朱凌鵬，常廈云，何 賀，高 瑾，顏天華

中國(guó)藥科大學(xué)生理教研室，南京 210009

紅景天苷對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的小鼠心肌損傷保護(hù)作用的研究*

朱凌鵬，常廈云，何 賀，高 瑾，顏天華**

中國(guó)藥科大學(xué)生理教研室，南京 210009

目的：研究紅景天苷對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的小鼠心肌損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。方法：選取雄性Balb/c小鼠50只，隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、地塞米松組、紅景天苷低、高劑量組。地塞米松和紅景天苷高、低劑量連續(xù)灌胃7 d，每天1次，最后一次灌胃后1 h，除對(duì)照組外，其余各組腹腔注射LPS，12 h后處死，取血和心臟。結(jié)果：紅景天苷組小鼠心肌病理改變明顯減輕于模型組；相比于模型組，紅景天苷組能減少血清中TNF-α、IL-6的含量；減少心肌組織中TLR4、MyD88和NF-資Bp65蛋白的表達(dá)。結(jié)論：紅景天苷減輕脂多糖誘導(dǎo)的小鼠心肌損傷，其機(jī)制可能通過調(diào)節(jié)TLR4/MyD88/NF-資Bp65信號(hào)通路，抑制炎癥反應(yīng)。

脂多糖；膿毒癥；炎癥

膿毒癥指由感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征，是各種損傷、創(chuàng)（燒）傷、休克、外科大手術(shù)后常見的并發(fā)癥，進(jìn)一步發(fā)展可導(dǎo)致膿毒性休克、多器官功能不全綜合征（MODS），是危重患者死亡的重要原因之一。心肌損傷是膿毒癥常見并發(fā)癥之一，文獻(xiàn)報(bào)道，其損害可引起嚴(yán)重心律失常，心功能不全，心源性休克，并加重全身其它組織器官的缺血缺氧損害[1]。紅景天為景天科景天屬Rhodiola L.多年生草本植物。紅景天苷（Salidroside，Sal）是紅景天的主要成分之一，近年來(lái)的研究結(jié)果表明，紅景天苷具有保護(hù)心腦血管系統(tǒng)、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、防輻射、抗衰老、抗疲勞和抗腫瘤等多種藥理作用[2-4]。然而，紅景天苷能否減輕內(nèi)毒素引起的心肌損傷尚不清楚。有研究表明，內(nèi)毒素可能通過細(xì)胞因子和自由基的作用引起心肌損傷和功能障礙[5]。脂多糖（LPS）通過Toll樣受體4（TLR-4）激活核因子-資B（NF-資B），誘導(dǎo)心肌細(xì)胞合成腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）、一氧化氮（NO）等，進(jìn)而引起心肌的損傷[6]。本實(shí)驗(yàn)主要從炎癥方面來(lái)研究紅景天苷對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的小鼠心肌損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器

680型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀 （上海眾生聲明科學(xué)發(fā)展有限公司）；TU-1800紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）。

1.2 藥品與試劑

紅景天苷（由第二軍醫(yī)大學(xué)提供，純度＞99%）；LPS （Sigma-Aldrich， St.Louis，MO，USA，0111：B4）；地塞米松（Dex，浙江仙琚制藥股份有限公司，120731）；TNF-α、IL-6 ELISA試劑盒（DAKEWE，DKW12-3720-096，DKW12-2060-096）。

1.3 動(dòng)物

50只雄性Balb/c小鼠（20～22 g）：購(gòu)于揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心（SCXK（蘇）201X-0001），并取得相應(yīng)的合格證。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組與給藥

選取雄性小鼠50只，隨機(jī)分為5組，每組10只：對(duì)照組、模型組、地塞米松組（Dex，2 mg·kg-1）、紅景天苷低、高劑量組（40 mg·kg-1、80 mg·kg-1）。給藥組連續(xù)灌胃7 d，每天1次，最后一次灌胃1 h后，除對(duì)照組外，其余各組腹腔注射LPS（15 mg·kg-1，ip），12 h后處死，取血和心臟。

2.2 心肌組織學(xué)觀察

腹腔注射LPS后12 h，處死小鼠，取出心臟于4%的甲醛溶液中固定，標(biāo)本于蠟制模具中切片后進(jìn)行HE染色，對(duì)心肌進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。

2.3 生化指標(biāo)測(cè)定

腹腔注射LPS后12 h，小鼠經(jīng)眼眶采血，3500 r·min-1，離心15 min后取上清液于-80℃保存?zhèn)溆?，測(cè)定血清中TNF-α和IL-6的含量。具體方法見相關(guān)試劑盒說明書。

