魏艷玲,黃先忠

(石河子大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆石河子 832003)

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無(wú)苞芥NAC轉(zhuǎn)錄因子基因OpNAC026的克隆與分析

魏艷玲,黃先忠*

(石河子大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆石河子 832003)

摘要:在新疆耐逆植物無(wú)苞芥幼苗cDNA文庫(kù)的隨機(jī)克隆測(cè)序結(jié)果中,發(fā)現(xiàn)1條與擬南芥NAC轉(zhuǎn)錄因子基因AtNAC026高度相似的5′端EST序列(GenBank登錄號(hào)為JZ151854),對(duì)該克隆進(jìn)行3′端測(cè)序,拼接得到一條全長(zhǎng)1 327 bp的cDNA序列,該序列包含一個(gè)906 bp的最大開(kāi)放閱讀框(ORF),推測(cè)編碼301個(gè)氨基酸。根據(jù)該ORF序列設(shè)計(jì)引物,利用RT-PCR技術(shù)對(duì)其進(jìn)行克隆,將該基因命名為OpNAC026(GenBank登錄號(hào)為KM457621)。理化性質(zhì)分析表明,OpNAC026蛋白是一個(gè)無(wú)跨膜區(qū)域的親水蛋白,在N端具有一段保守結(jié)構(gòu)域;蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示,OpNAC026蛋白包含54個(gè)α-螺旋和12個(gè)β-轉(zhuǎn)角。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明,OpNAC026基因與擬南芥AtNAC026和AtNAM進(jìn)化關(guān)系最近。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)分析顯示,OpNAC026基因在無(wú)苞芥的各組織中都有表達(dá),在葉中表達(dá)量最高;高鹽脅迫處理24 h、干旱12 h、ABA 6 h、4 ℃低溫8 h處理均可明顯誘導(dǎo)OpNAC026基因的表達(dá)。研究表明,OpNAC026基因可能參與無(wú)苞芥抗逆機(jī)制的調(diào)控。

關(guān)鍵詞:無(wú)苞芥;OpNAC026;克隆;抗逆;基因表達(dá)

NAC轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的調(diào)控多種生物學(xué)過(guò)程的轉(zhuǎn)錄因子,廣泛分布于陸生植物中。NAC家族的命名源于矮牽牛(Petuniahybrida)NAM(no apical meristem)和擬南芥(Arabidopsisthaliana)ATAF1、ATAF2以及CUC2(cup-shaped cotyledon)基因[1-2]。對(duì)多種植物的NAC基因進(jìn)化關(guān)系分析表明,NAC基因家族包含7個(gè)亞家族,其中6個(gè)亞家族為各科植物所共有,而另一個(gè)亞家族為茄科所特有,命名為TNACS(tobacco NAC genes)[3]。NAC蛋白的N端高度保守,由大約160個(gè)氨基酸殘基組成,可分為A、B、C、D和E共5個(gè)亞結(jié)構(gòu)域[4],可能負(fù)責(zé)與DNA及其他蛋白結(jié)合[5]。其中,亞結(jié)構(gòu)域B和E保守性不強(qiáng),A、C、D高度保守,C和D序列中包含核定位信號(hào),可能參與NAC轉(zhuǎn)錄因子與特定的啟動(dòng)子元件的識(shí)別過(guò)程[4]。

目前已發(fā)現(xiàn)多個(gè)NAC蛋白參與植物對(duì)逆境的響應(yīng)[6-7],并且部分NAC蛋白參與了植物生長(zhǎng)發(fā)育和環(huán)境脅迫應(yīng)答過(guò)程中激素調(diào)節(jié)相關(guān)過(guò)程[8]。擬南芥ANAC019、ANAC055和ANAC072的表達(dá)均受到干旱、高鹽以及脫落酸(ABA)的誘導(dǎo),它們能顯著提高植株的抗逆能力[9]。擬南芥中編碼NAC蛋白的AtRD26在ABA信號(hào)途徑中發(fā)揮作用[10]。此外,過(guò)量表達(dá)OsNAC6基因的水稻雖然生長(zhǎng)慢、產(chǎn)量低,但卻顯示出對(duì)干旱、高鹽以及枯萎病的較強(qiáng)抗性[11]?；虮磉_(dá)譜顯示,小麥的TaNAC2基因表達(dá)響應(yīng)干旱、鹽、寒冷和脫落酸處理[12]。分析NAC轉(zhuǎn)錄因子在逆境脅迫應(yīng)答過(guò)程中的作用機(jī)制是研究NAC基因功能非常重要的一方面,因?yàn)楹芏郚AC轉(zhuǎn)錄因子在植物對(duì)逆境脅迫應(yīng)答中扮演了非常重要的角色,但目前對(duì)其分子機(jī)制卻知之甚少,因此對(duì)NAC轉(zhuǎn)錄因子的研究很重要。

