鄧守明 蔡召忠

攜帶雞貧血病毒凋亡素基因重組腺病毒質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

鄧守明 蔡召忠

目的構(gòu)建攜帶雞貧血病毒凋亡素VP3基因的重組腺病毒質(zhì)粒。方法設(shè)計(jì)VP3 cDNA擴(kuò)增引物，從PET15b－VP3質(zhì)粒中擴(kuò)增VP3的DNA序列，與線性pShuttle－IRES－h(huán)rGFP－2連接，PCR和EcoRⅤ酶切電泳鑒定;穿梭質(zhì)粒pShuttle－VP3－EGFP經(jīng)Pmel酶切線性化后，轉(zhuǎn)化含pAdeasy－1的超感受態(tài)BJ5183大腸桿菌，細(xì)菌內(nèi)同源重組法構(gòu)建重組腺病毒質(zhì)粒pAd－VP3－EGFP，質(zhì)粒經(jīng)PCR、PacI酶切電泳及測(cè)序鑒定。結(jié)果線性化的pShuttle－VP3－EGFP轉(zhuǎn)化含pAdeasy－1的超感受態(tài)BJ5183大腸桿菌，重組質(zhì)粒經(jīng)酶切獲得一大于23 kb的大片段和4．5 kb的片段，PCR反應(yīng)擴(kuò)增出了402 bp的片段，重組質(zhì)粒測(cè)序證實(shí)VP3－EGFP編碼區(qū)成功克隆入了腺病毒pAd中，且其序列與GeneBank中VP3 CDNA序列完全一致。結(jié)論用細(xì)菌內(nèi)同源重組法可快速、高效地制備攜帶凋亡素VP3基因的重組腺病毒質(zhì)粒，為深入研究VP3的抗腫瘤效應(yīng)及機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

同源重組;凋亡素;腺病毒;增強(qiáng)綠色熒光蛋白

(The Practical Journal of Cancer，2015，30:954～957)

凋亡素(apoptin，VP3)是近年來發(fā)現(xiàn)的由雞貧血病毒基因(CAV)編碼產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，具有廣譜抗腫瘤特性。研究發(fā)現(xiàn)，VP3僅可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞或轉(zhuǎn)化細(xì)胞凋亡，而對(duì)正常細(xì)胞或二倍體細(xì)胞不起作用，因此，其被認(rèn)為是第一個(gè)真正意義上可選擇性殺傷腫瘤細(xì)胞的凋亡蛋白［1－2］。

VP3誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的能力與其在細(xì)胞中的定位密切相關(guān)，研究顯示，VP3可定位于腫瘤細(xì)胞核內(nèi)，通過磷酸化反應(yīng)與細(xì)胞DNA結(jié)合誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，而在正常細(xì)胞中，VP3則定位于細(xì)胞質(zhì)中不能發(fā)生磷酸化反應(yīng)，因此，通過增加VP3的跨膜能力則可增強(qiáng)其誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的能力，且不會(huì)改變其對(duì)正常細(xì)胞無殺傷的特性［3－4］。

本課題組前期通過構(gòu)建原核表達(dá)載體在大腸桿菌中表達(dá)獲得的Pep－1－VP3融合蛋白，理論上具有增強(qiáng)VP3蛋白的跨膜能力，然而，由于原核表達(dá)存在工程菌表達(dá)量低，表達(dá)產(chǎn)物有包涵體需變性復(fù)性，以及分離和純化蛋白技術(shù)受限等原因，使得制備的產(chǎn)物在后續(xù)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中結(jié)果并不令人滿意［5］。為解決以上難題，筆者選用腺病毒做為載體，通過細(xì)菌內(nèi)同源重組法構(gòu)建攜帶VP3基因的重組腺病毒質(zhì)粒以期對(duì)VP3功能做進(jìn)一步深入研究，現(xiàn)將制備過程報(bào)告如下。

