王涵翰 張尚霞 王宇紅 劉平安 趙洪慶 吳夢(mèng)瑤 劉檢 唐榮穗

〔摘要〕 目的 觀察左歸降糖解郁方對(duì)糖尿病并發(fā)抑郁癥（diabetes mellitus with depression， DD）大鼠海馬神經(jīng)血管單元（neurovascular unit， NVU）體外共培養(yǎng)體系的神經(jīng)元微小興奮性突觸后電流（miniature excitatory postsynaptic currents， mEPSC）頻率及幅度的影響，探討其對(duì)海馬NVU培養(yǎng)體系的保護(hù)機(jī)制。方法 有效構(gòu)建海馬NVU體外培養(yǎng)體系，采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色法進(jìn)行細(xì)胞鑒定;采用高糖（150 mmol/L）聯(lián)合皮質(zhì)酮（200 μmol/L）干預(yù)構(gòu)建海馬NVU細(xì)胞模型;采用全細(xì)胞膜片鉗記錄NVU體外共培養(yǎng)體系神經(jīng)元mEPSC，比較各組NVU培養(yǎng)體系神經(jīng)元mEPSC頻率和電流幅度。結(jié)果 經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定，NVU培養(yǎng)體系中細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整。與正常組和空白血清組相比，模型組大鼠海馬NVU培養(yǎng)體系神經(jīng)元mEPSC的頻率和幅度均顯著上升（P<0.01）;與模型組相比，左歸降糖解郁方血清組和陽性藥血清組大鼠海馬NVU體外培養(yǎng)體系神經(jīng)元mEPSC的頻率和幅度均顯著下降（P<0.01）;與陽性藥血清組相比，左歸降糖解郁方血清組大鼠NVU細(xì)胞培養(yǎng)體系神經(jīng)元mEPSC頻率和幅度差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論 左歸降糖解郁方可降低DD大鼠海馬NVU體外培養(yǎng)體系神經(jīng)元mEPSC的頻率和幅度，對(duì)海馬NVU培養(yǎng)體系的具有調(diào)控作用。

〔關(guān)鍵詞〕 糖尿病;抑郁癥;左歸降糖解郁方;微小興奮性突出后電流;膜片鉗

〔中圖分類號(hào)〕R285.5 ? ? ? 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A ? ? ? 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2020.07.009

〔Abstract〕 Objective To observe the effects of Zuogui Jiangtang Jieyu Recipe on the frequency and amplitude of miniature excitatory postsynaptic currents （mEPSC） in the hippocampal neurovascular unit （NVU） co-culture system in rats with diabetes mellitus with depression （DD）， and to explore its protection mechanism for hippocampal NVU culture system. Methods The hippocampal NVU in vitro co-culture system was constructed efficiently. Cell identification was performed by immunocytochemical staining. Hippocampus NVU cell model was constructed by high glucose （150 mmol/L） combined with corticosterone （200 μmol/L）; The whole cell patch clamp was used to record the mEPSC of NVU in vitro co-culture system， and the mEPSC frequency and current amplitude of neurons in NVU culture system were compared. Results The cell structure of NVU culture system was complete by NSE immunocytochemistry. Compared with the normal group and blank serum group， the frequency and amplitude of mEPSC in the hippocampal NVU in vitro co-culture system of the model group were significantly increased （P<0.01）. Compared with the model group， the frequency and amplitude of mEPSC in the hippocampal NVU co-culture system of the Zuogui Jiangtang Jieyu Recipe serum group and the positive drug serum group were significantly decreased （P<0.01）. Compared with the positive drug serum group， there was no significant difference in the frequency and amplitude of mEPSC in the neurons of the NVU cell culture system in the Zuogui Jiangtang Jieyu Recipe serum group （P>0.05）. Conclusion Zuogui Jiangtang Jieyu Recipe can reduce the frequency and amplitude of neuronal mEPSC in hippocampal NVU culture system of rats with DD， and has a regulation effect on hippocampal NVU culture system.

