徐子彧 杜心如 駱 輝

人參皂甙Rgl體外抑制人骨肉瘤腫瘤干細(xì)胞增殖的研究

徐子彧 杜心如 駱 輝

目的探討人參皂苷Rg1體外抑制人骨肉瘤腫瘤干細(xì)胞的作用。方法體外培養(yǎng)MG－63人骨肉瘤細(xì)胞，鏡下觀察并行CD133免疫熒光染色;實(shí)驗(yàn)分為生理鹽水組、20 μg/mL人參皂苷Rg1組和40 μg/mL人參皂苷Rg1組;采用四唑鹽比色法(MTT)檢測人參皂苷Rg1對人骨肉瘤腫瘤干細(xì)胞增殖抑制作用;DAPI核染檢測人參皂苷Rg1誘導(dǎo)人骨肉瘤腫瘤干細(xì)胞凋亡，并分析細(xì)胞的光密度和面密度變化。結(jié)果培養(yǎng)MG－63人骨肉瘤細(xì)胞CD133呈陽性反應(yīng); MTT法實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:20 μg/mL和40 μg/mL人參皂苷Rg1對人骨肉瘤腫瘤干細(xì)胞的抑制率分別為23．47%和41．84%，明顯低于生理鹽水組(P＜0．05，P＜0．01);DAPI核染檢測結(jié)果顯示:與生理鹽水組比較，人參皂苷Rg1組人骨肉瘤腫瘤干細(xì)胞的光密度和面密度值均明顯減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．01)。結(jié)論人參皂苷Rg1對人骨肉瘤腫瘤干細(xì)胞的增殖具有抑制作用。

人參皂苷Rg1;骨肉瘤;腫瘤干細(xì)胞;增殖

(The Practical Journal of Cancer，2015，30:799～802)

骨肉瘤是骨骼系統(tǒng)常見的骨原發(fā)惡性腫瘤，以青少年多見，由于早期診斷難度大，因此，該病的轉(zhuǎn)移率和病死率較高;近年來，手術(shù)技術(shù)的進(jìn)展和新輔助化療的應(yīng)用提高了骨肉瘤患者的5年之內(nèi)生存率;然而，受骨肉瘤細(xì)胞耐藥和免疫逃逸影響，骨肉瘤的病死率仍居高不下［1］。

近年研究發(fā)現(xiàn)，人骨肉瘤細(xì)胞中存在小部分與正常干細(xì)胞相似的自我更新和分化能力的細(xì)胞，即骨肉瘤腫瘤干細(xì)胞［2］。依據(jù)腫瘤干細(xì)胞的生物學(xué)特性，目前的治療技術(shù)未能將將這部分細(xì)胞完全清除;但這小部分細(xì)胞的存在，能夠繼續(xù)自我更新，不斷增殖和分化形成新的腫瘤細(xì)胞和組織，從而轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)［3］。因此，針對性地抑制這些細(xì)胞的增殖具有重要的臨床意義。人參皂苷是人參的主要活性成分，人參皂苷Rg1對人骨肉瘤腫瘤細(xì)胞的抑制作用已得到研究證實(shí)［4－5］，但關(guān)于人參皂苷Rg1對人骨肉瘤中腫瘤干細(xì)胞的作用少見報(bào)告。

1 材料與方法

1．1 材料

MG－63人骨肉瘤細(xì)胞由上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司提供;人參皂苷(純度95%)購于南京安培化工科技有限公司;DMEM/F12培養(yǎng)基購于Gibco公司;胎牛血清由杭州四季青公司生產(chǎn);胰蛋白酶，多聚賴氨酸，堿性成纖維細(xì)胞生長因子，表皮生長因子，溴化二甲噻唑二苯四氮唑藍(lán)(MTT)和二甲基亞砜均為Sigma公司產(chǎn)品;胰蛋白酶，L－－谷氨酰胺，DAPI和山羊血清購于博士德生物工程有限公司;兔抗人CD133單克隆抗體購于上海鈺博生物科技有限公司;山羊抗兔Cy3－IgG熒光二抗為美國Invitorgen生物技術(shù)公司提供;酶標(biāo)儀AD340型為美國Beckman Coulter公司產(chǎn)品;IX70－S8F型倒置相差顯微鏡購自日本OLYMPUS公司。

