李月碧，李瑞鵬，趙 迪，楊 京，張衛(wèi)華，劉 舟，劉華東，馬世平**

1中國(guó)藥科大學(xué)中藥藥理學(xué)教研室，南京 211198；2南京中醫(yī)藥大學(xué)，南京 210046

黃連溫膽湯改善2型糖尿病大鼠糖脂代謝紊亂*

李月碧1，李瑞鵬1，趙 迪1，楊 京1，張衛(wèi)華2**，劉 舟2，劉華東2，馬世平1**

1中國(guó)藥科大學(xué)中藥藥理學(xué)教研室，南京 211198；2南京中醫(yī)藥大學(xué)，南京 210046

目的：考察黃連溫膽湯改善2型糖尿病引起的大鼠糖脂代謝紊亂作用。方法：通過(guò)60天高糖高脂飼料喂養(yǎng)合并一次性35 mg·kg-1鏈脲佐霉素（STZ）腹腔注射制備2型糖尿病大鼠模型，測(cè)定血糖，篩選模型成功大鼠。將該大鼠分為空白組、模型組、二甲雙胍組（0.2 g·kg-1）和黃連溫膽湯3、6、12 g·kg-1三個(gè)劑量組，連續(xù)給藥30天。測(cè)定血清中空腹血糖（FBG）、血清胰島素（FINS）、糖化血紅蛋白（GHB）、胰島素敏感系數(shù)（ISI）、胰島素抵抗系數(shù)（IRI）、甘油三酯（TG）、總膽固醇（CHO）、低密度脂蛋白膽固醇（LDLC）和高密度脂蛋白膽固醇（HDLC），評(píng)估黃連溫膽湯對(duì)大鼠糖脂代謝紊亂的調(diào)節(jié)作用。HE染色后觀察胰腺病變。結(jié)果：黃連溫膽湯能降低FBG、GHB，增加ISI，降低IRI；降低血清TG、CHO和LDLC含量，升高HDLC含量；但對(duì)FINS作用不明顯。此外，黃連溫膽湯與模型組相比減輕了胰腺細(xì)胞變性，改善胰島病變。結(jié)論：黃連溫膽湯可以有效地改善2型糖尿病引起的糖脂代謝紊亂，保護(hù)胰腺細(xì)胞，其作用機(jī)制可能與改善胰島素敏感性和胰島素抵抗有關(guān)。

代謝紊亂；糖尿??；胰島素抵抗

糖尿病是近年來(lái)的一類高發(fā)疾病，主要分為1型和2型。其中以2型糖尿?。═2DM）患者為主，占糖尿病總體人數(shù)的90%以上。2009年第20屆國(guó)際糖尿病聯(lián)盟（IDF）會(huì)議中指出，目前世界上已有近3億T2DM患者，如不立即采取行動(dòng)，到2030年T2DM患者將達(dá)4.4億。T2DM是一類主要以糖脂代謝紊亂為主要特征[1]的疾病，能引起多種并發(fā)癥的發(fā)生[2]。有資料表明，糖脂代謝紊亂是導(dǎo)致糖尿病并發(fā)癥的重要原因[3]，因此糖脂代謝紊亂的改善可能對(duì)糖尿病及其并發(fā)癥的治療有重要意義。

黃連溫膽湯出自《六因條辨》，由黃連、竹茹、半夏、陳皮、枳實(shí)、茯苓、甘草、生姜8味藥材組成，具有清熱化痰、理氣和中等功效；現(xiàn)代臨床研究發(fā)現(xiàn)它對(duì)T2DM具有潛在的治療作用[4]。本實(shí)驗(yàn)主要針對(duì)其改善糖脂代謝紊亂的作用進(jìn)行研究，為糖尿病及其并發(fā)癥的治療提供依據(jù)。

