魏婷婷，孫繼紅，韓璐薇，王志強(qiáng)，季 暉**

1中國(guó)藥科大學(xué)藥理教研室，南京 210009；2南京圣和藥業(yè)股份有限公司，南京 210038

奧硝唑?qū)τ丑w對(duì)小鼠中樞抑制作用的機(jī)制探究*

魏婷婷1，孫繼紅1，韓璐薇2，王志強(qiáng)2，季 暉1**

1中國(guó)藥科大學(xué)藥理教研室，南京 210009；2南京圣和藥業(yè)股份有限公司，南京 210038

目的：探討右?jiàn)W硝唑中樞抑制效應(yīng)與腦內(nèi)γ-氨基丁酸（gamma amino butyric acid，GABA）系統(tǒng)的關(guān)系。方法：經(jīng)不同劑量右/左奧硝唑處理后使用N，N-二甲基二吖啶硝酸鹽（1-（Ethoxycarbonylmethyl）-6-methoxyquinolinium bromide，MQAE）熒光探針檢測(cè)原代培養(yǎng)小鼠皮層神經(jīng)元氯離子濃度，并通過(guò)western blot方法檢測(cè)GABAA受體亞基的表達(dá)。尾靜脈注射給予右/左奧硝唑后測(cè)定小鼠高架十字迷宮行為。結(jié)果：右?jiàn)W硝唑劑量依賴性激活小鼠皮層神經(jīng)元的氯離子通道，經(jīng)右?jiàn)W硝唑處理后的皮層神經(jīng)元能增加GABAA受體α1亞基的水平，且右?jiàn)W硝唑有潛在的抗焦慮活性。結(jié)論：右/左奧硝唑中樞作用不同，右?jiàn)W硝唑較強(qiáng)的中樞抑制作用可能與激活GABA系統(tǒng)有關(guān)。

右/左奧硝唑；氯離子通道；GABA系統(tǒng)

奧硝唑?yàn)榈?代硝基咪唑類衍生物，具有良好的抗厭氧菌、抗滴蟲和抗阿米巴原蟲作用，臨床上主要用于手術(shù)前預(yù)防感染和手術(shù)后抗敏感厭氧菌。但臨床應(yīng)用時(shí)會(huì)有肝損傷、腸胃不適、嘔吐、頭暈、嗜睡等消化系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)不良反應(yīng)[1]。前期研究發(fā)現(xiàn)，在藥效學(xué)作用無(wú)顯著性差別、藥代動(dòng)力學(xué)特征相似的前提下，右?jiàn)W硝唑?qū)π∈蟮闹袠幸种谱饔蔑@著強(qiáng)于左奧硝唑[2]，且右?jiàn)W硝唑的中樞作用能夠在一定程度上被GABAA受體拮抗劑所阻斷。

γ-氨基丁酸 （gamma amino butyric acid，GABA）為中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)主要的抑制性遞質(zhì)。動(dòng)物及人體內(nèi)的GABAA受體系五聚體大分子，由5個(gè)亞單位組成，分子的中心部位形成門控氯離子通道。每一亞單位包含1個(gè)大的細(xì)胞外N末端區(qū)、3個(gè)緊密排列的穿透胞膜的部分（M1-M3）、胞漿區(qū)（M4）及一短的胞外C末端[3]。當(dāng)GABA與其受體結(jié)合時(shí)，氯離子通道開放，氯離子進(jìn)入細(xì)胞，導(dǎo)致胞內(nèi)負(fù)電位增加，細(xì)胞由極化變?yōu)槌瑯O化，表現(xiàn)出鎮(zhèn)靜、抗焦慮等中樞抑制作用。