1 材料與方法

1．1 材料

重組質(zhì)粒PET15b－VP3、含腺病毒骨架質(zhì)粒pAdeasy－1的超感受態(tài)菌BJ5183、腺病毒穿梭質(zhì)粒pShuttle－IRES－h(huán)rGFP－2和XL10－Gold、DH5α、DNA ladder、dNTP、pfuDNA聚合酶，EcoRⅤ、Pmel、PacI、牛小腸堿性磷酸酶(CIAP)、細(xì)菌培養(yǎng)用胰蛋白胨和酵母提取物均由湖北醫(yī)藥學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)研究所提供;其余生化試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。PCR儀(Biometra，德國(guó))、超速冷凍離心機(jī)(HCP80MX日本)、凝膠圖像分析系統(tǒng)(Touching 995gel document system，上海)、恒溫水浴搖床(SHY－2，江蘇)。

1．2 方法

1．2．1 目的基因VP3獲得以1 μL重組質(zhì)粒PET15b－VP3為模板，20 mmol/L的上下游引物各10 μL，10×buffer10 μL，50×dNTP2 μL，pfuDNA聚合酶1 μL加蒸餾水至總反應(yīng)體積65 μL。VP3－cDNA擴(kuò)增引物:上游引物P1:5’－GCTAGCACTAGTGATATCATGAACGCTCTCCAAGAA3－’;下游引物P2:5’－GTCGACCGATCGGATATCTTACAGTCTTATACGCCT－3’，劃線部分為EcoRⅤ酶切位點(diǎn)，斜體部分與線性化穿梭質(zhì)粒pShuttle－IRES－h(huán)rGFP－2切口兩端序列同源，以便靶向同源重組，擴(kuò)增產(chǎn)物402 bp，引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反應(yīng)條件:預(yù)變性95℃3 min，變性95℃30 s，退火68℃1 min，延伸68℃30 s，35次循環(huán)，最后72℃延伸10 min。1．5%普通瓊脂糖凝膠電泳鑒定獲得PCR產(chǎn)物，0．8%低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳回收402 bpVP3目的基因片段。

1．2．2 pShuttle－VP3－EGFP重組穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定將EcoRⅤ酶切線性化的穿梭質(zhì)粒pShuttle－IRES－h(huán)rGFP－2和目的基因VP3采用PCR產(chǎn)物定向同源重組方式連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，取單克隆菌落進(jìn)行PCR鑒定，PCR反應(yīng)體系共50 μL如下:10×buffer 5 μL，50×dNTP(10 mmol/L)1 μL，10×上游引物P1 5 μL，10×下游引物P2 5 μL，pfuDNA聚合酶1 μL，含重組質(zhì)粒的菌落1 μL、加去離子水至50 μL，鑒定正確后大量培養(yǎng)細(xì)菌，抽提質(zhì)粒DNA并進(jìn)行EcoRⅤ酶切電泳鑒定。

1．2．3 pAd－VP3－EGFP重組腺病毒質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定取上述鑒定正確的pShuttle－VP3－EGFP重組穿梭質(zhì)粒經(jīng)PmeI酶切24 h后，直接用3 mol/LNaAc和無水乙醇沉淀DNA，70%的乙醇漂洗沉淀，離心后棄上清，用牛小腸堿性磷酸酶(CIAP)37℃恒溫水浴箱中溫育1 h后在50℃恒溫烤箱上去磷酸化2 h，經(jīng)酚、氯仿抽提后轉(zhuǎn)化含腺病毒骨架質(zhì)粒pAdeasy－1的超感受態(tài)大腸桿菌BJ5183，次日挑取2個(gè)單克隆菌落，小量培養(yǎng)，堿裂解法小量提取質(zhì)粒，經(jīng)PacI酶切，0．8%瓊脂糖凝膠電泳，若出現(xiàn)一大于23 kb和45 kb或30 kb的特征性條帶，即為陽(yáng)性質(zhì)粒，將重組的pAd－VP3－EGFP在XL10－Gold中大量擴(kuò)增并抽提質(zhì)粒，送上海生工生物工程技術(shù)有限公司進(jìn)行DNA測(cè)序。

2 結(jié)果

2．1 目的基因VP3的獲得

以PET15b－VP3為模板，根據(jù)VP3上下游引物PCR擴(kuò)增后，1．5%普通瓊脂糖凝膠電泳可見特征性402bpVP3基因擴(kuò)增片斷(圖1)。