1 材 料

1.1 藥材與試劑

黃連（Coptis chinensis）、竹茹（Caulis Bambusae in Taeniam）、半夏 （Pinellia ternata Breit.）、陳皮（Pericarpium Citri Reticulatae）、枳實(shí)（Citrus aurantium L.）、茯苓 （Wolfiporia cocos）、甘草（Glycyrrhizae）、生姜（Zingiber officinale Roscoe）均購(gòu)自先聲再康藥店，由中藥資源學(xué)教研室秦民堅(jiān)教授鑒定確認(rèn)。

葡萄糖（FBG批號(hào)：20131006147），糖化血紅蛋白（GHB，批號(hào)：20140228），甘油三酯（TG，批號(hào)：20140115），總膽固醇（CHO，批號(hào)：20140115），低密度脂蛋白膽固醇（LDLC，批號(hào)：20130722），高密度脂蛋白膽固醇（HDLC，批號(hào)：20130717）測(cè)試試劑盒，胰島素Elisa試劑盒（USA）均購(gòu)自南京建成生物有限公司。

STZ購(gòu)自sigma公司，用檸檬酸檸檬酸鈉緩沖液（pH=4.4）配制成10 mg·mL-1的溶液，避光保存，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2 儀器

酶標(biāo)儀（Thermo，美國(guó)）；低溫離心機(jī)（Kubota，日本）；722紫外分光光度計(jì) （上海菁華科技儀器有限公司）；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 （常州國(guó)華電器有限公司）；BX50型光學(xué)顯微鏡 （日本Olympus公司）；RM2235型石蠟切片機(jī)（德國(guó)Leica公司）；電子天平（北京賽多利斯天平有限公司）等。

1.3 動(dòng)物

清潔級(jí)雄性SD大鼠90只，購(gòu)自江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK（蘇）2009-0002，體重180～200 g。動(dòng)物分籠飼養(yǎng)，12 h晝夜節(jié)律，室溫22℃～24℃，自由飲食飲水。

2 方 法

2.1 藥材處理

黃連溫膽湯中各藥物的比例按照清代陸廷珍《六因條辨》原方的比例（黃連∶竹茹∶半夏∶枳實(shí)∶陳皮∶茯苓∶甘草∶生姜＝4∶4∶4∶4∶6∶3∶2∶2）。將飲片浸泡30 min，水煎煮兩次，每次煎30 min，用紗布趁熱濾過(guò)，60℃恒溫水浴濃縮至1.2 g·mL-1，冷藏備用。

2.2 動(dòng)物分組與2型糖尿病模型的建立

將大鼠按體重隨機(jī)分6組，分為空白組和模型1～5組。除空白組外各組均用高糖、高脂飼料（10%豬油、15%蔗糖、5%蛋黃粉、0.5%膽固醇、0.5%膽酸鹽、69%常規(guī)飼料）喂養(yǎng)60天后，腹腔注射STZ 35 mg·kg-1。一周后測(cè)定其隨機(jī)血糖，篩選隨機(jī)血糖值＞13.9 mmol·L-1的大鼠作為模型成功大鼠。將模型成功大鼠60只按血糖值隨機(jī)分為模型組、二甲雙胍組（0.2 g kg-1）、黃連溫膽湯低、中、高三個(gè)劑量組（生藥材量3、6、12 g·kg-1）6組，每組10只，并于每日9～11時(shí)進(jìn)行一次灌胃給藥，連續(xù)給藥30天。

2.3 血液樣本和組織樣本的收集

給藥結(jié)束后，禁食12h，各組大鼠眼眶取血2mL。靜置后，3500 r·min-14℃離心10 min，吸取上層血清，保存于-20℃?zhèn)溆?。之后每組留3只大鼠，其余大鼠麻醉并處死，再斷頭取血約4 mL置于已加入0.5 mL 15%的EDTA Na抗凝溶液中，上下顛倒混勻。靜置30 min后，1000 r·min-1離心10 min（4℃），棄上清液，洗滌2～3次后，取沉淀，即血細(xì)胞。取血細(xì)胞1 mL加雙蒸水1.5 mL，用手激烈振搖數(shù)分鐘后，制得溶血液，保存在-20℃?zhèn)溆谩?/p>