本研究采用 N，N-二甲基二吖啶硝酸鹽（MQAE）熒光探針，檢測(cè)奧硝唑?qū)τ丑w對(duì)原代培養(yǎng)小鼠皮層神經(jīng)元氯離子通道的影響，并通過(guò)western blot方法檢測(cè)給藥后GABAA受體α1亞基的表達(dá)。最后采用經(jīng)典高架十字迷宮實(shí)驗(yàn) （elevated plus maze，EPM）對(duì)奧硝唑?qū)τ丑w的抗焦慮作用進(jìn)行探究，從整體動(dòng)物水平佐證右?jiàn)W硝唑?qū)ABAA受體的作用。其目的為進(jìn)一步揭示奧硝唑?qū)τ丑w產(chǎn)生中樞抑制作用差異的作用機(jī)制及對(duì)臨床安全用藥提供指導(dǎo)。

1 儀器與材料

1.1 儀器CO2恒溫培養(yǎng)箱（Thermo Electron）；倒置顯微鏡 （OLYMPUS）；多功能酶聯(lián)免疫熒光檢測(cè)儀（SpectraMax M3型，Molecular Device）；日立CF16RⅫ高速冷凍離心機(jī)；SDS-PAGE電泳儀（Bio-RAD）；eBlot蛋白轉(zhuǎn)移系統(tǒng) （Genscript）；凝膠成像系統(tǒng)（Bio-RAD，美國(guó)）；彩色CCD（Bio-RAD）；自制小鼠高架十字迷宮測(cè)試儀[4]。

1.2 試劑與藥品

左奧硝唑（批號(hào)：20130904，純度99.8%）、右?jiàn)W硝唑（批號(hào)：20130506，純度：99.7%），均由南京圣和藥業(yè)股份有限公司提供，溶媒為含15%丙二醇的生理鹽水注射液；γ-氨基丁酸、N，N-二甲基二吖啶硝酸鹽（MQAE）、木瓜蛋白酶、DNA酶、GABAAα1、βactin抗體均購(gòu)于sigma公司；B27、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清均購(gòu)于Gibco公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（增強(qiáng)型，江蘇碧云天生物技術(shù)研究所）；蛋白裂解液 （Millipore，美國(guó)）；蛋白酶抑制劑混合片（Roche）；其他試劑均為市售分析純。

1.3 動(dòng)物

ICR種小鼠，體重18～22 g由揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（蘇）2012-0004。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 原代培養(yǎng)小鼠皮層神經(jīng)元

孕18天的ICR小鼠脫頸椎處死，無(wú)菌條件下取出胎鼠，迅速分離前額葉皮層，置于預(yù)冷的10% FBS DMEM培養(yǎng)液中，去除腦膜。將組織移入新鮮培養(yǎng)液并剪碎，加入木瓜蛋白酶及DNA酶后，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中消化30 min。消化過(guò)的組織塊1000 r·min-1離心5 min后，加入適量的10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液，調(diào)整細(xì)胞密度至2.5×105個(gè)/ mL，接種于預(yù)先包被多聚賴氨酸的培養(yǎng)板中，放置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4 h后更換為含2%B27的Neurobasal培養(yǎng)液，每48 h更換新鮮的Neurobasal培養(yǎng)液。

2.2 奧硝唑?qū)τ丑w對(duì)原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元氯離子通道激活作用的測(cè)定[5]

移除原有培養(yǎng)基，無(wú)氯緩沖液 （20 mmol·L-1HEPES，2.4mmol·L-1K2HPO4，0.6 mmol·L-1KH2PO4，1 mmol·L-1MgSO4，1 mmol·L-1CaSO4，130 mmol·L-1NaNO3，10 mmol·L-1glucose）洗滌細(xì)胞3次后，每孔加入100 μL，使細(xì)胞在含有5 mmol·L-1MQAE的Neurobasal培養(yǎng)液中避光37℃孵育40 min。溫?zé)岣呗染彌_液（130 mmol·L-1NaCl取代130 mmol·L-1NaNO3，其它成分同無(wú)氯緩沖液）洗滌細(xì)胞3次后，用SpectraMax M3熒光酶標(biāo)儀，在激發(fā)波長(zhǎng)360 nm和發(fā)射波長(zhǎng)450 nm的條件下測(cè)量基礎(chǔ)熒光值F0。細(xì)胞分別經(jīng)過(guò)0.2、2、20 μM右/左奧硝唑、100 μM GABA、高氯緩沖液處理后再次在激發(fā)波長(zhǎng)360 nm和發(fā)射波長(zhǎng)450 nm的條件下測(cè)量熒光值F。以測(cè)定時(shí)間點(diǎn)（trace time/second）為橫坐標(biāo)、相對(duì)熒光值（relative fluorescence，F(xiàn)/F0）為縱坐標(biāo)，作圖并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2.3 western blot檢測(cè)

