王長(zhǎng)丹，臧恒昌，左艷紅

(1.山東大學(xué)藥學(xué)院，山東濟(jì)南250012;2.合肥立方制藥股份有限公司，安徽合肥230088)

二甲雙胍格列吡嗪片中鹽酸二甲雙胍含量測(cè)定方法改進(jìn)

王長(zhǎng)丹1，2，臧恒昌1，左艷紅2

(1.山東大學(xué)藥學(xué)院，山東濟(jì)南250012;2.合肥立方制藥股份有限公司，安徽合肥230088)

摘要:目的建立高效液相法測(cè)定二甲雙胍格列吡嗪片中鹽酸二甲雙胍含量測(cè)定方法。方法采用C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)色譜柱;以0.05%庚烷磺酸鈉溶液(用10%磷酸溶液調(diào)節(jié)pH值至4.0)－乙腈(84∶16)為流動(dòng)相，流速:1.0 mL·min－1，檢測(cè)波長(zhǎng):233 nm，柱溫:30℃。結(jié)果鹽酸二甲雙胍在10.02～30.06 μg·mL－1濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系(r=0.999 9)，回收率為101.0%，RSD=0.66% (n=9)。結(jié)論所建立的方法較原國(guó)家注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)專屬性更強(qiáng)、更準(zhǔn)確。

關(guān)鍵詞:高效液相色譜法;二甲雙胍格列吡嗪片;鹽酸二甲雙胍

二甲雙胍格列吡嗪片是由鹽酸二甲雙胍與格列吡嗪及適宜的輔料組成的復(fù)方制劑，鹽酸二甲雙胍具有降低肝糖原異生作用，可減少人體對(duì)葡萄糖吸收。格列吡嗪有促進(jìn)人體分泌胰島素作用，兩者聯(lián)合使用可以通過作用機(jī)制上的互補(bǔ)來提高療效，糾正2型糖尿病患者的多種代謝紊亂狀況，增強(qiáng)對(duì)血糖的控制［1，2］。原國(guó)家注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)中鹽酸二甲雙胍含量測(cè)定方法的回收率比格列吡嗪含量測(cè)定方法的回收率低，對(duì)于生產(chǎn)中各工序的含量折算不能起到準(zhǔn)確的指導(dǎo)作用，本文按照相關(guān)文獻(xiàn)［3，4］重新建立了二甲雙胍格列吡嗪片中鹽酸二甲雙胍的含量測(cè)定，結(jié)果表明，本方法較原國(guó)家注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)的方法專屬性更強(qiáng)、回收率更接近于理論投料量。

1　儀器和試劑

1.1儀器島津LC－20AT高效液相色譜儀;島津SPD－20A檢測(cè)器; Shim－pack VP－ODS(4.6 mm ×150 mm，5 μm)色譜柱; LC solution工作站;梅特勒－托利多XS205電子天平。

1.2試劑乙腈為色譜純(美國(guó)Sigma公司) ;水為高純水(合肥立方制藥股份有限公司自制) ;庚烷磺酸鈉和磷酸均為分析純;鹽酸二甲雙胍對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào): 100664－2006020) ;二甲雙胍格列吡嗪片(合肥立方制藥股份有限公司，批號(hào): 101101、101201、110201)。

2　方法與結(jié)果［5～7］

2.1檢測(cè)方法色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn):用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;以0.05%庚烷磺酸鈉溶液(用10%磷酸溶液調(diào)節(jié)pH值至4.0)－乙腈(84∶16)為流動(dòng)相;檢測(cè)波長(zhǎng)為233 nm，柱溫為30℃。理論板數(shù)按鹽酸二甲雙胍峰計(jì)不低于2 000。

