崔清華，呂旭瀟，何　軍，侯　林，郝信東，田景振

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東濟南250355;2.山東潤華藥業(yè)有限公司，山東濟南250200)

小兒雙金清熱口服液抗RSV病毒作用機制研究

崔清華1，呂旭瀟1，何軍2，侯林1，郝信東2，田景振1

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東濟南250355;2.山東潤華藥業(yè)有限公司，山東濟南250200)

摘要:目的研究小兒雙金清熱口服液對體內(nèi)抗呼吸道合胞病毒的作用機制。方法建立小鼠呼吸道合胞病毒感染模型，檢測小兒雙金清熱口服液對呼吸道合胞病毒感染小鼠的體重，肺指數(shù)以及肺病理變化等方面的影響。結(jié)果小兒雙金清熱口服液能明顯增加呼吸道合胞病毒感染小鼠的體重，增加T細胞增殖轉(zhuǎn)化率以及自然殺傷細胞的殺傷活性(P＜0.01)。結(jié)論小兒雙金可以改善細胞免疫功能，減少病毒對機體的免疫損傷。

關(guān)鍵詞:呼吸道合胞病毒;抗病毒; T淋巴細胞增值轉(zhuǎn)化;自然殺傷細胞

小兒雙金清熱口服液為全國獨家品種，主要用于小兒外感及發(fā)熱，療效顯著，受到醫(yī)生和患兒家長的信賴。本方主要成分:金銀花、蒲公英、大青葉、板藍根、赤芍、柴胡、秦艽、荊芥、淡竹子、萊菔子、桔梗、苦杏仁、僵蠶、廣藿香、石菖蒲、郁金［1］。呼吸道合胞病毒(RSV)屬于副粘科RNA病毒，是引起嬰幼兒肺炎、支氣管炎［2］與成人哮喘急性發(fā)作的主要病因［3，4］。課題組在前期通過實驗證明了小兒雙金口服液具有抗RSV病毒的作用，擬通過本實驗明確小兒雙金抗RSV病毒的作用機制。

1　實驗材料

1.1動物昆明種小鼠，體重(13±1) g，購自山東濟寧魯抗有限公司，動物合格證號: SCXK (魯) 20130001。

1.2病毒RSV由山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物室提供。

1.3藥物與主要試劑小兒雙金清熱口服液(以下簡稱雙金，山東潤華醫(yī)藥有限公司，批號: 140112) ;雙黃連口服液(哈爾濱三精通泰制藥有限公司，批號: 14012547) ;刀豆蛋白:以完全1640培養(yǎng)液配成0.5 mg·mL－1溶液，分裝后于－20℃凍存;靶細胞:用YAc－1細胞株于實驗前24 h傳代1次，使用時用1640培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度至1×105·mL－1。

1.4主要儀器低溫高速離心機(賀立氏臺式低溫離心機) ;倒置顯微鏡(Olympus公司) ;高壓滅菌鍋(濟南德強儀器有限公司，MJ37600) ;純水機(濟南太平瑪環(huán)保有限公司)。

2　方法與結(jié)果

2.1造模及分組小鼠隨機分為6組，空白組、病毒組、雙黃連對照組0.007 7 mL·g－1，小兒雙金大劑量組0.027 mL·g－1(相當于臨床用量的2倍)，中劑量組0.013 5 mL·g－1(相當于臨床用量)，小劑量組0.006 8 mL·g－1(相當于臨床用量的1/2 倍)，每組10只。乙醚輕度麻醉后，每鼠50 μL RSV病毒液滴鼻感染，空白組以等量生理鹽水滴鼻。病毒接種完2 h后灌胃給藥，每天1次，連續(xù)給藥5 d，觀察小鼠行為變化，末次給藥后禁食不禁水，稱重，眼眶取血，無菌環(huán)境下取脾制作脾細胞懸液，肺以生理鹽水洗滌2～3次后用吸水紙吸干，稱重，計算肺指數(shù)，放入4%多聚甲醛中留作病理切片。

