何思思 高保燕 雷學青 萬凌琳 李愛芬 張成武

(暨南大學生態(tài)學系, 水生生物研究中心, 廣州 510632)

初始硝酸鈉濃度對魏氏真眼點藻的生長、形態(tài)和油脂積累的影響

何思思 高保燕 雷學青 萬凌琳 李愛芬 張成武

(暨南大學生態(tài)學系, 水生生物研究中心, 廣州 510632)

為了確定不同初始氮供應水平對產(chǎn)油微藻——魏氏真眼點藻(Eustigmatos vischeri)生長、形態(tài)和油脂積累的影響, 本研究通過在改良的 BG-11培養(yǎng)基中設置 4種不同的初始硝酸鈉濃度(17.6、11.7、5.9和3.0 mmol/L)對魏氏真眼點藻(E. vischeri)進行培養(yǎng)。觀察結果表明, 魏氏真眼點藻(E. vischeri)的營養(yǎng)細胞為一具裂葉狀葉綠體、細胞質中有一紅色素體和許多振動顆粒及光滑細胞壁的球形單細胞; 細胞繁殖方式主要是形成二分裂和四分裂的似親孢子。在低氮條件下, 隨著培養(yǎng)時間的延長, 細胞內油體逐步形成, 至培養(yǎng)末期占據(jù)細胞的大部分空間, 同時培養(yǎng)物的顏色也由綠色向黃綠色轉變, 最終呈橙黃色。實驗結果表明, 魏氏真眼點藻(E. vischeri)生物質濃度在17.6 mmol/L組獲得最大值為9.14 g/L; 總脂、中性脂和總脂肪酸三者占干重的含量隨著初始硝酸鈉濃度的降低而升高, 在 3.0 mmol/L組獲得最高值, 分別為 60.81%、56.59%和53.47%; 三者的單位體積產(chǎn)率均在5.9 mmol/L組獲得最高值, 分別為0.24、0.21和0.20 g/(L·d); 主要脂肪酸組成為棕櫚酸(C16:0)、棕櫚油酸(C16:1)、油酸(C18:1)和二十碳五烯酸(C20:5ω3, EPA), 其中棕櫚油酸的含量最高。上述研究表明, 魏氏真眼點藻(E. vischeri)是一株適合于生產(chǎn)生物柴油和長鏈不飽和脂肪酸EPA的高產(chǎn)油微藻。

魏氏真眼點藻; 硝酸鈉; 生物質濃度; 總脂; 脂肪酸; 單位體積產(chǎn)率

微藻作為第三代生物柴油的生產(chǎn)原料, 具有傳統(tǒng)油料作物所沒有的優(yōu)點, 例如生長速率快、油脂含量高以及產(chǎn)生高附加值產(chǎn)物等, 從而成為國內外研究的熱點[1—3]。在脅迫條件下, 一些富油微藻細胞內可合成并積累大量的油脂(主要是三酰甘油, TAGs), 約占細胞干重的20%—50%, 有的甚至可高達70%—90%[4,5]。目前, 研究報道的富油微藻主要集中在小球藻屬(Chlorella spp.)[6,7]、柵藻屬(Scenedesmus spp.)[8]、杜氏鹽藻屬(Dunaliella spp.)[9]、擬微綠球藻屬(Nannochloris spp.)[10]、缺刻緣綠藻(Parietochloris incisa)[11]、富油新綠藻(Neochloris oleoabundans)[12]及布朗叢粒藻(Botryococcus braunii)[13]等。不同屬或種微藻之間的生長和油脂含量存在較大差異[4]。在通常情況下, 培養(yǎng)基中的大量營養(yǎng)因子如碳、氮、磷和硫以及微量元素如鐵等營養(yǎng)成分的改變會引起微藻細胞內油脂積累的變化[14,15]; 另外, 溫度、光照強度、pH和鹽度等環(huán)境因子的脅迫也能改變微藻細胞的油脂積累量[16—18]。除此之外, 培養(yǎng)周期對微藻細胞內的油脂含量也有影響。Gong等[19]研究了培養(yǎng)周期和營養(yǎng)脅迫對四株富含EPA海洋微藻的影響, 結果在氮脅迫條件下眼點擬微綠球藻(Nannochloropsis oculata)細胞內不斷積累 TAGs, 角毛藻(Chaetoceros sp.), 三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)和綠色巴夫藻(Pavlova viridis)細胞內TAGs含量沒有明顯變化; 然而, 在氮限制條件下培養(yǎng)5d后角毛藻(Chaetoceros sp.), 三角褐指藻和綠色巴夫藻細胞內總脂肪酸含量增加了一倍, 眼點擬微綠球藻細胞內總脂肪酸含量卻增長緩慢。