〔Keywords〕 diabetes mellitus; depression; Zuogui Jiangtang Jieyu Recipe; miniature excitatory postsynaptic currents; patch clamp

糖尿病是一種常見的代謝障礙疾病，根據(jù)2016年世界衛(wèi)生組織發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，全球估計(jì)有4.22億成年人患有糖尿病，發(fā)病率為8.3%，且發(fā)病率逐年上升[1]。隨著人們生活水平的提高和生活方式的改善，糖尿病并發(fā)癥不斷增加，而糖尿病并發(fā)抑郁癥（diabetes mellitus with depression， DD）作為其中的一種，其全球患病率在25%～35%之間;研究表明，DD是非糖尿病患者的兩倍，且女性抑郁癥的患病率要高于男性[2]。目前，研究DD已由單一的海馬神經(jīng)元擴(kuò)展到結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜的海馬神經(jīng)血管單元（neurovascular unit， NVU），該結(jié)構(gòu)由神經(jīng)元（neuron，Ne）、星形膠質(zhì)細(xì)胞（astrocyte， As）、血腦屏障微血管（microvessel， Ve）和細(xì)胞外基質(zhì)的基底層等組成，可維持腦組織的完整性。Ve作為NVU的核心結(jié)構(gòu)，主要組成是腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（brain microvascular endothelial cell， Bm）[3]。Ne處于異常亢奮狀態(tài)時(shí)，增加細(xì)胞外谷氨酸水平，谷氨酸作為海馬區(qū)的重要神經(jīng)遞質(zhì)，可以激活A(yù)s，As具有調(diào)節(jié)胞外谷氨酸水平相對(duì)穩(wěn)定的功能[4]，而腦損傷的As也會(huì)釋放谷氨酸，并作用于Ne和Bm，發(fā)生Ne死亡和血腦屏障破壞[5]。膜片鉗技術(shù)是一種通過微電極與細(xì)胞膜之間形成緊密接觸的方法，采用電壓鉗或電流鉗技術(shù)對(duì)生物膜上離子通道的電活動(dòng)進(jìn)行記錄的微電極技術(shù)，本文利用該技術(shù)檢測(cè)NVU體外培養(yǎng)體系神經(jīng)元微小興奮性突觸后電流（miniature excitatory postsynaptic currents， mEPSC），探討DD大鼠海馬NVU神經(jīng)元突出后電流異常情況，研究左歸降糖解郁方對(duì)海馬NVU體系的保護(hù)機(jī)制。

1 材料

1.1 ?動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠1只，雌性，受孕17～19 d，體質(zhì)量350～450 g;SPF級(jí)SD大鼠12只，雌雄各半，3 d和7 d，體質(zhì)量60～70 g和90～100 g;SD大鼠16只，雌雄各半，25～28 d，體質(zhì)量180～220 g，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（湘）2016-0002。購入動(dòng)物后雌性受孕大鼠用于海馬神經(jīng)元原代取材，未受孕大鼠飼養(yǎng)在光暗交替周期為12/12 h、相對(duì)濕度50%±5%、溫度（25±2） ℃的湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.2 ?藥物

左歸降糖解郁方，處方為：山茱萸12 g，貫葉連翹3 g，黃芪18 g，熟地黃15 g，杜仲9 g，枸杞子12 g，姜黃9 g，丹參12 g，菟絲子9 g，牛膝9 g，牡丹皮6 g。飲片均購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，由制劑科按照相應(yīng)比例水提藥物并濃縮藥液，最終定容濃度為1.14 g/mL;鹽酸二甲雙胍片，0.25 g/片，湖南湘雅制藥有限公司，批號(hào)1710215;鹽酸氟西汀膠囊，20 mg/粒，法國(guó)Patheon公司，批號(hào)6663B。

1.3 ?主要試劑與儀器

胰蛋白酶、Ⅰ型膠原酶（美國(guó)Amresco公司）;兔抗大鼠NSE抗體[中國(guó)Bioworld安諾論（北京）生物科技有限公司]，小鼠抗大鼠β-tublin抗體、兔抗大鼠GFAP抗體、FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG（美國(guó) Proyeintech公司）;印防己毒素（PTX）和河豚毒素（TTX）（美國(guó)Sigma公司）。玻璃微電極（美國(guó)Sutter Instrument公司）;PC-10微電極拉制儀（日本Narishige公司）;倒置顯微鏡（德國(guó)ZEISS）;微電極操縱器（美國(guó)Sutter Instrument公司）;PClamp 10軟件（美國(guó)Axon Instruments公司）、Diigidata1440A實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)、膜片鉗放大器Axonpatch 700B、OPERETTA型高內(nèi)涵成像分析系統(tǒng)（美國(guó)PerkinElmer公司）。

2 方法

2.1 ?構(gòu)建海馬NVU體外培養(yǎng)體系

2.1.1 ?Bm的提取及體外培養(yǎng) ?選擇新生7 d的SD大鼠，迅速取出大腦，去除多余組織，洗滌剪碎的大腦皮質(zhì)后1 200 r/min離心3 min，重懸細(xì)胞沉淀后2 500 r/min離心8 min，消化細(xì)胞沉淀后1 200 r/min離心5 min，重懸，計(jì)數(shù)并稀釋細(xì)胞，接種于培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)24 h后半量換液，之后2～3 d半量換液，細(xì)胞足夠稠密時(shí)需消化傳代。

