阿 榮 喬延江 博·格日勒?qǐng)D

胡椒堿對(duì)誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的體外實(shí)驗(yàn)研究

阿 榮 喬延江 博·格日勒?qǐng)D

目的探討胡椒堿對(duì)誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的作用。方法采用MTT法檢測(cè)胡椒堿對(duì)人肝癌SMMC－7721細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。采用HE法熒光染色后觀察細(xì)胞形態(tài)。采用Annexin V－PI流式細(xì)胞術(shù)分析胡椒堿對(duì)人肝癌SMMC－7721細(xì)胞各個(gè)細(xì)胞周期的影響。結(jié)果胡椒堿對(duì)SMMC－7721細(xì)胞的抑制作用呈濃度依賴的形式，經(jīng)計(jì)算IC50為(18．5 ±4．33)μmol/L。對(duì)照組中肝癌細(xì)胞SMMC－7721核表面發(fā)出均勻熒光，光滑不毛糙;實(shí)驗(yàn)組中肝癌細(xì)胞SMMC－7721核壞死碎片，包括皺縮等，熒光清晰但濃染致密，呈現(xiàn)出典型的細(xì)胞凋亡性狀特點(diǎn)。與陰性對(duì)照組相比，胡椒堿25 μmol/L和50 μmol/L 2種濃度均對(duì)SMMC－7721細(xì)胞各個(gè)細(xì)胞周期有顯著影響(P＜0．05)。隨著胡椒堿劑量的增加，G0/G1期和S期細(xì)胞比率顯著降低，G2/M細(xì)胞比率顯著升高(P＜0．05)。結(jié)論胡椒堿對(duì)人肝癌SMMC－7721細(xì)胞具有明顯的誘導(dǎo)凋亡作用，主要將其停留于G2/M這一細(xì)胞周期，具有開發(fā)為治療肝癌藥物的潛在價(jià)值，其具體的作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步深入研究。

胡椒堿;肝癌;細(xì)胞周期;凋亡

(The Practical Journal of Cancer，2015，30:803～805)

原發(fā)性肝癌是我國(guó)常見的惡性腫瘤之一。原發(fā)性肝癌全球發(fā)病率正逐年增長(zhǎng)，在全球惡性腫瘤的發(fā)病率中排名第5，死亡率位列第3［1］。細(xì)胞凋亡在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要的作用，國(guó)內(nèi)外已將細(xì)胞凋亡作為評(píng)估抗腫瘤藥物療效的一個(gè)重要指標(biāo)［2－3］。胡椒堿(piperine)是從黑胡椒和篳茇中提取的植物生物堿，具有抗氧化、抗炎癥、抗腫瘤、抗驚厥和免疫調(diào)節(jié)等生物活性［4］。然而有關(guān)胡椒堿對(duì)誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的活性研究的報(bào)道較少，本文對(duì)胡椒堿在體外誘導(dǎo)人肝癌SMMC－7721細(xì)胞株凋亡的作用進(jìn)行探討，為進(jìn)一步開發(fā)和應(yīng)用胡椒堿提供必要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 主要試劑及儀器

人肝癌SMMC－7721細(xì)胞株購(gòu)自中科院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所;牛血清白蛋白(albumin bovine，Sigma);RPMI 1640(GIBCO，美國(guó));其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純劑試劑;胡椒堿(中國(guó)藥品生物制品檢定所);Annexin V－FITC凋亡檢測(cè)試劑盒和全蛋白提取試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司);超凈工作臺(tái)(AIRTECH，蘇凈集團(tuán)安泰公司);臺(tái)式低溫高速冷凍離心機(jī)(3K3，Sigma，美國(guó));普通酶標(biāo)儀(DG－3022，美國(guó));流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckman Coulter公司)。

1．2 細(xì)胞培養(yǎng)

復(fù)蘇SMMC－7721細(xì)胞株，采用含10%小牛血清、雙抗(終濃度:青霉素100 IU/mL，鏈霉素100 μg/mL)的RPMI 1640培養(yǎng)液接種于培養(yǎng)瓶，于37．5℃、5%的CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隔天換液，胞貼壁約70%～80%傳代。實(shí)驗(yàn)時(shí)選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。