通過改變培養(yǎng)基中的營養(yǎng)鹽濃度或者培養(yǎng)條件等手段, 來改變微藻細胞內脂類、多糖和色素等代謝途徑, 往往比通過基因工程手段更經(jīng)濟、有效[20]。氮是微藻細胞生長和代謝的重要營養(yǎng)因子, 也被認為是影響微藻細胞油脂積累最重要的脅迫因子。目前, 微藻培養(yǎng)中氮源供應主要有硝酸鹽、亞硝酸鹽、銨鹽和尿素等, 而硝酸鹽是應用最廣泛的氮源[20]。在光合作用過程中, 碳固定的速率是氮吸收速率的7—10倍, 這是最適宜細胞內含氮物質合成的比例。在氮限制條件下, 隨著氮可吸收量的減少, 微藻細胞光合作用的能力減弱, 其對碳的需求減少, 細胞內多余的碳可轉變成儲藏性物質, 如脂類和碳水化合物, 蛋白質含量下降, 同時細胞的生長速率也受到限制[5]。若給培養(yǎng)液中重新補加氮的供給, 儲藏性物質中的能量將被利用, 其中一部分用于氮的吸收,直至光合作用恢復。因此, 探索適宜微藻生長的最佳培養(yǎng)條件和最佳營養(yǎng)鹽濃度, 獲得較高的生物質濃度和總脂產(chǎn)率, 平衡生物質濃度、總脂產(chǎn)率和經(jīng)濟效益三者之間的關系, 可對微藻的規(guī)?；囵B(yǎng)和工業(yè)化應用提供重要的參考依據(jù)。

本研究選擇了真眼點藻綱的一株理想的產(chǎn)油微藻——魏氏真眼點藻(Eustigmatos vischeri)作為研究對象, 硝酸鈉作為氮源, 分別從形態(tài)學和生理學兩方面進行研究, 結合光學顯微鏡觀察低氮條件下該藻細胞內油體形成隨時相的變化, 并且考察四種初始硝酸鈉濃度水平下其生物質濃度、總脂含量、脂組分和脂肪酸組成及含量的時相變化規(guī)律, 進而探討不同初始硝酸鈉濃度對藻細胞生長、形態(tài)和油脂積累的影響, 從中確定使魏氏真眼點藻(E. vischeri)獲得最大油脂產(chǎn)率的最佳初始硝酸鈉平衡濃度。

1 材料與方法

1.1 藻種

魏氏真眼點藻, 由暨南大學水生生物研究中心微藻生物技術與生物能源實驗室保藏。

1.2 主要儀器與試劑

光學顯微鏡(Olympus CX41)、高速冷凍離心機(SORVALL biofuge)、冷凍干燥機(VirTis wizard 2.0)、氮吹儀(N-EVAPTM111)、氣相色譜儀(Agilent6890N)、恒溫磁力攪拌器(94-2 ThermoFinnigan)等。

正己烷(色譜純)、硝酸鈉、二甲基亞砜、甲醇、乙醚、氯仿、甲苯、丙酮等試劑均為分析純。

1.3 微藻培養(yǎng)

采用改良的BG-11培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基, 微藻細胞培養(yǎng)于φ3 cm×60 cm柱狀光生物反應器, 以加富 1% CO2的壓縮空氣進行通氣培養(yǎng), 光強為300 μmol phtons/(m2·s)單側連續(xù)光照, 培養(yǎng)溫度為(25±1) ,

℃ 分別設置四種不同的初始硝酸鈉濃度: 17.6、11.7、5.9和3.0 mmol/L, 藻細胞初始接種濃度為A750=0.55±0.02, 培養(yǎng)周期為18d。每個濃度實驗組設置3個平行。

1.4 實驗方法

藻細胞形態(tài)學的觀察 每隔 72h取3.0 mmol/L初始硝酸鈉濃度組的藻液制片, 通過Olympus光學顯微鏡(×100)進行藻細胞形態(tài)結構觀察, 并拍照記錄不同培養(yǎng)時期細胞內油體形成狀態(tài)和培養(yǎng)物的顏色。

生物質濃度的測定 每隔 24h分別取 5 mL四種初始硝酸鈉濃度培養(yǎng)條件下的藻液, 用預先烘至恒重(記為W1)的混合纖維濾膜(0.45 μm)真空抽濾,然后于 105 ℃的烘箱中烘干至恒重, 冷卻后記為W2。生物質濃度用單位體積藻體的干重(Dry cell weight, DCW)表示。

DCW(g/L)= 200 ×(W2–W1)

藻粉的制備 每隔3天分別從不同初始硝酸鈉濃度組的光生物反應器中取一定體積的藻液, 3000 r/min離心 5min, 收集藻泥置于小塑料瓶中,–20℃結冰后, 放置于冷凍干燥機中冷凍干燥36h以上。凍干的藻粉于4℃冰箱中儲存?zhèn)溆谩?/p>

總脂含量的測定 取凍干的藻粉, 按照改進的 Khozin-Goldberg 等[21]總脂提取方法進行總脂含量的測定。

準確稱取一定量的藻粉(記為 M0), 置于預先放入轉子的玻璃離心管中, 加入2 mL二甲基亞砜-甲醇混合液(v∶v=1∶9), 50℃水浴攪拌 1.5h, 轉入冰浴磁力攪拌1.5h, 3000 r/min離心3min, 轉移上清液至事先烘干的玻璃小瓶中。剩余藻渣再加入 4 mL乙醚-正己烷混合液(v∶v=1∶1), 冰浴攪拌抽提1.5h, 3000 r/min離心 3min, 轉移上清液至上述小瓶中。重復上述過程至藻渣變成灰白色。合并得到的所有上清液, 加入4 mL蒸餾水, 靜置分層。轉移上層有機相至另一事先烘干的玻璃小瓶中, 用氮氣儀吹干,轉移濃縮液至預先稱重過的2 mL EP管中(管重記為M1), 用氮氣吹干, 記為M2, –20 ℃保存。每個取樣點設置兩個平行, 利用差重法計算總脂占藻粉干重的百分比, 計算公式為:

