(dǎo)繼發(fā)性的腦損傷。IL-6是與早期神經(jīng)功能惡化和預(yù)后不良有關(guān)的炎癥因子，張艷麗等［9］發(fā)現(xiàn)在腦缺血／再灌注損傷的海馬組織中IL-6的含量明顯增加。CD44是單基因編碼的一種細(xì)胞膜表面糖蛋白，屬于黏附分子家族，主要表達(dá)于中性粒細(xì)胞，在器官形成和組織修復(fù)過程中對(duì)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與基質(zhì)之間的黏附有著重要的作用［10］。CD44還作為一種激活分子使炎癥介質(zhì)表達(dá)并促進(jìn)炎癥的發(fā)生［11］。在腦缺血情況下，容易出現(xiàn)能量代謝障礙。ATGL（adi-pose triglyceride lipase）是脂肪甘油三酯脂肪酶，又稱為Pnpla2，是一種催化甘油三酯第一步水解的重要脂肪酶，在機(jī)體能量代謝調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用［12］。Slc6a5（solute carrier family 6，member 5）是一種神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體，與神經(jīng)功能有關(guān)。Slc5a7 （solute carrier family 5，member 7）是一種膽堿轉(zhuǎn)運(yùn)體，參與乙酰膽堿的合成和釋放。乙酰膽堿是中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)遞質(zhì)，具有調(diào)節(jié)認(rèn)知和運(yùn)動(dòng)功能［13］。本研究發(fā)現(xiàn)紅景天苷能夠降低MCAO模型大鼠cleaved caspase-3蛋白及IL-6、CD44、Pnpla2、Slc6a5、Slc5a7基因的表達(dá)水平。

Fig 5 Effects of salidroside treatment on CD44（A），Pnpla2（B），Slc6a5（C），Slc5a7（D）mRNA in MCAO rats（n＝6）

綜上所述，紅景天苷能夠降低MCAO模型大鼠神經(jīng)功能評(píng)分，減少腦梗死體積，具有神經(jīng)保護(hù)作用，此作用可能與促進(jìn)突觸可塑性相關(guān)因子Vgf及氧運(yùn)輸相關(guān)因子Hba-a2、Hbb-b1、Hbb的表達(dá)，抑制凋亡因子cleaved caspase-3，炎癥因子IL-6、CD44，能量代謝相關(guān)基因Pnpla2及神經(jīng)遞質(zhì)相關(guān)基因Slc6a5、Slc5a7的表達(dá)有關(guān)。

（致謝：本實(shí)驗(yàn)在福建省中藥學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成，感謝實(shí)驗(yàn)室的老師對(duì)本實(shí)驗(yàn)的幫助與指導(dǎo)。）

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Protective effects of salidroside in MCAO rats

XIE Xiu-li，HONG Hai-mian，LAI Wen-fang，ZHANG Xiao-qin，HONG Gui-zhu
（College of Pharmacy，F(xiàn)ujian University of Tranditional Chinese Medicine，F(xiàn)uzhou 350122，China）

Abstract：Aim To investigate the neuroprotective effect of salidroside in MCAO rats．Methods The rats were subjected to middle cerebral artery occlusion with suture-occluded method，and the neurologic injury and infarct size of rats were evaluated．According to the gene chip detected，the protein expressions of caspase-3，cleaved caspase-3 were determined and the mRNA expressions of IL-6，Vgf，Hba-a2，Hbb-b1，Hbb，CD44，Pnpla2，Slc6a5 and Slc5a7 were tested．Re-sults Compared with MCAO group，salidroside signif-icantly improved the neurological deficit，reduced the infarct sizes，inhibited the expressions of cleaved caspase-3 protein and IL-6 mRNA，promoted the ex- pressions of Vgf，Hba-a2，Hbb-b1，Hbb，and reduced the expressions of CD44，Pnpla2，Slc6a5 and Slc5a7．Conclusions Salidroside can reduce the neurological deficit and infarct size，and protect rats against focal cerebral ischemia-reperfusion injury，which may be ac-complished by increasing the expressions of Vgf，Hba-a2，Hbb-b1，and Hbb，and decreasing the expressions of cleaved caspase-3，IL-6，CD44，Pnpla2，Slc6a5 and Slc5a7．

Key words：salidroside；cerebral ischemia-reperfusion injury；Cluster analysis；gene chip；inflammation；cell apoptosis；neuroprotection

作者簡介：謝秀利（1990－），女，碩士生，研究方向：藥理學(xué)，E-mail：1114298539＠qq．com；洪桂祝（1966－），女，博士，教授，研究方向：心腦血管藥效藥理，通訊作者，E-mail：laiwenfang08＠163．com

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助課題（No 81473382）；福建省科技廳重點(diǎn)項(xiàng)目（No 2014Y4004）；福建省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No 2015J01328）

收稿日期：2015－06－23，修回日期：2015－07－20

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001－1978（2015）10－1452－06

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．10．025