分別用終濃度0.2、2、20 μM的右/左奧硝唑和10 μM地西泮處理細(xì)胞，48 h后離心收集細(xì)胞。每孔細(xì)胞加入適量的蛋白裂解液（Millipore，美國(guó)），冰上裂解10 min后收集細(xì)胞碎片及裂解液，12000 r· min-1、4℃離心10 min，取上清液，采用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。蛋白定量后在12%SDS-PAGE電泳條件下分離，轉(zhuǎn)染至NC膜（Millipore，美國(guó)），用5%BSA于室溫下?lián)u床封閉膜2 h。膜在抗GABAA受體α1（1∶500 sigma）和抗β-actin抗體 （1∶4000 sigma）稀釋液中4℃孵育過(guò)夜，1×T-BST洗膜5 min，共4次后，在二抗稀釋液（α1為抗兔，β-actin為抗鼠，稀釋比例均為1∶2000，sigma）中室溫孵育1 h。再次洗膜后加入發(fā)光液反應(yīng)3 min，置于凝膠成像系統(tǒng)曝光。

2.4 小鼠高架十字迷宮試驗(yàn)（EPM）

64只雄性ICR小鼠隨機(jī)分為右?jiàn)W硝唑組（10、20、40 mg·kg-1）、左奧硝唑組（10、20、40 mg·kg-1）、陰性對(duì)照組（含15%丙二醇的生理鹽水注射液）、陽(yáng)性對(duì)照組（地西泮，2 mg·kg-1），每組8只，雌雄各半。給藥10 min后，小鼠置于高架十字迷宮中央平臺(tái)，使其頭部正對(duì)其中一個(gè)開放臂，釋放后即開始記錄5 min內(nèi)下述指標(biāo)[6]：（1）進(jìn)入開放臂次數(shù)（open arm entry，OE）；（2）開放臂滯留時(shí)間 （open arm time，OT），單位為s；（3）進(jìn)入封閉臂次數(shù)（close arm en try，CE）；（4）封閉臂滯留時(shí)間（close arm time，CT），單位為s。開放臂和封閉臂總的進(jìn)入次數(shù)（OE+CE）反映小鼠的運(yùn)動(dòng)能力，開放臂滯留時(shí)間占總測(cè)定時(shí)間的百分比反映小鼠焦慮狀態(tài)。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié) 果

3.1 奧硝唑?qū)τ丑w對(duì)原代培養(yǎng)小鼠皮層神經(jīng)元氯離子通道的激活作用

如圖1所示，與陰性對(duì)照高氯緩沖液組相比，100 μM GABA能夠顯著降低氯離子熒光強(qiáng)度 （P＜0.01）。右?jiàn)W硝唑呈劑量依賴性地增加原代培養(yǎng)小鼠皮層神經(jīng)元氯離子通道開放，使胞外氯離子內(nèi)流，與細(xì)胞內(nèi)MQAE結(jié)合從而導(dǎo)致其熒光淬滅，熒光值F降低，F(xiàn)/F0值下降。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，右?jiàn)W硝唑可以顯著開放原代皮層神經(jīng)元上氯離子通道。而左旋奧硝唑增加原代皮層神經(jīng)元氯離子通道開放的能力明顯較弱，與陰性對(duì)照組相比，僅隨劑量升高有增加胞外氯離子內(nèi)流的趨勢(shì)，但所設(shè)三個(gè)劑量組與陰性對(duì)照組相比均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