2.1.2 ?As的提取及體外培養(yǎng) ?選擇新生3 d的SD大鼠，迅速取出大腦，去除多余組織，消化分離大腦皮質(zhì)，終止消化后1 200 r/min離心5 min，重懸細(xì)胞沉淀，滅菌后1 000 r/min離心5 min，重懸細(xì)胞沉淀，滅菌后稀釋細(xì)胞，接種于培養(yǎng)瓶中，在培養(yǎng)箱中黏附30～40 min后輕柔翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，并將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到另一個(gè)培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，之后每3天半量換液，細(xì)胞足夠稠密時(shí)需消化傳代，并使用差速黏壁和震蕩相結(jié)合的方法純化細(xì)胞。

2.1.3 ?Ne的提取及體外培養(yǎng) ?選擇受孕17～19 d的SD大鼠，迅速取出胎鼠，解剖并分離出海馬，潤(rùn)洗后剪碎，消化，取上清滅菌后1 200 r/min離心5 min，棄上清重懸細(xì)胞沉淀，滅菌后重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)并稀釋細(xì)胞，接種于培養(yǎng)瓶中，4 h后全量換成維持液，之后每3 天半量換液。

2.1.4 ?構(gòu)建海馬NVU體外培養(yǎng)體系 ?將Ne放置在培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)5～7 d，備用。將As接種于Transwell小室外側(cè)，黏附40～50 min，將小室翻轉(zhuǎn)180°，轉(zhuǎn)移到提前接種Ne的細(xì)胞培養(yǎng)板中，共培養(yǎng)1～2 d。將Bm接種于共培養(yǎng)的Transwell小室內(nèi)側(cè)，共培養(yǎng)1～3 d，此時(shí)便將海馬NVU體外培養(yǎng)體系構(gòu)建成功。

2.2 ?海馬NVU體外培養(yǎng)體系鑒定

取體外培養(yǎng)的Ne、As、Bm，固定靜置封閉，分別加兔抗大鼠NSE、GFAP、PECAM-1，以及小鼠抗大鼠β-tublin 4 ℃避光孵育過夜。分別加對(duì)應(yīng)的FITC標(biāo)記的山羊抗兔、RP-E標(biāo)記的山羊抗小鼠37 ℃避光孵育，加DAPI稀釋液常溫避光孵育，各共培養(yǎng)體系添加50 L的PBS，體視顯微鏡和高內(nèi)涵細(xì)胞成像分析技術(shù)（high content analysis， HCA）鑒定。

2.3 ?含藥血清制備

實(shí)驗(yàn)大鼠根據(jù)性別和體質(zhì)量隨機(jī)分為正常組、中藥組和陽性藥組，陽性藥組灌胃臨床等效劑量的二甲雙胍（0.18 g/kg）+氟西?。?.8 mg/kg）[6]，中藥組灌胃等效劑量3倍的左歸降糖解郁方（32.82 g/kg），正常組灌胃等容量蒸餾水，每日灌胃2次，連續(xù)灌胃3 d，末次給藥1 h后腹主動(dòng)脈采血，離心后取上清56 ℃滅活30 min，過0.22 m濾膜后梯度降溫并保存在-80 ℃冰箱中備用。

2.4 ?分組、造模及干預(yù)

將構(gòu)建成功的海馬NVU體外培養(yǎng)體系隨機(jī)分為5組，分別為模型組、陽性藥血清組、中藥血清組、正常組和空白血清組。模型組、陽性藥血清組和中藥血清組需要添加高糖（150 mmol/L）和皮質(zhì)酮（200 ？滋mol/L）到共培養(yǎng)體系中，聯(lián)合干預(yù)18 h構(gòu)建DD環(huán)境的海馬NVU聯(lián)動(dòng)損傷細(xì)胞模型[7]，造模期間根據(jù)以上體積的10%分別添加空白血清和含藥血清，正常組和模型組加入等量培養(yǎng)液。