測(cè)定法:取本品20片，精密稱定，研細(xì)，精密稱取適量(約相當(dāng)于鹽酸二甲雙胍25 mg)，置100 mL量瓶中，加緩沖液(0.1 mol·L－1鹽酸溶液750 mL，加0.2 mol·L－1磷酸鈉溶液250 mL，混勻，必要時(shí)用2 mol·L－1鹽酸溶液或2 mol·L－1氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至6.8) 50 mL，振搖10 min使鹽酸二甲雙胍溶解，用上述緩沖液稀釋至刻度，搖勻，濾過，棄去初濾液20 mL，精密量取續(xù)濾液適量，用流動(dòng)相定量稀釋制成每1 mL中約含鹽酸二甲雙胍20 μg的溶液，精密量取20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖;另精密稱取鹽酸二甲雙胍對(duì)照品，加流動(dòng)相溶解并定量稀釋制成每1 mL中約含20 μg的溶液，同法測(cè)定。按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，即得。

2.2專屬性試驗(yàn)

2.2.1溶液的制備

2.2.1.1溶劑精密量取緩沖液2 mL置25 mL量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，即得。

2.2.1.2對(duì)照品溶液精密稱取鹽酸二甲雙胍對(duì)照品25.23 mg，置100 mL量瓶中，加緩沖液50 mL，振搖10 min，用緩沖液稀釋至刻度，搖勻，濾過，棄去初濾液20 mL，精密量取續(xù)濾液2 mL置25 mL量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，即得。

2.2.1.3陰性對(duì)照溶液精密稱取樣品(取按處方比例配制的空白輔料6.55 g，加格列吡嗪原料

0.125 g，混勻) 38.31 mg，置100 mL量瓶中，加緩沖液50 mL，振搖10 min，用上述緩沖液稀釋至刻度，搖勻，濾過，棄去初濾液20 mL，精密量取續(xù)濾液2 mL 置25 mL量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，即得。

2.2.1.4供試品溶液精密稱取樣品38.35 mg，置100 mL量瓶中，加緩沖液50 mL，振搖10 min使鹽酸二甲雙胍溶解，用上述緩沖液稀釋至刻度，搖勻，濾過，棄去初濾液20 mL，精密量取續(xù)濾液2 mL 置25 mL量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，即得。

2.2.2檢驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，1.6 min左右有溶劑峰，在5.1 min左右為鹽酸二甲雙胍峰，在陰性對(duì)照中格列吡嗪未檢出，表明本品中溶劑、空白輔料及格列吡嗪對(duì)鹽酸二甲雙胍的檢測(cè)無干擾，專屬性較強(qiáng)。

圖1　專屬性試驗(yàn)圖譜

2.3線性關(guān)系考察精密稱取鹽酸二甲雙胍對(duì)照品25 mg，置100 mL量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得鹽酸二甲雙胍對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取儲(chǔ)備液適量，用流動(dòng)相稀釋得到如下系列濃度對(duì)照品溶液，10.02、15.03、20.04、25.05、30.06 μg·mL－1。精密量取上述各溶液20 μL注入液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定，以各組峰面積Y對(duì)相應(yīng)濃度X進(jìn)行線性回歸，線性回歸方程為: Y=94 392X－8 125.2，r=0.999 9，線性范圍為10.02～30.06 μg·mL－1。

2.4重復(fù)性試驗(yàn)精密稱取樣品(約相當(dāng)于鹽酸二甲雙胍25 mg)，按照“2.1”項(xiàng)下配制供試品溶液，精密量取20 μL注入液相色譜儀重復(fù)測(cè)定6次峰面積，測(cè)定結(jié)果RSD為0.074%，表明本品含量測(cè)定方法的重復(fù)性較好。

2.5中間精密度由6名檢測(cè)人員分別按照“2.1”項(xiàng)下的檢測(cè)方法測(cè)定同一樣品的含量，測(cè)定結(jié)果RSD為0.12%，表明本品含量測(cè)定方法的中間精密度較好。

2.6準(zhǔn)確度

2.6.1加樣回收率試驗(yàn)分別精密稱取樣品(約相當(dāng)于鹽酸二甲雙胍25 mg) 9份，分別置100 mL量瓶中，稱取鹽酸二甲雙胍20、25、30 mg各3份，精密稱定，分別置以上9個(gè)容量瓶中，按照“2.1”項(xiàng)下供試品溶液的配制方法，分別配制為低、中、高濃度的供試品溶液。按照“2.1”項(xiàng)下的檢測(cè)方法測(cè)定該9份樣品的含量，按外標(biāo)法計(jì)算回收率，平均回收率為100.7%，RSD為0.63%，表明本品含量測(cè)定方法的加樣回收率理想，結(jié)果見表1。結(jié)果表明，本品含量測(cè)定方法的加樣回收率較好。