圖1 奧硝唑?qū)τ丑w對(duì)原代培養(yǎng)小鼠皮層神經(jīng)元氯離子通道的影響（n=6）

3.2 奧硝唑?qū)τ丑w對(duì)原代培養(yǎng)小鼠皮層神經(jīng)元GABAA受體α1亞基表達(dá)的影響

經(jīng)地西泮和高劑量右?jiàn)W硝唑處理后，原代培養(yǎng)小鼠皮層神經(jīng)元的GABAA受體α1亞基上調(diào)，而左奧硝唑各劑量組均不能增加α1亞基的表達(dá)。見(jiàn)圖2。

圖2 奧硝唑?qū)τ丑w對(duì)原代培養(yǎng)小鼠皮層神經(jīng)元GABAA受體α1亞基表達(dá)的影響（n=3）

3.3 奧硝唑?qū)τ丑w對(duì)小鼠高架十字迷宮行為的影響

小鼠靜脈給藥10 min后進(jìn)行高架十字迷宮行為學(xué)實(shí)驗(yàn)（見(jiàn)圖3），與陰性對(duì)照組比較，地西泮組、右?jiàn)W硝唑高劑量組開臂滯留時(shí)間百分比均顯著高于對(duì)照組（P<0.01或P<0.05）。右?jiàn)W硝唑中、低劑量組及左奧硝唑各劑量組間開臂滯留時(shí)間百分比則差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與陰性對(duì)照組比較，地西泮組和右/左奧硝唑各劑量組開放臂和封閉臂總的進(jìn)入次數(shù)（OE+CE）差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（數(shù)據(jù)未顯示）。

圖3 奧硝唑?qū)τ丑w給藥10 min后對(duì)小鼠開臂滯留時(shí)間百分比的影響（n=8）

4 討 論

GABAA受體是配體門控離子通道超家族成員之一，由5個(gè)亞基組成五邊形異質(zhì)多肽寡聚體，中心部位形成門控氯離子通道。哺乳類動(dòng)物大腦中突觸型GABAA受體主要是由α、β和γ亞基組成。神經(jīng)藥理學(xué)的研究表明，GABAA受體含有GABA識(shí)別位點(diǎn)、地西泮識(shí)別位點(diǎn)和巴比妥識(shí)別位點(diǎn)等。配體能通過(guò)直接開放氯離子通道或增加氯離子通道開放頻率、時(shí)間等途徑增加胞內(nèi)氯離子濃度，使細(xì)胞超極化而產(chǎn)生抑制作用。原代培養(yǎng)小鼠皮層神經(jīng)元培養(yǎng)7天后表達(dá)功能性GABAA受體[7]，可用于評(píng)價(jià)藥物是否會(huì)引起胞內(nèi)氯離子濃度改變。N，N-二甲基二吖啶硝酸鹽（MQAE）熒光探針以溴離子為配對(duì)陰離子，最大激發(fā)波長(zhǎng)約為360 nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)約為450 nm[8]。MQAE是使用最廣泛的一種新型氯離子熒光探針。MQAE以氯離子為配對(duì)陰離子，當(dāng)氯離子濃度升高時(shí)，MQAE的熒光強(qiáng)度隨著氯離子濃度的增加而成比例地減少。

本研究結(jié)果顯示，GABA能顯著開放氯離子通道，在該測(cè)定條件下使熒光強(qiáng)度大幅度下降，右?jiàn)W硝唑也可降低熒光強(qiáng)度，且呈一定的劑量依賴性，左奧硝唑各劑量組均無(wú)明顯影響。因此，右?jiàn)W硝唑中樞抑制作用的產(chǎn)生可能與激活GABAA受體、開放氯離子通道有關(guān)。應(yīng)用western blot進(jìn)一步研究表明，右?jiàn)W硝唑和地西泮都能增加原代小鼠皮層神經(jīng)元GABAA受體α1亞基的表達(dá)，因此，右?jiàn)W硝唑可能作用于GABAA受體而抑制神經(jīng)元興奮，最后產(chǎn)生鎮(zhèn)靜、抗焦慮等中樞抑制效應(yīng)。