1．2 實(shí)驗(yàn)方法

1．2．1 人骨肉瘤細(xì)胞培養(yǎng)［6］取人骨肉瘤細(xì)胞株，胰蛋白酶消化約5 min，胎牛血清液終止消化，吹打成單細(xì)胞懸液，1 000 r/min離心5 min，棄上清，用無血清DMEM/F12培養(yǎng)液(含L－谷氨酰胺2 mmol/L、胰島素4 U/L、表皮生長因子20 μg/L、堿性成纖維細(xì)胞生長因子20 μg/L和青霉素100 U/mL)重懸細(xì)胞，將細(xì)胞終濃度調(diào)整為5×106L－1，在37℃、5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，此后每2 d換液1次，連續(xù)培養(yǎng)7 d;在細(xì)胞對數(shù)生長期大約80%時(shí)，用0．25 mL/L胰酶消化、離心，用無血清培養(yǎng)基重新吹打成單細(xì)胞懸液，按1∶2比例傳代，再接種于培養(yǎng)孔板進(jìn)行培養(yǎng)，然后進(jìn)行相應(yīng)實(shí)驗(yàn)檢測。

1．2．2 CD133免疫熒光染色［7］細(xì)胞采用4%多聚甲醛固定30 min，用含有山羊血清和TritonX－100的封閉液孵育1 h，PBS漂洗，然后進(jìn)行一抗兔抗人CD133單克隆抗體混合液(含有山羊血清和TritonX－100)處理24 h，漂洗后進(jìn)行二抗山羊抗兔Cy3－IgG熒光處理，漂洗，防淬滅熒光劑進(jìn)行封片，鏡下攝像。

1．2．3 實(shí)驗(yàn)分組 將培養(yǎng)的CD133陽性細(xì)胞球按1 ×106個(gè)接種于96孔板，采取隨機(jī)法分為3組:生理鹽水組，20 μg/mL人參皂苷Rg1組和40 μg/mL人參皂苷Rg1組。分別給予生理鹽水、人參皂苷Rg1進(jìn)行干預(yù);1次/d，3組均干預(yù)2周，再進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)檢測。

1．2．4 MTT檢測［8］在細(xì)胞終止培養(yǎng)前4 h，將20 μl的MTT溶液加入孔板細(xì)胞中，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，二甲基亞砜振蕩溶解，搖床混勻10 min，采取全自動(dòng)酶標(biāo)儀在波長為490 nm下測定細(xì)胞的吸光度值(OD值)。細(xì)胞抑制率(%)=［(對照組OD值－治療組OD值)/對照組OD值］×100%。

1．2．5 CD133陽性細(xì)胞凋亡檢測 采用細(xì)胞核(DAPI)染法檢測，具體方法為:吸棄培養(yǎng)板內(nèi)液體，每孔加入100 μL DAPI(1∶2000)，室溫孵育5 min，漂洗3次，鏡下觀察和拍照。細(xì)胞凋亡分析采取CMIAS－II多功能真彩病理圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，每組隨機(jī)選10張圖片，每張圖片隨機(jī)選10個(gè)視野，測量計(jì)算所識別的光密度和面密度，分別取兩者平均值進(jìn)行分析。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17．0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以ˉx± s表示計(jì)量資料，采用單因素方差分析，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 人骨肉瘤CD133+細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定

培養(yǎng)3 d后大部分細(xì)胞聚集生長，有成團(tuán)趨勢，少數(shù)細(xì)胞發(fā)出突起，細(xì)胞有較好的折光性，類似干細(xì)胞球;免疫熒光檢測顯示:干細(xì)胞表面標(biāo)志CD133在人骨肉瘤類腫瘤干細(xì)胞中呈陽性表達(dá)。

2．2 人參皂苷Rg1抑制人骨肉瘤腫瘤干細(xì)胞增殖

MTT法實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:人參皂苷Rg1干預(yù)后細(xì)胞的增殖抑制明顯，OD值分別為0．75±0．26和0．57± 0．31;20 μg/mL人參皂苷Rg1對人骨肉瘤腫瘤干細(xì)胞的抑制率為23．47%，顯著低于生理鹽水組(P＜0．05);40 μg/mL人參皂苷Rg1組的抑制率為41．84%，極明顯低于生理鹽水組(P＜0．01)，見表1。

表1 人參皂苷Rg1對人骨肉瘤細(xì)胞增殖抑制作用(ˉx±s，n=10)

2．3 人參皂苷Rg1誘導(dǎo)人骨肉瘤腫瘤干細(xì)胞凋亡

DAPI核染檢測結(jié)果顯示:與生理鹽水組比較，人參皂苷Rg1干預(yù)后人骨肉瘤腫瘤干細(xì)胞的DAPI染色顯著減弱，見圖1。圖像分析發(fā)現(xiàn)，與生理鹽水組比較，人參皂苷Rg1組人骨肉瘤腫瘤干細(xì)胞的光密度和面密度值均明顯減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．01)，見表2。