圖1 VP3目的基因的PCR擴(kuò)增

2．2 pShuttle－VP3－EGFP重組穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

擴(kuò)增產(chǎn)物VP3cDNA含EcoRⅤ酶切位點(diǎn)，且末端序列與線性化pShuttle－IRES－h(huán)rGFP－2相同，與經(jīng)EcoRⅤ酶切后的線性化穿梭質(zhì)粒pShuttle－IRES－h(huán)rGFP－2混合，在同源重組酶作用下可發(fā)生同源重組，形成穿梭質(zhì)粒pShuttle－VP3－EGFP，將穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿

菌DH5α，取轉(zhuǎn)化菌液在含卡那霉素的TB瓊脂糖上鋪板，次日分別取多個(gè)單克隆菌落進(jìn)行PCR擴(kuò)增后經(jīng)1．5%瓊脂糖凝膠電泳可見到特征性的402 bp條帶(圖2)，將鑒定陽(yáng)性的克隆菌落大量培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒DNA經(jīng)EcoRⅤ酶切后電泳獲得8．9 kb和402 bp 2條帶(圖3)，證明目的基因VP3已成功插入到穿梭質(zhì)粒pShuttle－IRES－h(huán)rGFP－2中。

圖2 pShuttle－VP3－EGFP重組穿梭質(zhì)粒VP3基因擴(kuò)增

圖3 pShuttle－VP3－EGFP重組穿梭質(zhì)粒EcoRⅤ酶切電泳

2．3 pAd－VP3－EGFP重組腺病毒質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

pShuttle－VP3－EGFP轉(zhuǎn)化含pAdeasy－1的超感受態(tài)大腸桿菌BJ5183后，含有重組質(zhì)粒的細(xì)菌可在含卡那霉素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)形成克隆菌落，挑取轉(zhuǎn)化克隆菌落，小量提取質(zhì)粒DNA，用PacI酶切重組腺病毒質(zhì)粒出現(xiàn)一大于23 kb和45 kb的片段(圖4)，說明pAdeasy－1與pShuttle－VP3－EGFP在復(fù)制起始位點(diǎn)與右臂之間發(fā)生了同源重組。pAd－VP3－EGFP中的目的質(zhì)粒基因測(cè)序結(jié)果顯示與GeneBank報(bào)道的CAV中的VP3 CDNA序列相一致，證明VP3目的基因已經(jīng)成功插入到骨架質(zhì)粒pAdeasy－1中。

圖4 pAd－VP3－EGFP重組腺病毒質(zhì)粒PacI酶切電泳

3 討論

腺病毒既可以感染分裂期細(xì)胞，也可感染增殖期細(xì)胞，且可在感染的細(xì)胞內(nèi)獲得高效的基因表達(dá)，具有轉(zhuǎn)染率高和靶向性好等優(yōu)點(diǎn)，是當(dāng)前構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒最常用的運(yùn)載工具［6－7］。本文中，我們采用基因工程手段構(gòu)建攜帶目的基因VP3的重組腺病毒質(zhì)粒，為后續(xù)進(jìn)一步研究VP3蛋白的核定位及抗腫瘤效應(yīng)并探討機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