總脂含量(% DCW)=(M2–M1)/M0×100%

總脂分級 參考 Alonzo等[22,23]的方法并加以改進, 利用硅膠層析柱(AgelaTechnologoes, Cleanert silica-SPE, 500 mg)將總脂進一步分級分離。分別用三種試劑對樣品進行洗脫, 洗脫順序如下: 先用一定體積的氯仿洗脫得到中性脂(NLs), 再用一定體積的丙酮和甲醇(v/v=9∶1)混合液洗脫得到糖脂(GLs), 最后用一定體積的甲醇洗脫得到磷脂(PLs)。將分離得到的各組分用氮氣吹至較小體積后轉移至預先稱重的2 mL EP管中, 用氮氣吹干至恒重, 利用差量法計算出各組分分別占總脂和干藻粉的百分含量。

脂肪酸組成分析 參考Bigogno等[11]的方法并進行改進。

準確稱取凍干藻粉 25 mg, 置于預先加入轉子的玻璃離心管中, 加入2 mL含有2% H2SO4的無水甲醇-甲苯混合液(v∶v=1∶1), 同時加入50 μL 0.5%的十七烷酸標樣, 充氬氣后, 置于 80℃恒溫磁力攪拌水浴鍋中抽提 1.5h, 冷卻后加入 1 mL純水和1 mL正己烷, 振蕩混勻后3000 r/min離心5min, 將上層有機相移至另一干凈玻璃小瓶中, 用氮氣吹干,再用200 μL正己烷轉移至氣相色譜樣品瓶中, 密封保存于–20℃冰箱中待測。利用氣相色譜儀, 分析測定各脂肪酸組分及其相對含量。

色譜條件如下: 色譜柱為 CD-2560, 100 m× 0.25 mm×0.20 μm (上海安譜科學儀器有限公司);載氣為高純氮氣, 不分流, 流速為23 mL/min; 二階升溫程序: 140℃保留 5min, 然后 4 /min℃ 升溫至240 ,℃ 最后240℃保留20min; 進樣量為1 μL; 進樣口溫度250 ; FID℃ 檢測器, 溫度為260℃。

單位體積總脂、中性脂和總脂肪酸產(chǎn)率 單位體積總脂(中性脂、總脂肪酸)產(chǎn)率 P [g/(L·d)] = (mt×Lt)/t

其中, mt為收獲時藻的生物質濃度(g/L), Lt為收獲時總脂(中性脂或總脂肪酸)含量(%DCW), t為培養(yǎng)時間。

數(shù)據(jù)處理與分析 采用Excel 和Origin8.6對數(shù)據(jù)進行分析處理, 并用 SPSS 13.0軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(Ducan法), P＜0.05表示差異顯著。

2 結果

2.1 藻細胞的形態(tài)變化

利用光學顯微鏡觀察魏氏真眼點藻細胞在不同時相的細胞形態(tài)和油脂積累變化(圖1)。從圖1A和 B可以看出, 魏氏真眼點藻(E. vischeri)為球形或近球形單細胞, 細胞壁光滑, 細胞直徑通常在8—10 μm, 有時可以達到 20 μm; 葉綠體為深裂葉狀, 細胞質中有一紅色色素體(Red pigment body);細胞繁殖方式主要是通過二分裂或四分裂形成似親孢子, 偶見八分裂或十六分裂的似親孢子。圖1B為3.0 mmol/L初始硝酸鈉濃度組藻細胞內油體形成隨時相的變化。在培養(yǎng)初期氮充足的情況下,藻細胞內裂葉狀葉綠體和振動顆粒物清晰可見,幾乎占據(jù)了整個細胞體積的一半以上, 第 6天時細胞內開始出現(xiàn)小油滴; 隨著培養(yǎng)時間的延長,氮源不斷被消耗, 葉綠體逐漸解體, 細胞內出現(xiàn)數(shù)目不等、大小不一的油體, 至培養(yǎng)末期, 油體相互融合成更大的油體, 占據(jù)細胞的大部分空間,胞內物的顏色也由綠色向黃綠色轉變, 最后呈橙黃色。此外, 觀察不同初始硝酸鈉濃度培養(yǎng)條件下藻細胞培養(yǎng)物顏色的時相變化發(fā)現(xiàn)(圖 1C), 培養(yǎng)至第3天時, 各濃度組藻細胞培養(yǎng)物的顏色就開始發(fā)生明顯的變化。隨著培養(yǎng)周期的延長, 17.6 mmol/L初始硝酸鈉濃度和 11.7 mmol/L初始硝酸鈉濃度組藻細胞培養(yǎng)物顏色逐漸由淡綠色轉變?yōu)槟G色,而5.9 mmol/L初始硝酸鈉濃度和3.0 mmol/L初始硝酸鈉濃度組明顯可見由淡綠色變?yōu)辄S綠色, 最后變?yōu)槌赛S色, 3.0 mmol/L初始硝酸鈉濃度組變化最為明顯。