圖1 人骨肉瘤腫瘤干細(xì)胞DAPI染色A為20 μg/mL人參皂苷Rg1組;B為40 μg/mL人參皂苷Rg1組;C為生理鹽水組。

表2 人參皂苷Rg1誘導(dǎo)人骨肉瘤腫瘤干細(xì)胞凋亡(ˉx±s，n=10)

3 討論

腫瘤干細(xì)胞首次分離是來自于人類白血病，此后從乳腺癌、肺癌、腦腫瘤和前列腺癌等腫瘤中也陸續(xù)分離出腫瘤干細(xì)胞［9］。從人骨肉瘤中分離腫瘤干細(xì)胞是在2005年P(guān)arker Gibbs等利用去血清懸浮培養(yǎng)法分離得到［10］。這些細(xì)胞具有較強(qiáng)的自我更新能力，并能夠不斷增殖、分化，形成新的腫瘤細(xì)胞［10］。實(shí)驗(yàn)檢測顯示，骨肉瘤細(xì)胞主要表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞特有的表面標(biāo)志物。目前發(fā)現(xiàn)的骨肉瘤腫瘤干細(xì)胞的表面標(biāo)志物有CD133、CD24、Stro－1和CD90等［11］。在本研究中，參照以往培養(yǎng)方案獲得人骨肉瘤腫瘤干細(xì)胞，鏡下大部分細(xì)胞聚集生長，有成團(tuán)趨勢，少數(shù)細(xì)胞發(fā)出突起，細(xì)胞有較好的折光性，類似干細(xì)胞球;免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞表面標(biāo)志CD133在人骨肉瘤類腫瘤干細(xì)胞中呈陽性表達(dá);因此，在本研究中得到較好特性的人骨肉瘤腫瘤干細(xì)胞。

人參皂苷是人參的主要成分之一，對心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)均發(fā)揮了重要調(diào)節(jié)作用;人參皂苷可通過阻止細(xì)胞增殖周期的G0/G1期或誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的作用機(jī)制抑制腫瘤細(xì)胞的增殖［5］。近年研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rg1具有較強(qiáng)的離體和整體抗腫瘤作用［12］，且對人成骨肉瘤MG－63細(xì)胞的增殖具有抑制和誘導(dǎo)分化作用［4］。然而，人參皂苷Rg1對人骨肉瘤腫瘤干細(xì)胞的增殖是否具有抑制作用尚待闡明。

本研究采取常規(guī)人骨肉瘤細(xì)胞培養(yǎng)方法，結(jié)合前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用低、高溶度人參皂苷Rg1分別干預(yù)培養(yǎng)的CD133陽性細(xì)胞，進(jìn)行MTT檢測和DAPI核染色，分別對人參皂苷Rg1干預(yù)效果進(jìn)行分析。MTT法實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:人參皂苷Rg1干預(yù)后人骨肉瘤CD133陽性細(xì)胞的增殖明顯被抑制，與生理鹽水組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．01)。DAPI核染檢測結(jié)果顯示:人參皂苷Rg1能明顯誘導(dǎo)人骨肉瘤CD133陽性細(xì)胞凋亡，與生理鹽水組比較，人參皂苷Rg1組人骨肉瘤CD133陽性細(xì)胞的光密度和面密度值均明顯減少(P＜0．01)。以上結(jié)果均提示，人參皂苷Rg1對體外培養(yǎng)人骨肉瘤腫瘤干細(xì)胞的增殖具有顯著的抑制作用，結(jié)合以往人參皂苷Rg2抗腫瘤或骨肉瘤的作用，其作用機(jī)制可能與本研究結(jié)果有關(guān)。

總之，腫瘤干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)為人骨肉瘤的臨床治療指明了新的方向，人參皂苷Rg1抑制人骨肉瘤腫瘤干細(xì)胞增殖作用為臨床治療帶來了新的希望。然而，對腫瘤干細(xì)胞的認(rèn)識目前仍處于初步階段，包括細(xì)胞分離培養(yǎng)、增殖信號通路和細(xì)胞微環(huán)境作用等也尚不明確［12］。本研究僅僅從體外細(xì)胞培養(yǎng)角度，結(jié)合中藥人參皂苷Rg1的作用進(jìn)行了探討。下一步本課題準(zhǔn)備建立人肉瘤腫瘤干細(xì)胞動(dòng)物模型，從在體水平探討人參皂苷Rg1對腫瘤及其干細(xì)胞的作用。