1．3 細(xì)胞毒性研究

通過細(xì)胞計(jì)數(shù)將細(xì)胞濃度調(diào)整至1×105/mL，加100 μL細(xì)胞懸液至96孔板中培養(yǎng)16 h。胡椒堿在DMSO中，設(shè)置不同濃度(400 μmol/L、200 μmol/L、100 μmol/L、50 μmol/L、25 μmol/L、12．5 μmol/L、6．25μmol/L和3．13 μmol/L)，取100 μL分別加入96孔板的細(xì)胞懸液中，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h(37℃，5%，90%RH)，隨后加入MTT再培養(yǎng)4～5 h，用10%SDS終止反應(yīng)，約12 h溶解后于酶標(biāo)分析儀570 nm波長(zhǎng)處測(cè)各孔OD值。另外設(shè)置空白孔(只含培養(yǎng)基)、對(duì)照孔(不加入胡椒堿)和陽性對(duì)照孔(阿霉素)。

1．4 HE法熒光染色后觀察細(xì)胞形態(tài)

根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選定一定濃度的胡椒堿溶液，通過細(xì)胞計(jì)數(shù)將細(xì)胞濃度調(diào)整至1×105/mL，至6孔板中培養(yǎng)24 h。加入選定濃度的胡椒堿溶液，分別培育0 h(陰性對(duì)照組)和24 h(實(shí)驗(yàn)組)，觀察前采用HE染色，通過倒置熒光顯微鏡觀察活細(xì)胞生長(zhǎng)情況并記錄。

1．5 流式細(xì)胞儀分析［5］

通過細(xì)胞計(jì)數(shù)將細(xì)胞濃度調(diào)整至1×105/mL，每孔105個(gè)細(xì)胞，20 mol/L的胡椒堿處理24 h，0．25%胰蛋白酶消化，離心(1 000 rpm×5 min)，收集細(xì)胞，用PBS重懸細(xì)胞，然后利用熒光標(biāo)記了的Annexin作為染色探針染色5 min，離心(1 000 rpm×5 min)，重懸，加入PI染液避光染色10 min，上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1．6 統(tǒng)計(jì)方法

所有資料應(yīng)用SPSS 13．0進(jìn)行分析處理，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，行t檢驗(yàn)，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果

不同濃度的胡椒堿對(duì)SMMC－7721細(xì)胞周期的影響結(jié)果見表1。結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組相比，胡椒堿25 μmol/L和50 μmol/L 2種濃度均對(duì)SMMC－7721細(xì)胞各個(gè)細(xì)胞周期有顯著影響(P＜0．05)。隨著胡椒堿劑量的增加，G0/G1期和S期細(xì)胞比率顯著降低，G2/ M細(xì)胞顯著升高(P＜0．05)。

表1 不同濃度的胡椒堿對(duì)SMMC－7721細(xì)胞周期的影響(ˉx±s，%)

2．2 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果

不同濃度胡椒堿對(duì)SMMC－7721細(xì)胞的抑制作用見圖1。結(jié)果顯示，胡椒堿對(duì)SMMC－7721細(xì)胞的抑制作用呈濃度依賴的形式，經(jīng)計(jì)算IC50為(18．5±4．33) μmol/L。

圖1 不同濃度胡椒堿對(duì)SMMC－7721細(xì)胞的抑制作用

3 討論

原發(fā)性肝細(xì)胞癌是常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率高、臨床侵襲性強(qiáng)、預(yù)后差［6］。目前，肝癌主要是手術(shù)干預(yù)和局部射頻消融，對(duì)早期局部的小腫瘤具有良好的療效，而更晚期的腫瘤則很難治愈。阿霉素和5－氟尿嘧啶是治療肝癌的主要藥物，但效率低下，尋找和開發(fā)新的特異性高療效好的抗腫瘤藥物成為肝癌治療的研究熱點(diǎn)［7］。

胡椒堿是生物堿類物質(zhì)，是胡椒、蓽茇的主要生理活性成分之一。其化學(xué)結(jié)構(gòu)屬于桂皮酰胺類，已有研究證明這類化合物具有多種藥理活性，如鎮(zhèn)靜、催眠、抗驚厥、骨骼肌松弛和抗抑郁等［8］。本文研究發(fā)現(xiàn)，胡椒堿對(duì)SMMC－7721細(xì)胞的抑制作用呈濃度依賴的形式，其IC50為(18．5±4．33)μmol/L。曾龍輝等［4］報(bào)道稱，胡椒堿本身的細(xì)胞毒性較小，但與棉酚聯(lián)用時(shí)，表現(xiàn)出協(xié)同作用。鄭斌等［9］報(bào)道稱胡椒堿對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的抑制率隨著濃度的升高而增加，半量抑制濃度為(15．13士3．21)μmol/L。針對(duì)胡椒堿抗腫瘤作用的報(bào)道較多，國(guó)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)其可抑制B16F－10黑色素瘤誘導(dǎo)的肺轉(zhuǎn)移，降低苯并芘誘導(dǎo)的肺癌小鼠體內(nèi)脂質(zhì)過氧化水平與核苷酸的含量以及多胺合成，抑制ATF－2、NF－kappa b以及致炎細(xì)胞因子的基因表達(dá)［10］。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞分化、機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育過程中，細(xì)胞自主死亡的過程，其能力的減弱與腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散轉(zhuǎn)移和迅速生長(zhǎng)相關(guān)。有關(guān)胡椒堿誘導(dǎo)人肝癌SMMC－7721細(xì)胞的凋亡機(jī)制的研究還未見報(bào)道。本文HE染色細(xì)胞形態(tài)圖結(jié)果發(fā)現(xiàn):對(duì)照組中肝癌細(xì)胞SMMC－7721核表面發(fā)出均勻熒光，光滑不毛糙;實(shí)驗(yàn)組中人肝癌細(xì)胞SMMC－7721核壞死碎片，包括皺縮等，熒光清晰但濃染致密，呈現(xiàn)出典型的細(xì)胞凋亡性狀特點(diǎn)。表明胡椒堿對(duì)人肝癌SMMC－7721細(xì)胞具有明顯的誘導(dǎo)凋亡作用。