2.2 不同初始硝酸鈉濃度對魏氏真眼點藻生長的影響

如圖 2所示, 在整個培養(yǎng)周期內, 各個濃度組藻細胞的生物質濃度均呈上升的趨勢, 但不同硝酸鈉濃度對魏氏真眼點藻的生長速率有明顯的影響。單因素方差分析表明, 細胞培養(yǎng)早期, 即培養(yǎng)3—4d內, 培養(yǎng)基內營養(yǎng)物質充足, 各濃度組間的生物質濃度沒有明顯差異(P＞0.05)。培養(yǎng) 4d后, 細胞進入對數(shù)生長中期, 隨著培養(yǎng)時間延長, 各個濃度組間的生物質濃度快速增加, 但從實驗結果可明顯看出, 3.0 mmol/L初始硝酸鈉濃度組藻細胞生長趨勢與其他三組相比增長較緩慢。到 14d后, 細胞生長趨于平穩(wěn), 進入平臺期。各個濃度組均在培養(yǎng)末期, 獲得最大生物質濃度。17.6 mmol/L初始硝酸鈉濃度組細胞生長最快, 到 18d時, 達到 9.14 g/L,另外三個實驗組分別為8.54、7.91和6.51 g/L。

圖1 魏氏真眼點藻細胞形態(tài)及其培養(yǎng)物顏色隨時相的變化Fig. 1 The variation of cell morphology and cultures color of E. vischeri in different cultivation periods

圖2 不同初始硝酸鈉濃度對魏氏真眼點藻生長的影響Fig. 2 Effects of different initial sodium nitrate concentrations on the growth of E. vischeri

2.3 不同初始硝酸鈉濃度對魏氏真眼點藻油脂積累的影響

圖3是不同初始硝酸鈉濃度培養(yǎng)條件下魏氏真眼點藻細胞內總脂含量隨時相的變化。由圖可以看出, 隨著培養(yǎng)時間的延長, 各個濃度組總脂含量均呈不斷上升的趨勢, 初始硝酸鈉濃度為 5.9和 3.0 mmol/L的這兩個低氮濃度組藻細胞內總脂含量明顯高于初始硝酸鈉濃度為17.6和11.7 mmol/L的高氮濃度組。在培養(yǎng)早期, 藻細胞內總脂含量較低,約占干重的20%。隨著培養(yǎng)的持續(xù)進行, 4個氮濃度組藻細胞內油脂逐漸積累, 到第18天時, 總脂含量均達到最大值, 對其進行單因素方差分析發(fā)現(xiàn), 初始硝酸鈉濃度為17.6和11.7 mmol/L這兩個高氮濃度組間總脂含量差異不顯著(P＞0.05), 初始硝酸鈉濃度為5.9和3.0 mmol/L這兩個低氮濃度組總脂含量差異顯著(P＜0.05), 且與前兩組相比差異極顯著(P＜0.001); 同時, 藻細胞內的總脂含量隨初始硝酸鈉濃度的降低而增加, 其中初始硝酸鈉濃度為 5.9和3.0 mmol/L這兩個低氮濃度組相對較高, 分別為55.12%和60.82%, 3.0 mmol/L初始硝酸鈉濃度組總脂含量增長速度尤為顯著。

按照總脂分級方法, 對上述 4個初始硝酸鈉濃度培養(yǎng)條件下各個時相獲得的總脂進行分級(圖4)。圖中的a、b、c和d分別代表初始硝酸鈉濃度為17.6、11.7、5.9 和3.0 mmol/L 4個濃度組總脂分級結果。結果表明, 魏氏真眼點藻細胞內總脂主要由中性脂(NLs)、糖脂(GLs)和磷脂(PLs)3大組分組成, 其中,中性脂占據(jù)主要部分, 且同一濃度條件下隨著培養(yǎng)時間的延長其含量在不斷增加。氮濃度對總脂各組分含量的影響也較大, 隨著氮濃度的降低, 中性脂的含量不斷增加, 而糖脂和磷脂的含量隨之減少,最高中性脂的相對含量和絕對含量在初始硝酸鈉濃度為3.0 mmol/L組在其培養(yǎng)至18d時獲得, 分別為93.04%和 56.59%, 此時, 細胞內糖脂和磷脂含量極少。這進一步證實了, 魏氏真眼點藻是一株高產(chǎn)油微藻。

圖 3 不同初始硝酸鈉濃度條件下魏氏真眼點藻總脂含量的時相變化Fig. 3 The time course changes in total lipid contents of E. vischeri grown in modified BG-11 medium containing four different initial concentrations of sodium nitrate

圖 4 不同初始硝酸鈉濃度條件下魏氏真眼點藻脂組分的相對含量(占總脂)(A)及其中性脂的絕對含量(占細胞干重)(B)的時相變化Fig. 4 The time course variation of lipid fraction contents (% of total lipids) (A) and neutral lipid contents (% of dry biomass) (B) from E. vischeri grown in modified BG-11 medium containing four different initial concentrations of sodium nitrate

2.4 不同初始硝酸鈉濃度對魏氏真眼點藻脂肪酸含量的影響

表1和圖5分別顯示4種初始硝酸鈉濃度培養(yǎng)條件下魏氏真眼點藻細胞內脂肪酸組分和含量(分別占總脂肪酸(相對含量)和細胞干重(絕對含量)。從中可以看出, 魏氏真眼點藻細胞內的主要脂肪酸為棕櫚酸(C16:0)、棕櫚油酸(C16:1)、油酸(C18:1)和二十碳五烯酸 (C20:5ω3, EPA), 其中棕櫚油酸含量最高, 占總脂肪酸的35%—55%。由表1可知, 在同一硝酸鈉濃度下, 棕櫚油酸和油酸的相對含量隨時相的變化呈不斷上升的趨勢, 而棕櫚酸和二十碳五烯酸略有減少。由圖 5可知, 不同初始硝酸鈉濃度下棕櫚酸、棕櫚油酸和油酸三者的絕對含量均隨時相的變化不斷升高, 二十碳五烯酸的絕對含量變化不明顯(其占細胞干重的含量為: 2.1%— 2.9%)。此外,在同一時相下, 初始硝酸鈉濃度為3.0 mmol/L組的各脂肪酸組分占細胞干重的含量明顯高于其他3個濃度組, 且各脂肪酸的絕對含量隨著氮濃度的降低而增加, 即在初始硝酸鈉濃度為3.0 mmol/L組培養(yǎng)至末期時獲得最大值, 占細胞干重的54.37%。由此可以看出, 魏氏真眼點藻細胞中儲藏性油脂逐步積累的過程實際上表現(xiàn)為脂肪酸的不斷合成和積累的過程。