2.6.2回收率試驗(yàn)分別精密稱取樣品(取按處方比例配制的空白輔料6.55 g，加格列吡嗪原料0.125 g，混勻)約13.1 mg 9份，分別置100 mL量瓶中，稱取鹽酸二甲雙胍20、25、30 mg各3份，精密稱定，分別置以上9個(gè)容量瓶中，按照“2.1”項(xiàng)下供試品溶液的配制方法，分別配制為低、中、高濃度的供試品溶液。按照“2.1”項(xiàng)下的檢測(cè)方法測(cè)定該9份樣品的含量，按外標(biāo)法計(jì)算回收率，平均回收率為101.0%，RSD為0.66%，表明本品含量測(cè)定方法的回收率理想，結(jié)果見表2。

表1　含量測(cè)定加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

表2　含量測(cè)定回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.7耐用性

2.7.1穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.7.1.1對(duì)照溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)精密稱取鹽酸二甲雙胍對(duì)照品12.5 mg，置50 mL量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取該溶液2 mL置25 mL量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，作為對(duì)照品溶液，即得。分別于0、2、4、6、8、10、12 h時(shí)，進(jìn)樣檢測(cè)，峰面積RSD為0.045%，表明該含量測(cè)定方法中對(duì)照品溶液在12 h穩(wěn)定性好。

2.7.1.2供試品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)按照“2.1項(xiàng)”下方法配制供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、10、12 h時(shí)，進(jìn)樣檢測(cè)，峰面積RSD為0.022%，表明該含量測(cè)定方法中供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性好。

2.7.2液相色譜條件按照“2.1”項(xiàng)下檢測(cè)方法，變動(dòng)單個(gè)色譜條件測(cè)定，結(jié)果見表3。柱溫為(30± 3)℃時(shí)含量測(cè)定結(jié)果的RSD為0.063%;流速為(1.0±0.2) mL·min－1時(shí)含量測(cè)定結(jié)果的RSD為 0.36%;流動(dòng)相中乙腈的比例為16%±5%時(shí)含量測(cè)定結(jié)果的RSD為0.57%;流動(dòng)相中庚烷磺酸鈉的比例為0.05%±0.002 5%時(shí)含量測(cè)定結(jié)果的RSD為0.11%; pH值為4.0±0.2時(shí)含量測(cè)定結(jié)果的RSD 為0.72%，以上結(jié)果表明該檢測(cè)方法液相色譜條件的耐用性較好。

表3　變動(dòng)單個(gè)色譜條件后含量測(cè)定結(jié)果

2.8范圍根據(jù)線性、準(zhǔn)確度、精密度等的結(jié)果，確定范圍為測(cè)試濃度的80%～120%。

2.9藥品含量測(cè)定結(jié)果按照“2.1”項(xiàng)下的檢測(cè)方法檢查3批成品中鹽酸二甲雙胍的含量，結(jié)果見表4。

表4　成品中鹽酸二甲雙胍含量測(cè)定結(jié)果

3　討論

3.1關(guān)于波長(zhǎng)的選擇通過紫外掃描，鹽酸二甲雙胍的最大吸收是233 nm。原方法的檢測(cè)波長(zhǎng)是222 nm，本方法選擇的檢測(cè)波長(zhǎng)是233 nm，格列吡嗪在該波長(zhǎng)處幾乎無吸收，排除了原有方法中格列吡嗪對(duì)鹽酸二甲雙胍的影響，專屬性更強(qiáng)。