肺指數(shù)=小鼠肺重/體重×100%

肺指數(shù)抑制率=(病毒對照組肺指數(shù)均值－給藥組肺指數(shù)均值)/病毒對照組肺指數(shù)均值×100% 2.2 T淋巴細胞增值轉(zhuǎn)化［5］感染5天后的小鼠處死后，無菌取脾臟，滴加幾滴PBS，用玻璃注射器的內(nèi)芯研磨后過200目尼龍膜篩去連帶的脂肪組織等，1 000 rpm，離心5 min，加0.87%的氯化銨破壞紅細胞后，1 000 rpm，離心5 min，棄去液體后用1640調(diào)整細胞濃度為2×106，加入刀豆蛋白，使終濃度為含刀豆蛋白5 μg·mL－1，200 μL/孔加于96孔板中，設(shè)4復(fù)孔。5% CO2培養(yǎng)箱中孵育48 h后測MTT值。

2.3自然殺傷(NK)細胞殺傷活性測定［6］感染5天后的小鼠處死后，無菌取脾臟，滴加幾滴PBS，用玻璃注射器的內(nèi)芯研磨后過200目尼龍膜篩去連帶的脂肪組織等，1 000 rpm，離心5 min，加0.87%的氯化銨破壞紅細胞后，1 000 rpm，離心5 min，棄去液體后用1640調(diào)整細胞濃度為2×106，YAc－1細胞株于試驗前24 h傳代1次，使用時用1640培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度至1×105·mL－1，此時效應(yīng)細胞與靶細胞比為20∶1，5% CO2培養(yǎng)箱中孵，24 h后測MTT。結(jié)果用統(tǒng)計軟件SPSS 17.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。

NK細胞活性(%)=［l－(測試孔A值－效應(yīng)細胞對照孔A值)/靶細胞對照孔A值］×100%

3　實驗結(jié)果

3.1各組實驗小鼠行為的觀察正常對照組小鼠精神良好，行動敏捷，皮毛順滑，進食飲水量正常，體重逐日增加。其余各組小鼠，感染后表現(xiàn)為體重減輕，厭食、行動遲緩、毛無光澤、蜷縮，雙黃連組與小兒雙金給藥組中部分小鼠給藥后能逐漸恢復(fù)正常，部分不能。

圖1　96孔板點板示意圖

3.2肺指數(shù)和肺指數(shù)抑制率感染病毒后，小鼠肺重增加，肺指數(shù)相應(yīng)增加，因而肺指數(shù)可作為評價藥物是否具有抗病毒作用的指標。各劑量對RSV所致小鼠肺指數(shù)的影響結(jié)果見表1。

表1　小兒雙金對RSV感染小鼠肺指數(shù)的影響

結(jié)果顯示，正常組動物肺指數(shù)明顯低于病毒對照組，說明成功建立了呼吸道感染的模型。而用藥各組的肺指數(shù)低于病毒對照組，說明藥物組對已經(jīng)感染呼吸道病毒的動物有一定的治療作用。由上表可知，病毒對照組除了與小兒雙金小劑量組無明顯差異，與其余各組均有顯著性差異(P＜0.01)，雙黃連組與小兒雙金大劑量組、中劑量組無顯著性差異(P＞0.5)，說明小兒雙金的大劑量組與中劑量組與雙黃連比較，具有相同的抗呼吸道合胞病毒的作用。

3.3小兒雙金對小鼠肺組織病理變化的影響結(jié)果見圖2，顯微鏡下觀察小鼠肺組織HE染色切片，正常組小鼠肺組織肺泡壁薄，管腔內(nèi)無分泌物，無充血及炎性細胞浸潤。病毒對照組肺泡壁增厚，充血嚴重并伴有大量的漿液性滲出，肺實變非常明顯，炎性細胞浸潤區(qū)呈片狀分布。給藥各組炎性細胞浸潤明顯減少，漿液性滲出及肺實變情況減輕，一定程度上減少了肺組織的病理損傷。