2.5 不同初始硝酸鈉濃度對魏氏真眼點藻單位體積總脂、中性脂和總脂肪酸產(chǎn)率的影響

圖6表示4種初始硝酸鈉濃度組培養(yǎng)至18d時,魏氏真眼點藻的單位體積總脂產(chǎn)率、中性脂產(chǎn)率和總脂肪酸產(chǎn)率。由圖可知, 各濃度組間的單位體積總脂產(chǎn)率、中性脂產(chǎn)率和總脂肪酸產(chǎn)率大小順序排列為: 5.9 mmol/L組 ＞ 3.0 mmol/L組 ＞ 11.7 mmol/L組 ＞ 17.6 mmol/L組, 即在初始硝酸鈉濃度為5.9 mmol/L組獲得最高單位體積總脂產(chǎn)率、中性脂產(chǎn)率和總脂肪酸產(chǎn)率, 分別為 0.24、0.21和0.20 g/(L·d)。

表1 不同硝酸鈉濃度條件下魏氏真眼點藻細胞內各脂肪酸相對含量的時相變化Tab. 1 The time course variation of fatty acid profiles from E. vischeri grown in modified BG-11 medium containing four different initial concentrations of sodium nitrate

圖 5 不同硝酸鈉濃度條件下魏氏真眼點藻細胞內脂肪酸絕對含量的時相變化Fig. 5 The time course changes in fatty acid contents (% of dry biomass) of E. vischeri grown in modified BG-11 medium containing four different initial concentrations of sodium nitrate

圖6 不同初始硝酸鈉濃度對魏氏真眼點藻單位體積總脂、中性脂和總脂肪酸產(chǎn)率的影響Fig. 6 Effects of different initial sodium nitrate concentrations on volummetric productivity of total lipids, neutral lipids and total fatty acids of E. Vischeri

3 討論

生物質濃度、總脂含量和總脂產(chǎn)率等參數(shù)是考察微藻作為未來生物柴油可再生生產(chǎn)原料經(jīng)濟可行性的重要指標[12]。目前, 一些微藻由于高生產(chǎn)成本和低總脂產(chǎn)率而阻礙了其工業(yè)化生產(chǎn)和商業(yè)利用價值。研究者們往往通過優(yōu)化培養(yǎng)條件(如氮濃度、鹽度、光照強度和溫度等)來提高藻株的生物質濃度和總脂產(chǎn)率。本研究選擇的魏氏真眼點藻是一株潛在的高產(chǎn)油微藻, 隸屬于異鞭藻門(Heterokontophyta)真眼點藻綱(Eustigmatophyceae)真眼點藻屬(Eustigmatos), 是一種黃綠色單細胞微藻。真眼點藻綱是Hibberd等[24,25]于1970年從黃藻綱(Xanthophyceae)中分離出來而成立的一個新鋼。真眼點藻綱能產(chǎn)生游動孢子, 且游動孢子的葉綠體外部有一紅色眼點,這是真眼點藻綱區(qū)別于黃藻綱的重要特征之一。另外, 二者在色素組成上也略有不同, 真眼點藻綱的藻類含有葉綠素α、β-胡蘿卜素以及兩種主要的葉黃素—堇菜黃素和無隔藻黃素[26]。目前, 國內外對真眼點藻綱的相關研究還較少, 主要集中在海產(chǎn)的擬微綠球藻屬(Nannochloropsis spp.)的研究, 本實驗室保藏有除了擬微綠球藻屬的真眼點藻綱的其他多株藻株, 并率先對其生長、色素組成、光合生理和油脂積累等特性開展了相關研究[26—28]。

氮素是微藻細胞生長和代謝必不可少的重要元素之一。微藻細胞能利用的氮源形式多種多樣, 主要有硝酸鹽、銨鹽和尿素等。但不同的氮源和濃度對不同微藻的生長和油脂積累的影響有所不同。Li等[12]研究了硝酸鈉、尿素和銨鹽三種氮源對富油新綠藻(N. oleoabundans)生長和油脂積累的影響, 結果表明, 硝酸鈉是該藻生長的最佳氮源, 在10 mmol/L時獲得最大生物質濃度為3.15 g/L, 而總脂產(chǎn)率隨著硝酸鈉濃度的較低而升高, 在5 mmol/L時獲得最大值為0.40 g/(L·d)。Adams等[5]研究不同氮濃度處理對6種微藻生長和油脂積累的影響, 結果發(fā)現(xiàn)下面3種現(xiàn)象: (1) 在高氮濃度限制時, 富油新綠藻(N. oleoabundans UTEX105)和雙形柵藻(Scenedesmus dimorphus UTEX417)總脂含量升高速率快于生物質濃度下降速率, 總脂產(chǎn)率提高; (2) 在低氮濃度限制時, 普通小球藻(Chlorella vulgaris UTEX265)和油面綠球藻(Chlorococcum oleofaciens UTEX105)生物質濃度下降速率快于總脂含量升高速率, 總脂產(chǎn)率仍提高; (3) 根腐小球藻(Chlorella sorokiniana UTEX1602)和納高柵藻(Scenedesmus naegelii UTEX74)總脂含量升高速率和生物質濃度下降速率保持平衡, 總脂產(chǎn)率也相近。