2.5 ?膜片鉗記錄

將構(gòu)建成功的海馬NVU體外培養(yǎng)體系給藥18 h后進(jìn)行膜片鉗記錄，記錄模式為全細(xì)胞記錄模式，記錄大鼠海馬NVU神經(jīng)元 mEPSC，每組選擇8個(gè)較成熟的體系進(jìn)行記錄。在顯微鏡下找到要記錄的細(xì)胞，加入鈉通道阻斷劑TTX和GABA受體拮抗劑PTX，利用微電極操縱器將加入電生理記錄內(nèi)液的玻璃電極下降到外液界面，形成電路通路，調(diào)節(jié)玻璃電極與細(xì)胞形成G封接，緩慢吸氣使細(xì)胞破膜形成全細(xì)胞連接，記錄mEPSCs。全過程通過膜片鉗放大器將記錄的電流信號(hào)放大，經(jīng)由數(shù)模轉(zhuǎn)化器后輸送到計(jì)算機(jī)Clamfit軟件中，自動(dòng)舍去漏電流-200 pA、噪音20 pA和串聯(lián)電阻20 M的電流信號(hào)后進(jìn)行記錄并保存。

2.6 ?統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0和Clamfit軟件，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用“x±s”表示。使用單因素方差分析比較各組間差異，方差齊時(shí)使用LSD檢驗(yàn)法進(jìn)行兩兩比較，方差不齊時(shí)使用Tamhanes T2進(jìn)行兩兩比較。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 ?海馬NVU體系各細(xì)胞形態(tài)特點(diǎn)和免疫熒光鑒定

取成功構(gòu)建的海馬NVU體外培養(yǎng)體系中的Ne、As和Bm進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)鑒定，如圖1-Ⅰ，結(jié)果顯示Ne細(xì)胞胞體折光性較高，突起縱橫交錯(cuò)且相互交織成豐富的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò);As細(xì)胞胞體不明顯，突足細(xì)長(zhǎng)且多;Bm的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)為典型的鋪路石樣。通過免疫化學(xué)染色后測(cè)定HCA，采用熒光顯微鏡拍照，如圖1-Ⅱ，圖中綠色熒光表示陽性表達(dá)，Ne的陽性表達(dá)為NSE，As的陽性表達(dá)為GFAP，Bm的陽性表達(dá)為CD31，由此表明體外培養(yǎng)細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)細(xì)胞。

3.2 ?NVU細(xì)胞培養(yǎng)體系mEPSC記錄結(jié)果

如圖2所示為大鼠NVU細(xì)胞培養(yǎng)體系神經(jīng)元的mEPSC記錄結(jié)果。由圖3-4可知，與正常組和空白血清組相比，模型組大鼠NVU細(xì)胞培養(yǎng)體系神經(jīng)元mEPSC頻率和幅度均明顯提高（P<0.01）;與模型組相比，陽性藥血清組和中藥血清組大鼠NVU細(xì)胞培養(yǎng)體系神經(jīng)元mEPSC頻率和幅度均明顯減少（P<0.01）;與陽性藥血清組相比，中藥血清組大鼠NVU細(xì)胞培養(yǎng)體系神經(jīng)元mEPSC頻率和幅度差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

4 討論

糖尿病并發(fā)抑郁癥是一種繼發(fā)于糖尿病的慢性并發(fā)癥，其患病率是非糖尿病患者的兩倍[8]，然而該病發(fā)病機(jī)制尚未闡明。在糖尿病狀態(tài)下，Ve通透性增加，As對(duì)谷氨酸調(diào)節(jié)障礙，介導(dǎo)海馬Ve-As-Ne間信息傳遞異常、結(jié)構(gòu)功能改變，導(dǎo)致NVU聯(lián)動(dòng)損傷造成海馬的損傷，進(jìn)而誘發(fā)DD。NVU相互聯(lián)系機(jī)制為：（1）Ve-As之間的聯(lián)系：As產(chǎn)生較大的突起或末端，使Bm不脫落，并覆蓋腦毛細(xì)血管的整個(gè)腔表面。研究表明毛細(xì)血管Bm和As足突之間的基底層通過增加神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分泌的可溶性因子的局部濃度來促進(jìn)As和Bm之間的相互作用[9]。（2）As-Ne之間的聯(lián)系：膠質(zhì)細(xì)胞主要的功能是維持Ne的離子環(huán)境，通過控制神經(jīng)遞質(zhì)的攝取來調(diào)節(jié)突觸作用以及在神經(jīng)發(fā)育過程中提供支架，海馬中的As是多能干細(xì)胞，可作為支持干細(xì)胞增殖和成熟的生態(tài)位細(xì)胞。As通過Shh-Gli1信號(hào)介導(dǎo)神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞分化。Wang等[10]研究表明在Ne損傷或炎癥過程中，活化的As可上調(diào)GFAP，主要的組織相容性復(fù)合物II類，以及神經(jīng)調(diào)節(jié)因子等。因此，以大鼠海馬NVU體外培養(yǎng)體系為研究對(duì)象，探討DD大鼠海馬NVU神經(jīng)元突出后電流異常情況。