將每組留取的3只大鼠麻醉后，進(jìn)行心室灌注100 mL PBS和150 mL 4%多聚甲醛，取出大鼠胰腺，置于10%福爾馬林溶液中固定，備用。

2.4 生化指標(biāo)的測(cè)定

從-20℃取出血清，待樣本解凍后，按試劑盒說(shuō)明書(shū)要求測(cè)定FBG、TG、CHO、LDLC、HDLC含量，ELISA法測(cè)定FINS含量。并按照Haffner等[5]在Homa模型中的方法測(cè)IRI和ISI：

胰島素抵抗系數(shù)的計(jì)算式：IRI=FBG×FINS/ 22.5；

胰島素敏感指數(shù)[6]：ISI=-Ln（FBG×FINS）。

2.5 GHB的測(cè)定

從-20℃取出血溶血液，解凍后用試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行酸化、水解、顯色等步驟，并測(cè)定溶血液中血紅蛋白含量，最后計(jì)算每10 g血紅蛋白中糖化血紅蛋白的吸光度值。

2.6 胰腺的藥理學(xué)檢測(cè)

取出福爾馬林溶液中的大鼠胰腺，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，進(jìn)行石蠟包埋。之后在石蠟切片機(jī)上切片，進(jìn)行HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察胰腺和胰島結(jié)構(gòu)的病變。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié) 果

3.1 黃連溫膽湯對(duì)糖尿病大鼠糖代謝紊亂的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，糖尿病模型組大鼠與空白組相比FBG和GHB明顯升高，F(xiàn)INS變化不明顯，ISI降低，IRI升高（P＜0.05或P＜0.01）。黃連溫膽湯各劑量組和二甲雙胍組能明顯增高ISI，降低IRI，抑制FBG和GHB含量的升高（P＜0.05或P＜0.01），但對(duì)FINS的改變不明顯，結(jié)果見(jiàn)表1。

3.2 黃連溫膽湯對(duì)糖尿病大鼠脂質(zhì)代謝紊亂的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，糖尿病模型組大鼠與空白組相比TG、CHO和LDLC含量升高，HDLC含量降低（P＜0.05或P＜0.01）。黃連溫膽湯各劑量組和二甲雙胍組能明顯增加HDLC含量，抑制TG、CHO和LDLC的含量升高（P＜0.05或P＜0.01），見(jiàn)表2。

3.3 黃連溫膽湯對(duì)胰腺病變的影響

圖1中空白組大鼠胰腺呈分葉狀，內(nèi)、外分泌部之胰島細(xì)胞和腺泡上皮無(wú)變性、壞死，間質(zhì)血管無(wú)充血及炎細(xì)胞浸潤(rùn)；而糖尿病模型組大鼠和空白組相比胰島的結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變，細(xì)胞數(shù)目減少且重度變性及壞死，部分導(dǎo)管空泡變性；而二甲雙胍組和黃連溫膽湯各劑量組胰島的結(jié)構(gòu)較模型組清晰，細(xì)胞變性減輕，導(dǎo)管空泡變性也有所減輕。

表1 黃連溫膽湯對(duì)糖尿病大鼠糖代謝紊亂的影響（±s，n=10）

表1 黃連溫膽湯對(duì)糖尿病大鼠糖代謝紊亂的影響（±s，n=10）

注：“##”表明與空白組相比P<0.01，統(tǒng)計(jì)學(xué)有極顯著差異，“#”表明與空白組相比P<0.05，統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著性差異；同樣“**”表明與模型組相比P< 0.01，統(tǒng)計(jì)學(xué)有極顯著差異，“*”表明與模型組相比P<0.05，統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著性差異。