［1］Kansara M，Teng MW，Smyth MJ，et al．Translational biology of osteosarcoma〔J〕．Nat Rev Cancer，2014，14(11): 722－735．

［2］Poletajew S，F(xiàn)us L，Wasiutyński A．Current concepts on pathogenesis and biology of metastatic osteosarcoma tumors〔J〕．Ortop Traumatol Rehabil，2011，13(6):537－545．

［3］Basu－Roy U，Basilico C，Mansukhani A．Perspectives on cancer stem cells in osteosarcoma〔J〕．Cancer Lett，2013，338(1):158－167．

［4］石松林，李祺福，劉慶榕，等．人參皂苷Rgl組合誘導(dǎo)人成骨肉瘤MG－63細(xì)胞分化過程中Prohibitin的表達(dá)與定位變化〔J〕．中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)，2008，24 (2):180－187．

［5］張有為，竇德強(qiáng)，陳英杰，等．人參皂苷對人體骨肉瘤細(xì)胞QRST增殖的影響〔J〕．中草藥，2001，32(3):232－236．

［6］歐陽振，王栓科，康學(xué)文，等．人骨肉瘤細(xì)胞株中類腫瘤干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定〔J〕．腫瘤2008，28(1):36－39．

［7］宮晨，郭風(fēng)勁，秦亮，等．LY294002抑制PI3K/Akt通路對人骨肉瘤類腫瘤干細(xì)胞增殖的影響〔J〕．中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2011，28(12):2215－2217．

［8］Chistiakova IA，Polianskaia GG．Influence of human fetalmesenchymal stem cells on glioma cell proliferation．A consequence of cellular crosstalk〔J〕．Tsitologiia，2014，56 (11):800－808．

［9］Karlic H，Herrmann H，Schulenburg A，et al．stem cell research－basis and challenge for diagnosis and therapy〔J〕．Wien Klin Wochenschr，2010，122(13－14):423－436．

［10］Parker Gibbs C，Kukekov VG，Reith JD，et al．Slem－like cells in bone sarcomas:implications for tumorigenesis〔J〕．Neoplasia，2005，11(7):967－976．

［11］流小舟，黎承軍，吳蘇稼．腫瘤干細(xì)胞與骨肉瘤關(guān)系的研究進(jìn)展〔J〕．江蘇醫(yī)藥，2014，40(6):701－703．

［12］郭洪章，王栓科，康學(xué)文，等．腫瘤干細(xì)胞與骨肉瘤相關(guān)研究進(jìn)展〔J〕．國際骨科學(xué)雜志，2006，27(5):269－272．

Inhibitory Effect of Ginsenoside Rg1 on Proliferation of Human Osteosarcoma Cancer Stem Cells in Vitro

XU Ziyu，DU Xinru，LUO Hui．Beijing Chaoyang Hospital，Beijing，100020

ObjectiveTo investigate the inhibitory role of ginsenoside Rg1 on proliferation of human osteosarcoma cancer stem cells in vitro．MethodsMG－63 human osteosarcoma cell were cultured in vitro，then observed under the microscope and received CD133 immunofluorescence staining．The study was divided into normal saline water group，20 μg/mL ginsenoside Rg1 group and 40 μg/mL ginsenoside Rg1 group．Inhibitory effect of ginsenoside Rg1 on proliferation of cancer stem cells of human osteosarcoma cells in vitro was detected by MTT colorimetric method．Induction of apoptosis of ginsenoside Rg1 on proliferation of cancer stem cells of human osteosarcoma cells in vitro was measured by DAPI staining method，optical density and area density were analysed．ResultsMG－63 human osteosarcoma cell cultured in vitro were CD133+positive．MTT assay showed that inhibitory rates of 20 μg/mL and 40 μg/mL ginsenoside Rg1 were 23．47%and 41．84%，respectively，which were obviously lower than that of normal saline group(P＜0．05，P＜0．01)．DAPI staining method showed that compared with normal saline water group，optical density and area density of cancer stem cells of human osteosarcoma cells in vitro remarkably decreased，there had statistical difference(P＜0．01)．ConclusionGinsenoside Rg1 can inhibit the proliferation of cancer stem cells of human osteosarcoma cells in vitro．

Ginsenoside Rg1;Osteosarcoma;Cancer stem cells;Proliferation

10．3969/j．issn．1001－5930．2015．06．003

R738．1

:A

:1001－5930(2015)06－0799－04

2015－04－20

2015－04－28)

(編輯:吳小紅)

100020北京朝陽醫(yī)院骨科