無(wú)苞芥(Olimarabidopsispumila)為新疆廣泛分布的十字花科早春短命植物,俗稱小擬南芥,與擬南芥相比,二者形態(tài)和生活史極為相似,但無(wú)苞芥更能適應(yīng)新疆特殊的環(huán)境[13-14],其基因組大小約為擬南芥的2倍[15]。近年來(lái)已從無(wú)苞芥克隆了抗逆相關(guān)基因OpNHX1[16-17]、OpVP[18]和OpZFP[19]。前期構(gòu)建了一個(gè)無(wú)苞芥經(jīng)高鹽脅迫誘導(dǎo)的均一化cDNA文庫(kù)并進(jìn)行了測(cè)序分析[20-21],在測(cè)序結(jié)果中發(fā)現(xiàn)了多個(gè)NAC轉(zhuǎn)錄因子基因表達(dá)明顯受到高鹽脅迫誘導(dǎo)。本研究從中選取一個(gè)NAC轉(zhuǎn)錄因子基因進(jìn)行克隆,從生物信息學(xué)方面對(duì)其進(jìn)行分析,并分析了該基因的表達(dá)模式,為該基因功能的后續(xù)研究做了鋪墊。

1材料和方法

1.1材料

無(wú)苞芥種子采自石河子蘑菇湖周邊的鹽堿地,參照文獻(xiàn)[16]中的方法對(duì)種子進(jìn)行滅菌和室內(nèi)培養(yǎng)。

1.2方法

1.2.1總RNA提取及cDNA合成采用RNA prep pure Plant Kit試劑盒(Tiangen)提取無(wú)苞芥幼苗葉片總RNA,將質(zhì)量完好的RNA置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。利用M-MLV Reverse Transcriptase(Promega)參照說(shuō)明書的方法合成cDNA第1鏈。

1.2.2無(wú)苞芥OpNAC026基因的克隆利用DNASTAR序列拼接軟件將無(wú)苞芥文庫(kù)單克隆5′端正向測(cè)序獲得的EST序列(GenBank登錄號(hào)為JZ151854)與3′端反向測(cè)序的結(jié)果拼接,去除載體序列后獲得一條完整的基因序列OpNAC026(GenBank登錄號(hào)為KM457621)。利用序列分析軟件DNAMAN分析該基因的完整開(kāi)放閱讀框(ORF)。根據(jù)該ORF設(shè)計(jì)引物OpNAC026-F和OpNAC026-R1(表1),以無(wú)苞芥葉片cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增,PCR體系參照ExTaq(TaKaRa)說(shuō)明書。反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性45 s,60 ℃退火45 s,72 ℃延伸40 s,35個(gè)循環(huán)后,72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并回收后,連接pMD18-T(TaKaRa)載體并轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,菌落PCR驗(yàn)證后,將鑒定正確的陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序分析。

表1　本研究所用的PCR引物序列

1.2.3OpNAC026基因生物信息學(xué)分析OpNAC026蛋白質(zhì)氨基酸組成、相對(duì)分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、疏水性等理化性質(zhì)的分析利用ExPASy網(wǎng)站ProtParam工具(http://www.expasy.ch/tools/protparam.html)進(jìn)行[22]。利用DNAMAN軟件預(yù)測(cè)基因的ORF及其編碼的氨基酸序列。利用TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)分析該蛋白的跨膜區(qū);蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)利用SOPMA軟件分析,蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)通過(guò)Swiss model(http://swissmodel.expasy.org/)軟件預(yù)測(cè)。利用NCBI的Blastp程序檢索OpNAC026的同源蛋白,氨基酸序列的多重比對(duì)采用Clustal W程序完成,用MEGA 4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)[23],其中用Neighbor-Joining方法進(jìn)行1 000次Boot-strap分析[24]。