大量研究表明, 氮限制有利于促進微藻細胞內油脂尤其是 TAGs的合成和積累, 但這往往伴隨著蛋白質含量以及生長速率的下降為代價。本研究以硝酸鈉為氮源, 分析17.6、11.7、5.9和3.0 mmol/L 4種初始氮濃度對魏氏真眼點藻生長和油脂積累的影響。研究表明, 生物質濃度與氮濃度成正相關關系,初始硝酸鈉濃度為17.6 mmol/L是魏氏真眼點藻生長的最適濃度, 培養(yǎng)至 18d時生物質濃度達到9.14 g/L, 但此條件下的總脂含量和總脂產(chǎn)率較低。這與前人的大量研究結果相一致。與富油新綠藻最大生物質濃度相比高出 2.9倍[12]。與魏氏真眼點藻生長趨勢有所不同的是, 真眼點藻綱的另一富油藻株——類波氏真眼點藻(Eustigmatos cf. polyphem)在初始硝酸鈉濃度為 6.0 mmol/L(低氮組)時獲得的生物質濃度為 7.91 g/L, 略高于了初始硝酸鈉濃度為18 mmol/L (高氮組)時所獲得的生物質濃度(7.46 g/L)[29]。這表明高濃度的初始硝酸鈉對類波氏真眼點藻有一定的抑制作用(高濃度基質抑制效應)。研究結果還表明, 魏氏真眼點藻是一株高產(chǎn)油的藻株, 細胞內總脂含量和中性脂含量隨著氮濃度的降低而增加, 在初始硝酸鈉濃度為3.0 mmol/L時獲得最高值。初始硝酸鈉濃度為 17.6 mmol/L時藻細胞培養(yǎng)至 18d后, 總脂含量(占干重)和中性脂含量(占總脂)分別為41.35%和77.85%; 初始硝酸鈉濃度為3.0 mmol/L組與之相比總脂含量和中性脂含量顯著增加(P＜0.05), 分別達到了 60.82%和 93.04%,提高了19.47%和15.19%。這說明, 低濃度的初始硝酸鈉供應可促進魏氏真眼點藻細胞油脂尤其是中性脂的積累。Griffiths等[30]通過兩種氮濃度處理對11種微藻進行培養(yǎng), 研究結果發(fā)現(xiàn), 與高氮濃度相比,低氮濃度條件下更有利于微藻油脂的合成, 普通小球藻(C. vulgaris)總脂含量(占干重)最高值達到57%,柵藻屬(Scenedesmus sp.)為 43%, 擬微綠球藻屬(Nannochloropsis sp.)為35%, 三角褐指藻僅為28%。Rodolfi等[31]對4株高生物量和高油脂含量的微藻進行研究, 結果發(fā)現(xiàn), 在氮限制處理后, 擬微綠球藻(Nannochloropsis sp.F&M-M24)總脂含量提高到了60%?？梢? 本研究選擇的魏氏真眼點藻在油脂合成上具有很大的優(yōu)勢。脂肪酸分析表明, 魏氏真眼點藻脂肪酸組分主要有飽和脂肪酸棕櫚酸、單不飽和脂肪酸棕櫚油酸和油酸, 以及多不飽和脂肪酸二十碳五烯酸, 這四者的總和占總脂酸的 69%—87%,其中棕櫚油酸含量最多, 占 35%—55%。且隨著初始硝酸鈉濃度的降低, 棕櫚酸、棕櫚油酸和油酸的絕對含量不斷增加, 二十碳五烯酸占細胞干重的含量沒有明顯變化, 維持在2.1%—2.9%。用作生物柴油的脂肪酸組成以含 16—20個碳的直鏈脂肪酸為最佳, 因此可以認為魏氏真眼點藻用于生物柴油生產(chǎn)具有較大的潛力。由于魏氏真眼點藻生物質濃度隨氮濃度的降低而下降, 總脂含量和中性脂含量隨之升高, 最終導致了其總脂產(chǎn)率、中性脂產(chǎn)率以及總脂肪酸產(chǎn)率的隨之改變。研究結果表明, 在初始硝酸鈉濃度為 5.9 mmol/L時三者均達到了最高值0.24、0.21和0.20 g/(L·d), 因此, 5.9 mmol/L初始硝酸鈉濃度是魏氏真眼點藻獲得最大總脂產(chǎn)率、中性脂產(chǎn)率以及總脂肪酸產(chǎn)率的最佳平衡濃度。以上的研究結果表明, 魏氏真眼點藻是一株適合于生產(chǎn)生物柴油和高附加值長鏈不飽和脂肪酸EPA的高產(chǎn)油藻株。

[1] Rodolfi L, Chini Zittelli G, Bassi N, et al. Microalgae for oil: strain selection, induction of lipid synthesis and outdoor mass cultivation in a low-cost photobioreactor [J]. Biotechnology and Bioengineering, 2009, 102(1): 100—112