3.4T淋巴細胞增值轉(zhuǎn)化結(jié)果見表2。由表2可以看出，病毒組與其余各組比較均有顯著性差異，空白組與其余各組比較均有顯著性差異，小兒雙金大劑量與中劑量組與陽性藥物雙黃連組比較有顯著差異，只有小劑量與雙黃連組比較有差異，說明小兒雙金在治療呼吸道病毒感染的機體時用藥量與T細胞增殖量沒有劑量依賴關(guān)系，但在一定程度上各劑量組都可以增加T淋巴細胞的增值。病毒感染機體后，細胞免疫功能有所降低，病毒對照組T淋巴細胞增殖能力下降，與正常對照組比顯著降低，各藥物治療組T淋巴細胞增殖能力得到了提高，差異顯著。小兒雙金可以改善細胞免疫功能，減少病毒對機體的免疫損傷。

圖2　各組小鼠肺組織病理圖

表2　T淋巴細胞增值轉(zhuǎn)化

3.5 NK細胞殺傷活性測定結(jié)果結(jié)果見表3。由表3可以看出病毒對照組與其余各組的NK殺傷活性有顯著性差異，說明病毒感染組的NK活性降低，各給藥組的NK殺傷活性得到提高，而且除小兒雙金小劑量外，小兒雙金大劑量組、中劑量組與雙黃連組比較沒有顯著差異(P＜0.01)，說明小兒雙金在提高NK活性方面與雙黃連功效相同。

表3　NK細胞殺傷活性測定

4　討論

小兒雙金能明顯地延遲病毒感染后的體重下降，促進體重恢復(fù)，減輕其他臨床癥狀，降低死亡率。刀豆蛋白可誘導(dǎo)T淋巴細胞發(fā)生增殖，淋巴細胞增殖的高低可以反映機體細胞免疫及體液免疫的水平。淋巴細胞增殖試驗是檢測機體免疫功能最常用的指標之一［7，8］。病毒對照組NK細胞活性明顯下降，與正常對照組比顯著降低，小兒雙金各藥物治療組與病毒對照組比較，NK細胞活性得到了提高，差異顯著。研究結(jié)果提示了小兒雙金功效與其增強細胞免疫功能，促進T淋巴細胞增值，提高NK細胞活性，從而增強機體免疫功能發(fā)揮抗病毒作用。

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Study on mechanism of antiviral effects on RSV of Xiaoer Shuangjin Qingre Oral Liquid

CUI Qing-hua1，LV Xu-xiao1，HE Jun2，HOU Lin1，HAO Xin-dong2，TIAN Jing-zhen1
(1.College of Pharmacy，Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250335，China; 2.Shandong Runhua Pharmaceutical Co.，Ltd.，Jinan 250200，China)

Abstract:Objective To study the mechanism of Xiaoer Shuangjin Qingre Oral Liquid against respiratory syncytial virus (RSV) .Methods To establish the mouse model of RSV virus infection，detect Xiaoer Shuangjin Qingre Oral Liquid on body weight in mice infected with the RSV virus，and the effect of lung index and lung pathological changes etc.Results Xiaoer Shuangjin Qingre Oral Liquid could significantly increase the RSV virus infection weight in mice body and increase value added conversion rate and T cell killing activity of NK cell (P＜0.01) .ConclusionXiaoer Shuangjin Qingre Oral Liquid can improve the cellular immune function and reduce the damage of the body's immune virus.

Key words:RSV; Antiviral; Tlymphocyte proliferation and transformation; NK cell

通訊作者:田景振，男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向:中藥新藥、新劑型研究，Tel: 0531－89628597，E－mail: tianjingzhen@163.com

作者簡介:崔清華，女，研究方向:中藥制劑分析，E－mail: user753951@163.com

基金項目:山東省高等學(xué)校中醫(yī)藥抗病毒協(xié)同創(chuàng)新中心項目(No.xtcx2014c－02)

中圖分類號:R285

文獻標識碼:A

文章編號:2095－5375(2015) 10－0568－003