2.4 Western blot測(cè)定相關(guān)蛋白含量

腹腔注射LPS后12 h，處死小鼠，取出心臟，加入細(xì)胞蛋白裂解液及蛋白酶抑制劑提取各組細(xì)胞總蛋白。采用BCA法測(cè)定各組細(xì)胞總蛋白濃度。蛋白經(jīng)過10%聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。5%BSA溶液中室溫封閉膜1 h，TBST洗膜。加入 TLR4、MyD88、NF-資Bp65、GAPDH抗體 （Santa Cruz公司），4℃過夜，TBST洗膜。加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二級(jí)抗體，室溫孵育膜1 h。TBST洗膜6次，每次5 min。X光膠片曝光顯影。用quantity one軟件計(jì)算條帶灰度值，以顯示其蛋白表達(dá)量。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，ANOVA分析法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 紅景天苷對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠心肌組織結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)的改變

紅景天苷組、地塞米松組與對(duì)照組比較，小鼠心肌組織結(jié)構(gòu)未見明顯差別。模型組小鼠心肌組織水腫，肌原纖維腫脹、排列稀疏，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、纖維變性壞死，肌漿中有少量水泡；紅景天苷組心肌的病變明顯輕于模型組（見圖1）。

3.2 紅景天苷對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠血清中TNF-α和IL-6含量的影響

與對(duì)照組相比，模型組小鼠血清中TNF-α和IL-6含量顯著升高（P<0.01）；而與模型組相比，紅景天苷高、低組，地塞米松組小鼠血清中TNF-α和IL-6含量顯著降低（P<0.05，P<0.01）（見表1）。顯示其心肌保護(hù)作用可能與其抑制炎癥過程有關(guān)。

圖1 紅景天苷對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠心肌組織病理的影響

表1 紅景天苷對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠血清中TNF-α和IL-6含量的影響（±s，n=10）

表1 紅景天苷對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠血清中TNF-α和IL-6含量的影響（±s，n=10）

注：與對(duì)照組比較：##P<0.01；與模型組比較：**P<0.01，*P<0.05

組別劑量（mg·kg-1）TNF-α（pg·mL-1）IL-6（pg·mL-1）對(duì)照組-30.2±4.2 7.3±1.1模型組-112.3±15.6##23.4±3.2##地塞米松組2 52.3±9.1**11.8±1.7**紅景天苷組40 92.5±11.8*19.2±2.4*80 79.6±8.6**15.9±1.8**

3.3 紅景天苷對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠心肌中TLR4、MyD88和NF-kBp65蛋白的影響

與對(duì)照組相比，模型組小鼠心肌中 TLR4、MyD88和NF-資Bp65蛋白含量顯著升高 （P<0.01）；而與模型組相比，紅景天苷高、低組，地塞米松組小鼠心肌中TLR4、MyD88和NF-資Bp65蛋白含量顯著降低（P<0.05，P<0.01），見圖2。顯示其心肌保護(hù)作用可能與調(diào)節(jié)TLR4/MyD88/NF-資Bp65信號(hào)通路有關(guān)，進(jìn)而抑制炎癥反應(yīng)。

4 討 論

膿毒癥是一個(gè)相當(dāng)復(fù)雜的病理生理過程，是危重癥患者最常見的并發(fā)癥之一。目前對(duì)膿毒癥誘導(dǎo)的心肌損傷的可能機(jī)制為：細(xì)胞因子對(duì)心肌的損傷；缺血－再灌注和氧自由基損傷；心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2＋超載；能量代謝異常等。

膿毒癥時(shí)可產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，它們可直接或通過其他方式對(duì)心肌造成損傷。其中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細(xì)胞介素（IL）已被證明是膿毒癥發(fā)展過程中的中心介質(zhì)[7]。本研究結(jié)果顯示，紅景天苷能顯著降低LPS誘導(dǎo)的小鼠血清中TNF-α和IL-6含量；HE染色結(jié)果說明紅景天苷能減輕LPS誘導(dǎo)的病理?yè)p傷，表明紅景天苷能夠防治內(nèi)毒素性心肌損傷。TLR4/MyD88/NF-資Bp65信號(hào)通路與炎癥反應(yīng)有關(guān)，有研究顯示，內(nèi)毒素小鼠心肌中TLR4、MyD88和NF-資Bp65蛋白含量顯著升高，說明減少內(nèi)毒素小鼠心肌中TLR4、MyD88和NF-資Bp65蛋白表達(dá)對(duì)小鼠心肌具有保護(hù)作用[8]。本實(shí)驗(yàn)用quantity one軟件計(jì)算蛋白條帶灰度值，顯示蛋白表達(dá)含量，紅景天苷能降低LPS小鼠心肌中TLR4、MyD88和NF-資Bp65蛋白的含量，顯示其心肌保護(hù)作用可能通過抑制TLR4/MyD88/NF-資Bp65信號(hào)通路，進(jìn)而抑制炎癥反應(yīng)。