[2] Ren M, Ogden K. Cultivation of Nannochloropsis gaditana on mixtures of nitrogen sources [J]. Environmental Progressand Sustainable Energy, 2014, 33(2): 551—555

[3] Chisti Y. Biodiesel from microalgae [J]. Biotechnology Advances, 2007, 25(3): 294—306

[4] Hu Q, Sommerfeld M, Jarvis E, et al. Microalgal triacylglycerols as feedstocks for biofuel production: perspectives and advances [J]. The Plant Journal, 2008, 54(4): 621—639

[5] Adams C, Godfrey V, Wahlen B, et al. Understanding precision nitrogen stress to optimize the growth and lipid content tradeoff in oleaginous green microalgae [J]. Bioresource Technology, 2013, 131: 188—194

[6] Liu Z Y, Wang G C, Zhou B C. Effect of iron on growth and lipid accumulation in Chlorella vulgaris [J]. Bioresource Technology, 2008, 99(11): 4717—4722

[7] Yeh K L, Chang J S. Effects of cultivation conditions and media composition on cell growth and lipid productivity of indigenous microalga Chlorella vulgaris ESP-31 [J]. Bioresource Technology, 2012, 105: 120—127

[8] Damiani M C, Popovich C A, Constenla D, et al. Triacylglycerol content, productivity and fatty acid profile in Scenedesmus acutus PVUW12 [J]. Journal of Applied Phycology, 2014, 26(3): 1423—1430

[9] Takagi M, Karseno, Yoshida T. Effect of salt concentration on intracellular accumulation of lipids and triacylglyceride in marine microalgae Dunaliella cells [J]. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2006, 101(3): 223—226

[10] Simionato D, Block M A, La Rocca N, et al. The response of Nannochloropsis gaditana to nitrogen starvation includes de novo biosynthesis of triacylglycerols, a decrease of chloroplast galactolipids, and reorganization of the photosynthetic apparatus [J]. Eukaryotic Cell, 2013, 12(5): 665—676

[11] Bigogno C, Khozin-Goldberg I, Boussiba S, et al. Lipid and fatty acid composition of the green oleaginous alga Parietochloris incisa, the richest plant source of arachidonic acid [J]. Phytochemistry, 2002, 60(5): 497—503

[12] Li Y, Horsman M, Wang B, et al. Effects of nitrogen sources on cell growth and lipid accumulation of green alga Neochloris oleoabundans [J]. Applied Microbiology Biotechnology, 2008, 81(4): 629—636

[13] Metzger P, Largeau C. Botryococcus braunii: a rich source for hydrocarbons and related ether lipids [J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2005, 66(5): 486—496

[14] Wang B, Lan C Q. Biomass production and nitrogen and phosphorus removal by the green alga Neochloris oleoabundans in simulated wastewater and secondary municipal wastewater effluent [J]. Bioresource Technology, 2011, 102(10): 5639—5644

[15] Khozin-Goldberg I, Cohen Z. The effect of phosphate starvation on the lipid and fatty acid composition of the fresh water eustigmatophyte Monodus subterraneus [J]. Phytochemistry, 2006, 67(7): 696—701

[16] Breuer G, Lamers P P, Martens D E, et al. Effect of light intensity, pH, and temperature on triacylglycerol (TAG) accumulation induced by nitrogen starvation in Scenedesmus obliquus [J]. Bioresource Technology, 2013, 143: 1—9

[17] Juneja A, Ceballos R M, Murthy G S. Effects of environmental factors and nutrient availability on the biochemical composition of algae for biofuels production: a review [J]. Energies, 2013, 6(9): 4607—4638

[18] Zhang H, Zhang G Y, Wen X B, et al. Effects of pH on the photosynthesis , growth and lipid production of Chlorella sp. XQ-200419 [J]. Acta Hydrobiologica Sinica, 2014, 38(6): 1084—1091 [張虎, 張桂艷, 溫小斌, 等. pH對小球藻Chlorella sp. XQ-200419光合作用、生長和產(chǎn)油的影響. 水生生物學報, 2014, 38(6):1084—1091]

[19] Gong Y, Guo X, Wan X, et al. Triacylglycerol accumulation and change in fatty acid content of four marine oleaginous microalgae under nutrient limitation and at different culture ages [J]. Journal of Basic Microbiology, 2013, 53(1): 29—36

[20] Procházková G, Brányiková I, Zachleder V, et al. Effect of nutrient supply status on biomass composition of eukaryotic green microalgae [J]. Applied Phycology, 2014, 26(3): 1359—1377

[21] Khozin-Goldberg I, Shrestha P, Cohen Z. Mobilization of arachidonyl moieties from triacylglycerols into chloroplastic lipids following recovery from nitrogen starvation of the microalga Parietochloris incisa [J]. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular and Cell Biology of Lipids, 2005, 1738(1): 63—71

[22] Alonzo F, Mayzaud P. Spectrofluorometric quantification of neutral and polar lipids in zooplankton using Nile red [J]. Marine Chemistry, 1999, 67(3): 289—301

[23] Zhang J J, Lü X J, Zhang C W, et al. Rapid estimation of lipids in microalgae cells [J]. China Biotechnology, 2012, 32(1): 64—72 [張敬鍵, 呂雪娟, 張成武, 等. 微藻細胞油脂含量的快速檢測方法研究. 中國生物工程雜志, 2012, 32(1): 64—72]

[24] Hibberd D J, Leedale G F. Eustigmatophyceae-a new algal class with unique organization of the motile cell [J]. Nature, 1970, 225(5234): 758—760