1.2.4OpNAC026基因的組織和脅迫表達(dá)分析無(wú)苞芥幼苗分別用高鹽(200 mmol/L NaCl)、干旱(20% PEG-6000)、ABA(100 μmol/L)和低溫(4 ℃)處理,處理方法參照文獻(xiàn)[19]進(jìn)行。收集各處理幼苗樣品及無(wú)苞芥根、莖、葉、花、果莢樣品,置于-80 ℃保存?zhèn)溆?總RNA的提取及cDNA模板的合成方法同1.2.1。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)進(jìn)行基因的組織表達(dá)和脅迫表達(dá)分析?；蛱禺愐餅镺pNAC026-RT-F和OpNAC026-RT-R,內(nèi)參引物為無(wú)苞芥肌動(dòng)蛋白基因Actin2(JZ151991)的引物Actin2-F和Actin2-R(表1)。

qRT-PCR采用SYBR PremixExTaqTMⅡ(Prefect Real Time)試劑盒(TaKaRa)標(biāo)記反應(yīng)產(chǎn)物,利用AB 7500 Fast實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Life Technologies,Foster City,CA,USA)進(jìn)行擴(kuò)增。在10 μL的反應(yīng)體系中進(jìn)行PCR反應(yīng),含cDNA模板2 μL,UltraSYBR Mixture 5 μL,10 μmol/L的上下游引物各0.2 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性10 min,95 ℃變性15 s,60 ℃退火1 min,40個(gè)循環(huán),60 ℃讀取熒光值。檢測(cè)每份樣品的目的基因和Actin2內(nèi)參基因Ct值,每份樣品3次PCR重復(fù)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用2-△△Ct法進(jìn)行相對(duì)定量分析[18],以未脅迫處理材料的mRNA水平設(shè)定為標(biāo)準(zhǔn)值1。

2結(jié)果與分析

2.1無(wú)苞芥OpNAC026基因的克隆與分析

在無(wú)苞芥幼苗cDNA文庫(kù)測(cè)序結(jié)果中,發(fā)現(xiàn)1條5′端EST序列(GenBank登錄號(hào)為JZ151854)與擬南芥轉(zhuǎn)錄因子基因AtNAC026的氨基酸序列相似性為94%。將該序列與3′端反向測(cè)序的結(jié)果拼接,去除載體序列后,獲得一條全長(zhǎng)1 327 bp的cDNA序列(GenBank登錄號(hào)為KM457621),將該基因命名為OpNAC026。OpNAC026基因包含1個(gè)906 bp的最大ORF,編碼蛋白由301個(gè)氨基酸組成(圖1)。以無(wú)苞芥葉片cDNA為模板,通過(guò)RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增出了該基因的ORF序列。

2.2OpNAC026基因的生物信息學(xué)分析

OpNAC026編碼蛋白的理化性質(zhì)分析表明,該蛋白的分子式為C1499H2298N422O453S6,分子量為33 671.6 Da,等電點(diǎn)為8.81,屬于穩(wěn)定蛋白。疏水性預(yù)測(cè)結(jié)果(圖2)表明,多肽鏈第78位的精氨酸R(Arginine)具有最低的分值-2.800,第115位的賴氨酸K(Lysine)具有最高的分值1.456。由于親水性越強(qiáng)氨基酸分值越低、疏水性越強(qiáng)分值越高,在整條鏈中,親水性氨基酸多于疏水性氨基酸,所以無(wú)苞芥OpNAC026是親水性蛋白?？缒そY(jié)構(gòu)分析表明,OpNAC026蛋白無(wú)明顯的跨膜結(jié)構(gòu)域,因此OpNAC026可能不是膜蛋白。

圖1　OpNAC026基因核苷酸序列及推測(cè)氨基酸序列

二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明OpNAC026蛋白的氨基酸序列中共有α-螺旋(Alpha helix)54處,占二級(jí)結(jié)構(gòu)的17.94%;延伸鏈(Extended strand)56處,占二級(jí)結(jié)構(gòu)的18.6%;β-轉(zhuǎn)角(Beta turn)12處,占二級(jí)結(jié)構(gòu)的3.99%;無(wú)規(guī)卷曲(Random coil)179處,占二級(jí)結(jié)構(gòu)的59.47%(圖3,A)。Swiss-model同源建模分析其對(duì)應(yīng)的三級(jí)結(jié)構(gòu)(圖3,B),結(jié)果表明該蛋白與擬南芥的三級(jí)結(jié)構(gòu)相似性為85.12%。

將OpNAC026與其他9個(gè)物種的NAC蛋白氨基酸序列進(jìn)行同源比對(duì)分析,這9個(gè)NAC蛋白分別為:擬南芥AtNAC026(Arabidopsisthaliana,NP_567773.1)、草莓Fv072(Fragariavesca,XP_004291667.1)、桑樹(shù)MnNAC072(Morusnotabilis,EXB37906.1)、甜橙CsNAC072(Citrussinensis,XP_006464708.1)、葡萄VvNAC072(Vitisvinifera,XP_002284668.1)、番茄SlNAC(Solanumlycopersicum,XP_004244203.1)、黃瓜CsNAC072(Cucumissativus,XP_004147806.1)、大豆GmNAC072(Glycinemax,XP_003540085.1)和菜豆PvNAC072(Phaseolusvulgaris,AGV54694.1)。經(jīng)Clusta lX 2.0比對(duì)表明(圖4),在NAC轉(zhuǎn)錄因子N端有一段保守的氨基酸序列,約包括170個(gè)氨基酸殘基,已有報(bào)道表明這段保守的氨基酸序列可分為A、B、C、D和E共5個(gè)亞結(jié)構(gòu)域[4],可能負(fù)責(zé)與DNA及其他蛋白結(jié)合[5]。而不保守的C端結(jié)構(gòu)決定了各自特定的功能,說(shuō)明不同物種的NAC轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控生物過(guò)程中既具有保守的功能,也可能具有各自不同的功能。