綜上所述，紅景天苷對(duì)膿毒癥小鼠的心臟損傷具有較好的保護(hù)作用，其機(jī)制可能是通過抑制TLR4/MyD88/NF-資Bp65信號(hào)通路來(lái)抑制炎癥反應(yīng)。

圖2 紅景天苷對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠心肌組織中TLR4、MyD88和NF-κBp65蛋白含量的影響

[1] Merx MW,Weber C.Sepsis and the heart[J].Circulation,2007,116(7):793-802.

[2] 李 劍，范維琥，敖 紅，等.中藥紅景天對(duì)大鼠缺血心肌Flt21、KDR及Tie22表達(dá)的影響[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，2005，25（5）：445-8.

[3]LIANG Xiao-Qing,XIE Pei,ZHANG Yong,et al.Effects of salidroside on myocardial ischemia/reperfusion injury in rats[J].CJNM,2010,8(2):127-131.

[4] 滕靜如，熊佳鵬，肖 誠(chéng)，等.紅景天的現(xiàn)代藥理學(xué)研究進(jìn)展[J].中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2006，12（4）：319.

[5] Karima R,Matsumoto S,Higashi H,et al.The molecular pathogenesis of endotoxic shock and organ failure [J].Mol Med Today,1999,5(3):123-32.

[6] Georg B,Pascal K,Naoki N,et al.In vivo expression of pro-inflammatory mediator in the adult heart after endotoxin administration:The role of Toll-like receptor-4[J].J Infect Dis,2001,183(11):1617-25.

[7] Feng Y,Zou L,Zhang M,et al.MyD88 and Trif signalinglaydistinct rolesin cardiacdysfunction and mortality duringendotoxin shock and polymicrobial sepsis[J].Anesthesiology,2011,115(3):555-67.

[8] Boyd JH,Mathur S,Wang Y,et al.Toll-likereceptor stimulation in cardiomyocytes decreases contractility and initiatesan NF-kappaB dependentinflammatoryresponse[J].Cardiovasc Res,2006,72(3):384-93.

The Protective Effect of Salidroside(Sal)on Lipopolysaccharide(LPS)-induced Myocardium Injury in Mice*

ZHU Ling-peng,CHANG Xia-yun,HE He,GAO Jin,YAN Tian-hua**
Department of Physiology,China Pharmaceutical University,Nanjing 210009

Objective:The aim of the study was to investigate the effect and mechanism of Salidroside (Sal)onlipopolysaccharide(LPS)-induced myocardium injury in mice.Methods:Fifty male Balb/c mice were divided into five groups(n=10):(1)control,(2)model:LPS,(3)positive:dexamethasone(Dex)+LPS,(4)and (5)treatment:high and low dose Sal+LPS.Dex and Sal were administered intragastrically once daily for 7 days.At the 7th day,LPS was injected intraperitoneally 1 h after drug administration.All the mice were sacrificed 12 h after LPS injection,and then the blood and hearts were collected.Results:Compared with the model group,cardiac pathologic changes of the Sal groups were significantly lighter.Dex and Sal significantly attenuated the serum levels of IL-6 and TNF-α;decreased TLR4,MyD88 and NF-資Bp65 protein expression in hearts.Conclusion:Salidroside could alleviate LPS-induced myocardial injury in mice;the anti-inflammatory effect might work through the TLR4/MyD88/NF-資Bp65 signaling pathway.

Lipopolysaccharide;Sepsis;Inflammation

R965.1

A

1673-7806（2015）01-013-03

十二五重大新藥創(chuàng)制項(xiàng)目（2011ZX09102-002-01）

朱凌鵬，男，碩士生，研究方向：心血管藥理學(xué)E-mail:zlp_7882@sina.com

* *通訊作者顏天華，男，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：心血管藥理學(xué) E-mail:13016931191@126.com

2014-07-12

2014-08-30