組別劑量（g·kg-1）FBG（mmol·L-1）FINS（mU·L-1）IRI ISI GHB（吸光度/10 g蛋白）空白—4.54±0.39 12.03±1.58 2.37±0.37 -3.97±0.16 20.08±9.17模型—25.2±7.16##10.83±1.23 13.97±6.03##-5.67±0.46##46.38±10.10##二甲雙胍0.2 11.13±5.50**9.21±5.31 3.11±1.98**-4.40±0.91*19.67±6.58**黃連溫膽湯（低）3 13.65±6.42*9.54±2.25 5.14±1.85*-4.89±0.54*31.67±6.81*黃連溫膽湯（中）6 11.98±5.26*8.75±2.62 4.93±2.88**-4.54±0.63**30.32±3.94*黃連溫膽湯（高）12 11.43±5.32**9.22±1.24 4.60±1.91**-4.54±0.53**26.06±10.45*

表2 黃連溫膽湯對(duì)糖尿病大鼠脂質(zhì)代謝紊亂的影響（±s，n=10）

表2 黃連溫膽湯對(duì)糖尿病大鼠脂質(zhì)代謝紊亂的影響（±s，n=10）

注：“##”表明與空白組相比P<0.01，統(tǒng)計(jì)學(xué)有極顯著差異，“#”表明與空白組相比P<0.05，統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著性差異；同樣“**”表明與模型組相比P<0.01，統(tǒng)計(jì)學(xué)有極顯著差異，“*”表明與模型組相比P<0.05，統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著性差異。

組別劑量（g·kg-1）LDLC（mmol·L-1）HDLC（mmol·L-1）TG（mmol·L-1）CHO（mmol·L-1）空白—0.77±0.13 0.74±0.18 0.73±0.18 1.40±0.12模型—4.99±1.81##0.48±0.11#3.71±0.57##9.22±1.49##二甲雙胍0.2 1.08±0.16**0.80±0.19*0.80±0.23**3.50±0.79**黃連溫膽湯（低）3 1.35±0.55**0.72±0.19*2.24±0.75**6.10±1.57**黃連溫膽湯（中）6 1.12±0.46**0.85±0.26*2.15±0.42**5.56±1.06**黃連溫膽湯（高）12 0.97±0.30**1.33±0.47**1.94±0.57**5.26±0.91**

圖1 黃連溫膽湯對(duì)胰腺病變的影響

4 討 論

T2DM是現(xiàn)代人類常見(jiàn)病多發(fā)病，目前普遍認(rèn)為T(mén)2DM的發(fā)病，是遺傳和環(huán)境因素所致的綜合結(jié)果。胰腺是胰島聚集部位，分泌胰島素從而調(diào)節(jié)糖脂代謝。胰島細(xì)胞根據(jù)分泌功能不同分為胰島A細(xì)胞和B細(xì)胞，其中胰島B細(xì)胞是胰島素的主要分泌細(xì)胞。STZ是一種選擇性破壞胰腺B細(xì)胞的毒性物質(zhì)，是目前制備糖尿病模型的常用試劑之一[7]。而體內(nèi)過(guò)多的糖和脂質(zhì)攝入引起的糖毒性和脂毒性是加劇胰島B細(xì)胞損傷甚至凋亡的主要原因[8-9]。本文采用長(zhǎng)期的高糖高脂飲食配合小劑量STZ腹腔注射制備糖尿病大鼠模型。在胰腺的病理切片中，能明顯地觀察到模型組大鼠的胰腺中胰島結(jié)構(gòu)不清，細(xì)胞重度變性，血管空泡變性等現(xiàn)象，這表明模型建立成功，糖尿病導(dǎo)致了大鼠胰島功能受損，而黃連溫膽湯給藥組對(duì)這一病變有一定的改善作用。