圖2　OpNAC026蛋白的親水性預(yù)測(cè)

2.3OpNAC026蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)檢索OpNAC026的同源蛋白序列,利用MEGA 4.0軟件構(gòu)建了OpNAC026與其他植物的NAC家族轉(zhuǎn)錄因子的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖5)。結(jié)果表明OpNAC026與擬南芥AtNAC026、AtNAM的親緣關(guān)系最近,屬于同一進(jìn)化分支。

2.4OpNAC026基因的組織與脅迫表達(dá)分析

qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,OpNAC026基因在無(wú)苞芥的根、莖、葉、花、果莢中均表達(dá),但在葉片的表達(dá)量最高,在其它組織中表達(dá)量相對(duì)較低(圖6)。

對(duì)2～3片真葉期無(wú)苞芥幼苗進(jìn)行高鹽(200mmol/L NaCl)、干旱(20% PEG-6000)、ABA(100 μmol/L)和低溫(4 ℃)處理,qRT-PCR實(shí)驗(yàn)表明,鹽脅迫處理24 h后OpNAC026基因表達(dá)明顯上升,并且持續(xù)72 h一直高表達(dá);干旱(20% PEG-6000)脅迫2～6 h,OpNAC026基因表達(dá)呈下降趨勢(shì),12 h后表達(dá)迅速上升;100 μmol/L ABA脅迫處理至6 h,基因緩慢上調(diào)表達(dá),8 h迅速上調(diào)達(dá)到最高水平,12 h后有所下降;低溫(4 ℃)脅迫6 h以內(nèi),OpNAC026基因表達(dá)呈下降趨勢(shì),但8～12 h明顯上調(diào)表達(dá)(圖7)?？梢?jiàn)高鹽、干旱、ABA和低溫均能誘導(dǎo)OpNAC026基因的表達(dá)。

圖3　OpNAC026基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

圖4　無(wú)苞芥OpNAC026同其他物種NAC家族蛋白氨基酸序列的多重比對(duì)

3討論

NAC轉(zhuǎn)錄因子在植物的生長(zhǎng)發(fā)育、器官建成、激素調(diào)節(jié)和防御抵抗多種生物和非生物脅迫等方面發(fā)揮著重要作用。NAC轉(zhuǎn)錄因子普遍存在于植物中,并且在不同植物中NAC家族基因的數(shù)目和基因的表達(dá)是不同的,擬南芥中至少包含107個(gè)NAC基因[25],而水稻(Oryzasativa)中含有140個(gè)[26]。利用鹽溶液處理擬南芥,僅在根中就發(fā)現(xiàn)有33個(gè)NAC基因的表達(dá)受到顯著影響[27]。前期我們構(gòu)建了無(wú)苞芥經(jīng)高鹽脅迫誘導(dǎo)的均一化cDNA文庫(kù),對(duì)文庫(kù)隨機(jī)測(cè)序,在獲得的近2萬(wàn)條EST序列中發(fā)現(xiàn)了51條NAC轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)序列(待發(fā)表資料)。本研究以NAC026為研究對(duì)象,首先從新疆無(wú)苞芥中克隆了該基因的完整ORF,編碼301個(gè)氨基酸。同其他物種的NAC轉(zhuǎn)錄因子類似,OpNAC026在N端有一段保守的氨基酸序列,C端的不保守結(jié)構(gòu)說(shuō)明該轉(zhuǎn)錄因子在不同物種中的功能存在一定的差異性。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果顯示,OpNAC026蛋白與擬南芥AtNAC026和AtNAM的親緣關(guān)系最近。