[25] Gao B Y, Zhang C W, Wan L L, et al. Systematics, biological characteristic and potential application of Eustigmatophyceae [J]. Acta Hydrobiologica Sinica, 2014, 38(5): 945—956 [高保燕, 張成武, 萬凌琳, 等. 真眼點藻綱的系統(tǒng)分類、生物學特性及應用研究. 水生生物學報, 2014, 38(5): 945—956]

[26] Wang Y L, Li Q Y, Li A F, et al. Growth and photosynthetic physiological characteristics of four Eustigmatophycean species [J]. Biotechnology, 2014, 24(2): 91—95 [王元麗, 李其雨, 李愛芬, 等. 4株真眼點藻的生長及光合生理特性.生物技術, 2014, 24(2): 91—95]

[27] Li Z, Sun M, Li Q, et al. Profiling of carotenoids in six microalgae (Eustigmatophyceae) and assessment of theirβ-carotene productions in bubble column photobioreactor [J]. Biotechnology Letts, 2012, 34(11): 2049—2053

[28] Li Q Y, Li A F, Zhang C W. The method of extraction and determination of pigment in Eustigmatophyceae [J]. Ecological Science, 2012, 31(3): 278—283 [李其雨, 李愛芬, 張成武. 真眼點藻類色素的提取與測定方法. 生態(tài)科學, 2012, 31(3): 278—283]

[29] Han J. The analysis of main biochemical composition and determination of the enzymes involved in the chrysolaminarin metabolizing of Eustigmatos cf. polyphem [D]. Jinan University, 2013 [韓娟. 類波氏真眼點藻的主要生化組成分析及其金藻昆布糖代謝相關酶的活性測定.暨南大學, 2013]

[30] Griffiths M J, van Hille R P, Harrison S T L. Lipid productivity, settling potential and fatty acid profile of 11 microalgal species grown under nitrogen replete and limited conditions [J]. Journal of Applied Phycology, 2012, 24(5): 989—1001

[31] Rodolfi L, Chini Zittelli G, Bassi N, et al. Microalgae for oil: Strain selection, induction of lipid synthesis and outdoor mass cultivation in a low-cost photobioreactor [J]. Biotechnology and Bioengineering, 2009, 102(1): 100—112

EFFECTS OF INITIAL NITROGEN SUPPLY ON THE GROWTH, MORPHOLOGY AND LIPID ACCUMULATION OF OLEAGINOUS MICROALGA EUSTIGMATOS VISCHERI (EUSTIGMATOPHYCEAE)

HE Si-Si, GAO Bao-Yan, LEI Xue-Qing, WAN Ling-Lin, LI Ai-Fen and ZHANG Cheng-Wu
(Research Center for Hydrobiology, Department of Ecology, Jinan University, Guangzhou 510632, China)

This research aimed at analysing the effects of initial nitrogen supply on the growth, morphology and lipids accumulation of an oleaginous microalga of Eustigmatophyceae, Eustigmatos vischeri. E. vischeri was grown in modified BG-11 medium containing four different initial concentrations of sodium nitrate (17.6 mmol/L, 11.7 mmol/L, 5.9 mmol/L and 3.0 mmol/L). The cell morphology and oil droplets formation process of E. vischeri were observed under microscope. It was found that the vegetative cells of E. vischeri were spherical unicellular with smooth cell wall and containing a lobed chloroplast, a red pigment body and many vibrating ganules in cytoplasm. The main reproduction way is by forming autospore such as binary or quadripartition division. With the prolongation of cultivation time, the oil droplets formed gradually under nitrogen depletion. Then, the oil droplets became larger and mutual fusion into larger and larger oil bodies, eventually occupied the main part of the cell. Moreover, the color of cultures changed from green to yellow-green, finally to orange-yellow. The physiological results showed that the highest biomass concentration was occurred at the initial sodium nitrate concentration of 17.6 mmol/L, up to 9.14 g/L. The contents of total lipid (TLs), neutral lipids (NLs) and total fatty acids (TFAs) increased following the reduction of nitrogen concentration. Their maximum contents reached to 60.81%, 56.59% and 53.47% at the basis of dry cell weight, respectively. However, the highest volumetric productivity of TLs, NLs and TFAs were up to 0.24, 0.21 and 0.20 g/(L·d) at 5.9 mmol/L of sodium nitrate, respectively. In addition, the main components of fatty acid were palmic acid, palmitoleicacid , oleic acid and eicosapentaenoic acid, among them, the content of palmitoleicacid was highest one. As a whole, E. vischeri was an oleaginous microalga, suitable for the production of biodiesel and high value-adding of long-chain polyunsaturated fatty acid EPA.

Eustigmatos vischeri; Sodium nitrate; Biomass concentration; Total lipid; Fatty acid; Volumetric productivity

Q819; TK6

A

1000-3207(2015)03-0574-09

10.7541/2015.75

2014-08-25;

2015-01-12

國家“863”主題項目(2013AA065805); 自然科學基金(31170337); 廣東省低碳專項(2011-051)、珠海市科技重大項目(PB20041018); 珠海市科技攻關項目(PC20081008)資助

何思思(1990—), 女, 浙江平陽人; 碩士研究生; 研究方向為微藻生物技術和分子生物學。E-mail: zjhesisi@163.com

張成武(1963—), 男, 教授, 博士生導師; 研究方向為微藻生物學和生物技術。E-mail: tzhangcw@jnu.edu.cn