左歸降糖解郁方以左歸丸為基礎(chǔ)方化裁而成，方中君以熟地黃補(bǔ)益腎陰;臣以山茱萸、枸杞子、菟絲子助君滋補(bǔ)腎陰，姜黃化瘀行氣，貫葉連翹疏肝理氣、健脾養(yǎng)血安神，又可防肝郁日久化火、脾虛生濕，用之可使情志舒暢、肝氣條達(dá)、脾虛得健，丹參、牡丹皮活血祛瘀;佐以黃芪補(bǔ)氣健脾，牛膝、杜仲補(bǔ)肝腎，全方立足滋陰益氣、化瘀解郁之功效。前期通過Ve、As、Bm的體外培養(yǎng)進(jìn)而構(gòu)建海馬NVU體外培養(yǎng)體系，進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)鑒定，證明其NVU培養(yǎng)體系構(gòu)建成功。本課題組前期研究表明，左歸降糖解郁方對(duì)海馬NVU神經(jīng)元自噬及凋亡具有顯著抑制作用，能有效保護(hù)海馬NVU神經(jīng)元細(xì)胞損傷[11]，且能夠改善海馬相關(guān)蛋白的表達(dá)，對(duì)Ve、As、Bm的形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行調(diào)節(jié)，緩解海馬NVU細(xì)胞損傷[12]。然而，海馬NVU體系中的細(xì)胞之間信息互通和物質(zhì)交流等相互作用機(jī)制以及左歸降糖解郁方對(duì)NVU體系的信息傳遞相互作用機(jī)制尚未完全闡明。

海馬NVU體外共培養(yǎng)體系構(gòu)建成功后，細(xì)胞之間進(jìn)行物質(zhì)交流和信息傳遞，形成一個(gè)完整的循環(huán)體系。NVU體系的穩(wěn)態(tài)機(jī)制非常復(fù)雜，Ne可稱為NVU的起搏器，Ne被激活處于興奮狀態(tài)時(shí)釋放谷氨酸鹽，進(jìn)而激活A(yù)s表達(dá)產(chǎn)生的谷氨酸鹽受體并作用于As，As可有效抑制谷氨酸誘導(dǎo)的興奮性毒性，使病理狀態(tài)下的谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)降低，谷氨酰胺合酶的能力降低[13]。腦損傷后As釋放出過量的谷氨酸鹽，激活Ne和Bm谷氨酸鹽受體而參與Ne死亡及血腦屏障的破壞[8]。研究表明，糖尿病大鼠海馬中的谷氨酸顯著增加，谷氨酸作為神經(jīng)遞質(zhì)能夠調(diào)節(jié)大腦中神經(jīng)元活動(dòng)的興奮和抑制，受損的谷氨酸/氨基丁酸信號(hào)誘導(dǎo)抑郁癥的產(chǎn)生[14]?；诖?，本文采用膜片鉗技術(shù)檢測(cè)NVU體外共培養(yǎng)神經(jīng)元mEPSC的頻率及幅度，研究海馬NVU體外共培養(yǎng)體系之間的聯(lián)動(dòng)機(jī)制，并探討左歸降糖解郁方對(duì)該體系的保護(hù)機(jī)制。

采用膜片鉗技術(shù)檢測(cè)NVU體外共培養(yǎng)體系神經(jīng)元mEPSC，結(jié)果表明，模型組大鼠NVU細(xì)胞培養(yǎng)體系神經(jīng)元mEPSC頻率和幅度相較于正常組和空白血清組均顯著提高，表明Ne作用于As的神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸含量顯著提高，使 NVU體系發(fā)生相應(yīng)變化;陽性藥含藥血清組和左歸降糖解郁方含藥血清組與模型組相比，大鼠NVU細(xì)胞培養(yǎng)體系神經(jīng)元

mEPSC頻率和幅度均明顯減少，左歸降糖解郁方含藥血清組相較于陽性藥含藥血清組大鼠NVU細(xì)胞培養(yǎng)體系神經(jīng)元mEPSC頻率和幅度差異不顯著，表明左歸降糖解郁方可改善Ne與As之間的神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸含量，對(duì) NVU體系產(chǎn)生保護(hù)作用。本研究表明左歸降糖解郁方對(duì)DD大鼠海馬NVU體系之間的信息傳遞和物質(zhì)交流具有顯著的調(diào)控作用，證明其對(duì)DD的療效明顯，為臨床研究提供了一定的理論依據(jù)。

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