圖5　OpNAC026與其他植物NAC家族轉(zhuǎn)錄

組織表達(dá)分析表明OpNAC026基因雖然在無(wú)苞芥各組織中均有表達(dá),但主要在葉片中表達(dá)。對(duì)擬南芥AtNAC026基因的脅迫表達(dá)分析表明,在干旱、高鹽和ABA脅迫30 min后基因表達(dá)量明顯升高,并且直到24 h仍保持著較高的水平[10]。我們的研究表明,OpNAC026基因的表達(dá)明顯受到干旱、高鹽和ABA的誘導(dǎo),但不像甜土植物擬南芥的AtNAC026基因誘導(dǎo)表達(dá)迅速。分析原因,可能由于無(wú)苞芥本身生長(zhǎng)在逆境環(huán)境中,適應(yīng)了其生存環(huán)境,脅迫早期,基因組中可能有其他耐逆相關(guān)基因在起作用,隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng),NAC家族基因被迅速誘導(dǎo),和其他逆境誘導(dǎo)表達(dá)相關(guān)基因協(xié)同作用,增強(qiáng)無(wú)苞芥的耐逆能力,使其在逆境下生存下來(lái)。研究結(jié)果也說(shuō)明了不同植物的NAC家族基因在耐逆性上既有保守的功能,對(duì)于不同逆境脅迫的精細(xì)調(diào)控上又起著不同的作用。

圖6　無(wú)苞芥OpNAC026基因組織表達(dá)模式

圖7　不同脅迫下OpNAC026基因的表達(dá)分析

轉(zhuǎn)錄因子可能同時(shí)調(diào)控很多其他基因的表達(dá),這樣通過(guò)操縱一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子就可調(diào)控多個(gè)功能基因發(fā)揮作用,從而達(dá)到改良植株性狀的效果。目前,我們?cè)谶M(jìn)一步分析無(wú)苞芥其他50個(gè)NAC家族基因,以期了解它們的逆境脅迫表達(dá)特征及在無(wú)苞芥響應(yīng)逆境信號(hào)生理生態(tài)適應(yīng)機(jī)制中的功能。對(duì)不同植物NAC轉(zhuǎn)錄因子功能的研究,不僅有利于進(jìn)一步理解NAC家族參與逆境脅迫的分子機(jī)制,也對(duì)將來(lái)利用該類基因提高植物的耐逆性具有重要意義。

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(編輯:宋亞珍)

Clone and Expression of NAC Transcription Factor Gene

OpNAC026 fromOlimarabidopsispumila

WEI Yanling,HUANG Xianzhong*

(Key Laboratory of Agrobiotechnology,College of Life Sciences,Shihezi University,Shihezi,Xinjiang 832003,China)

Abstract:An expressed sequence tag(GenBank accession number:JZ151854) from the 5′ end which was highly similar to NAC transcription factorAtNAC026 ofArabidopsisthalaniawas obtained,through sequencing of clones randomly selected from the previously constructed cDNA library ofOlimarabidopsispumilaleaves.This clone was sequenced from the 3′ end,and a full-length cDNA of 1 327 bp was obtained after sequence assembly.Its open reading frame (ORF) was 906 bp,and encodes 301 amino acids.The primers were designed according to the ORF and this gene was cloned fromO.pumilaby RT-PCR technique,which was designated asOpNAC026 (GenBank accession number:KM457621).Physicochemical property analysis showed that OpNAC026 is a hydrophilic protein with a conserved domain at its N-terminal region,and OpNAC026 has no transmembrane domain,indicating that it is not a transmembrane protein.The secondary structural analysis showed that OpNAC026 contains 54 α-helixes and 12 β-turns.The phylogenetic analysis revealed thatOpNAC026 showed the closest genetic kinship withA.thalianaAtNAC026 andAtNAM,indicating that they belonged to the same evolutionary branch.Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) revealed thatOpNAC026 displayed a much broader expression range atO.pumiladifferent tissues,with a maximum expression in leaves.The transcriptional level ofOpNAC026 was up-regulated as 24 h of NaCl treatment,12 h of 20 % PEG-6000 treatment,6 h of ABA treatment and 8 h of 4 ℃ treatment,respectively.Our research indicated thatOpNAC026 might control the mechanism of resistance inO.pumila.

Key words:Olimarabidopsispumila;OpNAC026;cloning;stress tolerance;gene expression

中圖分類號(hào):Q785;Q786

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

作者簡(jiǎn)介:魏艷玲(1989-),女,在讀碩士研究生,主要從事生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究。E-mail:yanlingw143@163.com*通信作者:黃先忠,教授,主要從事植物分子遺傳研究。E-mail:xianzhongh106@163.com

基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金(U1303302;31060149);石河子大學(xué)高層次人才啟動(dòng)項(xiàng)目(RCZX200902)

收稿日期:2014-09-05;修改稿收到日期:2014-12-01

文章編號(hào):1000-4025(2015)01-0037-07

doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2015.01.0037