本研究首先通過設(shè)計(jì)5‘端帶有pShuttle－IRES－h(huán)rGFP－2穿梭質(zhì)粒EcoRⅤ酶切線性化末端18個(gè)堿基的上下游引物對(duì)VP3目的基因進(jìn)行擴(kuò)增，使擴(kuò)增產(chǎn)物與EcoRⅤ酶切后的線性化pShuttle－IRES－h(huán)rGFP－2具有相同的粘性末端，在同源重組酶的催化下易發(fā)生同源重組，然后用腺病毒骨架質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BJ5183，再用PmeI線性化攜帶目的基因的重組穿梭質(zhì)粒pShuttle－VP3－EGFP，轉(zhuǎn)化含腺病毒骨架質(zhì)粒pAdeasy－1的超感受態(tài)大腸桿菌BJ5183，制備pAd－VP3－EGFP，通過抗性基因初篩，再經(jīng)PCR和質(zhì)粒抽提酶切及測(cè)序等方法對(duì)構(gòu)建的重組質(zhì)粒做進(jìn)一步鑒定。上述兩次同源重組過程均在細(xì)菌內(nèi)進(jìn)行，與以往在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行同源重組相比較，具有明顯的優(yōu)勢(shì)，一是重組效率高，由于細(xì)菌繁殖能力強(qiáng)，對(duì)周圍環(huán)境要求不高，且同源重組能力強(qiáng)，故可大大提高重組的成功率。二是由于細(xì)菌內(nèi)質(zhì)粒抽提、酶切及PCR擴(kuò)增等技術(shù)均較在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行DNA操作更加簡(jiǎn)單易行，故使得整個(gè)操作過程更加簡(jiǎn)便快捷［8］。

本研究中還使用了XL10－Gold，因其具有RecA和EndA1缺陷，可確保成功重組的腺病毒質(zhì)粒pAd－VP3－EGFP在其內(nèi)擴(kuò)增時(shí)可大大提高提取質(zhì)粒的質(zhì)量和插入外源基因VP3的穩(wěn)定性。下一步擬將pAd－VP3－EGFP重組質(zhì)粒經(jīng)PacI酶切線性化后，通過脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染入Ad293細(xì)胞內(nèi)包裝成重組腺病毒，通過在熒光顯

微鏡下觀察293細(xì)胞內(nèi)有無綠色熒光蛋白表達(dá)來判斷質(zhì)粒是否轉(zhuǎn)染成功，取第一代病毒上清再轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，如果細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)了綠色熒光，即說明包裝的重組腺病毒具有一定的感染性，然后，依上述方法取第二代上清重復(fù)感染293細(xì)胞，即可獲得高滴度的重組腺病毒，將其感染腫瘤細(xì)胞，即可對(duì)其抗腫瘤效應(yīng)及作用機(jī)制探討等進(jìn)行后續(xù)研究。

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Construction and Identification of Recombinant Adenovirus Plasmid Containing Apoptin VP3 Gene

DENG Shouming，CAI Zhaozhong．China MCC5 Group Corp．ltd Hospital，Chengdu，610081

ObjectiveTo construct recombinant adenovirus plasmid containing apoptin VP3 gene．MethodsThe VP3 cDNA primers were designed，the DNA sequence of VP3 was amplified from recombinant vector PET15b－VP3 and ligated into pShuttle－IRES－h(huán)rGFP－2，the recombinant plasmid was named after pShuttle－VP3－EGFP and was identified with PCR and EcoRⅤdigestion;pShuttle－VP3－EGFP was linealized with PmeI and transformed into ultracompletent BJ5183 containing pAdeasy－1，then recombinant adenovirus pAd－vp3－EGFP was constructed by homologous recombination in bacteria．The recombinant adenoviral plasmid pAd－VP3－EGFP was identified by PCR，PacI digestion and DNA sequencing．ResultsThere were 2 bands 4．5 kb and larger than 23 kb when pAd－VP3－EGFP was digested with PacI．A 402 bp VP3 cDNA fragment was amplified by PCR．The target gene VP3－EGFP was successfully cloned into adenovirus，The sequence of VP3 segment was identical with that published in Gen－Bank．ConclusionHomologous recombination in bacteria can efficiently and conveniently construct high quality recombinant adenovirus containing VP3 and enhanced green fluorescent protein gene，which provides a basis for VP3 further research in cancer therapy．

Homologous recombination;Apoptin;Adenovirus;Enhanced green fluorescent protein(EGFP)

10．3969/j．issn．1001－5930．2015．07．002

R73－36

:A

:1001－5930(2015)07－0954－04

2014－10－16

2015－03－06)

(編輯:吳小紅)

湖北省教育廳基金(B20122413);湖北省衛(wèi)生廳基金(QJX2008－42)

610081中國(guó)五冶集團(tuán)有限公司醫(yī)院(鄧守明);442000湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院(蔡召忠)

蔡召忠