通過染色和流式細(xì)胞儀的檢測(cè)，可把壞死細(xì)胞、凋亡細(xì)胞和活細(xì)胞定量地區(qū)分開來［11］。利用細(xì)胞內(nèi)DNA能夠和熒光染料，如PI結(jié)合的特性。細(xì)胞各個(gè)時(shí)期由于其DNA含量不同從而結(jié)合的熒光染料不同，流式檢測(cè)的熒光輕度也不一樣。對(duì)其機(jī)制進(jìn)行深入的探討發(fā)現(xiàn)，胡椒堿25 μmol/L和50 μmol/L 2種濃度均對(duì)SMMC－7721細(xì)胞各個(gè)細(xì)胞周期有顯著影響(P＜0．05)。隨著胡椒堿劑量的增加，G0/G1期和S期細(xì)胞比率顯著降低，G2/M細(xì)胞顯著升高，提示人肝癌細(xì)胞SMMC－7721無法于分裂后期脫離，即停留于G2/M這一細(xì)胞周期。在肝癌的發(fā)展過程中腫瘤細(xì)胞的增殖往往伴隨著細(xì)胞凋亡減少。因此，胡椒堿對(duì)人肝癌SMMC－7721細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用可用于肝癌的治療。

綜上所述，胡椒堿對(duì)人肝癌SMMC－7721細(xì)胞具有明顯的誘導(dǎo)凋亡作用，主要將其停留于G2/M這一細(xì)胞周期，具有開發(fā)為治療肝癌藥物的潛在價(jià)值，其具體的作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步深入研究。

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Study of Liver Cancer Cell Apoptosis Induced by Piperine in Vitro

A Rong，QIAO Yanjiang，BO Geriletu．Beijing University of Chinese Medicine，Beijing，100102

ObjectiveTo investigate the effect of liver cancer cell apoptosis induced by piperine in vitro．MethodsMTT was used to investigate the cytotoxicity effect of piperine on liver cancer SMMC－7721 cell．HE dying was used to observe cell shape．The effect of piperine on liver cancer SMMC－7721 cell cycles was determined with Annexin V－PI flow cytometry．ResultsThe inhibitive effect of piperine on liver cancer SMMC－7721 cell was dose－dependent，the IC50was 18．5±4．33 μmol/L．In the control group，SMMC－7721 cells showed a mean and smooth fluorescence in nuclear appearance，while SMMC－7721 cells in the experimental group showed nuclear necrotic debris and fluorescence was clear and intense，indicating an apparent apoptosis phenomenon．Compared with the control group，piperine at 25 μmol/L and 50 μmol/L had significant influence on SMMC－7721 cell cycle．G0/G1and S phase cell ratio significantly decreased，while G2/M phase cell ratio significantly increased(P＜0．05)with the increase of piperine．ConclusionPiperine has significant apoptosis induction effect on SMMC－7721 cells，which are sustained at G2/M phase，it can be potential drug for liver cancer．But the specific mechanism need further investigating．

Piperine;Liver cancer;Cell cycle;Apoptosis

10．3969/j．issn．1001－5930．2015．06．004

R735．7

:A

:1001－5930(2015)06－0803－03

2014－11－05

2015－03－25)

(編輯:吳小紅)

100102北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院(阿榮);010018內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院(阿榮);100102北京中醫(yī)藥大學(xué)(東校區(qū))中藥信息工程研究中心(喬延江);010021內(nèi)蒙古大學(xué)蒙藥化學(xué)研究所(博·格日勒?qǐng)D)

喬延江