高架十字迷宮是抗焦慮研究中應(yīng)用最廣泛的模型之一，反映的是動(dòng)物趨近-規(guī)避沖突的結(jié)果，與焦慮程度直接相關(guān)[9]?？菇箲]藥可增加動(dòng)物對(duì)開放臂的探索，使開臂滯留時(shí)間百分比上升。GABAA受體激動(dòng)劑為臨床抗焦慮藥物的經(jīng)典靶點(diǎn)之一，由此可以推斷，若右?jiàn)W硝唑能夠激動(dòng)GABAA受體，開放氯離子通道，則應(yīng)該具有一定程度的抗焦慮作用。高架十字迷宮試驗(yàn)結(jié)果表明，地西泮和高劑量右?jiàn)W硝唑能顯著增加小鼠開臂滯留時(shí)間百分比，而左奧硝唑各劑量組均對(duì)小鼠高架十字迷宮各指標(biāo)均無(wú)明顯影響。由于試驗(yàn)設(shè)計(jì)所用各給藥劑量組均不影響小鼠開放臂和封閉臂總的進(jìn)入次數(shù)，因此，該結(jié)果可以在一定程度上說(shuō)明高劑量右?jiàn)W硝唑可以產(chǎn)生抗焦慮作用，其機(jī)制可能與GABAA受體有關(guān)。

綜上所述，右?jiàn)W硝唑能開放原代培養(yǎng)小鼠皮層神經(jīng)元氯離子通道，增加GABAA受體α1亞基的表達(dá)，并在小鼠高架十字迷宮試驗(yàn)中表現(xiàn)出抗焦慮活性；而左奧硝唑?qū)β入x子通道、α1亞基及小鼠高架十字迷宮表現(xiàn)則無(wú)明顯影響；推測(cè)奧硝唑?qū)τ丑w對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用存在差異可能與其對(duì)GABAA受體的作用存在差異有關(guān)。

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Inhibition Effects and Mechanism of Ornidazole Enantiomers on Central Nervous System in Mice*

WEI Ting-ting1,SUN Ji-hong1,HAN Lu-wei2,WANG Zhi-qiang2,JI Hui1**
1Department of Pharmacology,China Pharmaceutical University,Nanjing 210009;2Nanjing Sanhome Pharmaceutical Co Ltd,Nanjing 210038

Objective:The aim of the study was to investigate the central inhibition effect and mechanism of R-ornidazole through the γ-aminobutyric acid(GABA)ergic systems.Methods:The chloride influx was estimated in primary cultured prefrontal cortical neurons with treatments of R/S-ornidazole or GABA. After treatments of R/S-ornidazole ordiazepam,the GABAAreceptor α1subunits expression in primary cultured prefrontal cortical neurons was determined.The anxiolytic effect of R-ornidazole was measured with elevated plus maze test(EPM)in mice.Results:Compared with S-ornidazole,both R-ornidazole and GABA increased chloride influx and R-ornidazole significantly increased GABAAreceptor α1subunits expression.In addition,R-ornidazole showed anxiolytic effect in mice in the elevated plus maze test.Conclusion:The inhibition mechanism of R-ornidazole on central nervous system in mice may be through the modification of GABA ergic systems.

R/S-ornidazole;Cl-channel;GABA ergic systems

R965

A

1673-7806（2015）01-009-04

國(guó)家重大新藥創(chuàng)制科技重大專項(xiàng)資助項(xiàng)目（No．2008ZX09101-101）

魏婷婷，女，碩士生，研究方向：神經(jīng)藥理學(xué)E-mail:sunnytingtingwei@126.com

**通訊作者季暉，女，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：生化藥理與老年病藥理 E-mail:huijicpu@163.com

2014-08-03

2014-10-08