胰島素是調(diào)節(jié)糖脂代謝的重要激素[10]，由胰腺B細(xì)胞分泌入血，分布到全身各處，與各處胰島素受體結(jié)合，激活胰島素信號(hào)通路，從而調(diào)節(jié)全身各處的糖脂代謝等。胰島素抵抗指正常的胰島素?zé)o法引起胰島素的正常生理應(yīng)答，即胰島素敏感性降低。ISI和IRI是近年來(lái)人們?cè)u(píng)估胰島素敏感性和胰島素抵抗的兩項(xiàng)重要指標(biāo)。在本實(shí)驗(yàn)中T2DM模型組大鼠血清中胰島素含量與正常大鼠相比無(wú)明顯變化，但I(xiàn)SI降低，IRI升高；這提示糖尿病中胰島素的分泌并沒(méi)有出現(xiàn)很大變化，但胰島素敏感性降低，發(fā)生了胰島素抵抗。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，二甲雙胍組和黃連溫膽湯各劑量組與模型組的相比能明顯升高ISI，降低IRI，升高的血糖血脂指標(biāo)也相應(yīng)的有所降低。因此可以推測(cè)二甲雙胍和黃連溫膽湯可能是通過(guò)改善了胰島素敏感性，改善胰島素抵抗，從而改善了糖脂代謝紊亂的狀況。

綜上所述，黃連溫膽湯能有效地改善2型糖尿病大鼠體內(nèi)的代謝紊亂狀況，其作用機(jī)制可能與改善胰島素敏感性和胰島素抵抗有關(guān)。

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Protective Effect of Huanglian Wendan Decoction on Metabolism Disorder in a Rat Model of Type 2 Diabetic Mellitus

LI Yue-bi1,LI Rui-peng1,ZHAO Di1,YANG Jing1,ZHANG Wei-hua2**,LIU Zhou2,LIU Hua-dong2,MA Shi-ping1**1China Medicine University Chinese Medicine Pharmacology,Nanjing 211198;2Nanjing University of Chinese Medicine,Nanjing 210046

Objective:The aim of this study is to investigate the therapeutical effect of Huanglian Wendan decoction on metabolism disorder in a rat model of type 2 diabetic mellitus.Methods:60 days high-glucose-high-fat diet and 35 mg·kg-1streptozocin(STZ)injection once were used to bulid a rat model of type 2 diabetic mellitus.Following,metformin hydrochloride(0.2 g·kg-1),berberine hydrochloride(0.2 g· kg-1),HLWDD(3,6,12 g·kg-1)were given by gavage for 30 days except normal and model groups after randomly divided into six groups.Relate measurements about glucose and lipid metabolism in serum were did,and insulin sensitivity index (ISI)and insulin resistance index (IRI)were calculated to evaluate the improvement of Huanglian Wendan decoction on metabolism disorder.The pathological damage of pancreas was observed by a HE staining.Results:30 days administration of Huanglian Wendan decoction to the rats reduced fast blood glucose(FBG),glycosylated hemoglobin(GHB),IRI,triglyceride(TG),total cholesterol (CHO)and low density lipoprotein cholesterol (LDLC)in serum;increased ISI and high density lipoprotein cholesterol (HDLC).However,its effect to FINS can not significantly observed.Treatment of HLWDD to rats also protected them from pathological damage of pancreas.Conclusion:Treatment of Huanglian Wendan decoction protects rats from metabolism disorder and pathological damage of pancreas in a rat model of type 2 diabetic mellitus significantly.Its mechanism may related to the improvement on insulin sensitivity and insulin resistance.

Metabolism disorder;Diabetic mellitus;Insulin resistance

R965.1

A

1673-7806（2015）01-001-04

教育部博士點(diǎn)基金（20113237120007）；江蘇省中醫(yī)藥局科技項(xiàng)目（LZ13001）；江蘇省高校自然科學(xué)研究計(jì)劃（12KJD360002）

李月碧，女，碩士研究生，研究方向：中藥及復(fù)方藥理研究 E-mail:liyuebi19900920@163.com

* *通訊作者馬世平，男，博士研究生導(dǎo)師，研究方向：中藥及復(fù)方藥理研究 E-mail:spma@cpu.edu.cn；張衛(wèi)華，男，講師，博士，研究方向：治法與方劑配伍的理論與實(shí)驗(yàn)研究 E-mail:zwhtcm@sina.com

2014-10-15

2014-10-29