3.2關(guān)于流動(dòng)相的選擇原方法鹽酸二甲雙胍的保留時(shí)間在1.7 min左右，出峰較早，易受溶劑干擾。本次參考相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行比對(duì)［3，8～10］，最終參照《中國(guó)藥典》2010年版中鹽酸二甲雙胍腸溶膠囊檢測(cè)的色譜條件選擇該流動(dòng)相，按照本方法檢測(cè)鹽酸二甲雙胍的保留時(shí)間在5.5 min左右，排除了溶劑等的干擾。

依照本方法進(jìn)行產(chǎn)品檢驗(yàn)時(shí)，鹽酸二甲雙胍的回收率接近于100%，在中間產(chǎn)品控制與成品檢驗(yàn)中的理論投料量的數(shù)據(jù)有高度的吻合性，更準(zhǔn)確地指導(dǎo)各工序間的含量折算，為該品種的生產(chǎn)有更高度的指導(dǎo)意義。

參考文獻(xiàn):

［1］林偉豪，葉云，朱新華.二甲雙胍格列吡嗪片在健康人體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)研究［J］.中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)藥雜志，2013，15 (7) : 27－30.

［2］李浩冬，劉敏如，王沈陽，等.二甲雙胍格列吡嗪片的療效與安全性評(píng)價(jià)［J］.醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2011，30(7) : 898 －900.

［3］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典2010年版(二部)［S］.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:附錄ⅪⅩ，625－626.

［4］楊紅芬，張昆.HPLC法測(cè)定二甲雙胍格列本脲片(Ⅰ)中鹽酸二甲雙胍的含量［J］.藥學(xué)研究，32(4) : 211 －212.

［5］陳悅.HPLC法測(cè)定他克莫司的含量及有關(guān)物質(zhì)［J］.藥物分析雜志，2008，28(2) : 309－313.

［6］汪洋，吳二明，王剛，等.HPLC法測(cè)定注射用亞錫噴替酸中噴替酸的含量［J］.中國(guó)藥品標(biāo)準(zhǔn)，2014，15(4) : 286－288.

［7］林曉宏，唐瑋，尹青，等.HPLC法測(cè)定酒石酸長(zhǎng)春瑞濱脂質(zhì)體注射液的含量［J］.藥物分析雜志，2012，32 (10) : 1882－1885.

［8］吳繼禹，胡盧豐，王志強(qiáng).HPLC法和UV法測(cè)定鹽酸二甲雙胍片含量的比較研究［J］.海峽藥學(xué)，2010，22 (10) : 47－50.

［9］楊青.高效液相色譜法測(cè)定鹽酸二甲雙胍片的含量［J］.中國(guó)藥業(yè)，2008，17(19) : 35.

［10］孫勤，潘潔，田榮琳，等.鹽酸二甲雙胍片含量測(cè)定方法的探討［J］.西北藥學(xué)雜志，2007，22(5) : 237－239.

E－mail: zanghcw@126.com

Improvement of assay method of metformin hydrochloride in Metformin and Glipizide Tablets

WANG Chang-dan1，2，ZANG Heng-chang1，ZUO Yan-hong2
(1.School of Pharmaceutical Sciences，Shandong University，Jinan 250012，China; 2.Hefei Lifeon Pharmaceutical Co.，Ltd.，Hefei 230088，China)

Abstract:Objective To establish an HPLC method for the determination of metformin hydrochloride in Metformin and Glipizide Tablets.Methods The separation was performed on C18column (4.6 mm×150 mm，5 μm)，and the mobile phase was composed of 0.05% sodium heptane－1－sulphonate solution (with 10% phosphoric acid solution to adjust pH value to 4.0)－acetonitrile(84∶16) with the flow rate of 1.0 mL·min－1.The detection wavelength was 233 nm.The column temperature was 30℃.Results The linear range of metformin hydrochloride was 10.02～30.06 μg·mL－1(r=0.999 9) .The average recovery rate was 101.0% with RSD of 0.66%(n=9).ConclusionThe established method was better and more accurate than the original national registered standard specificity.

Key words:HPLC; Metformin and Glipizide Tablets; Metformin hydrochloride

通訊作者:臧恒昌，男，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向:多糖類藥物研究、藥品生產(chǎn)工藝優(yōu)化及在線過程分析與過程控制，Tel: 0531－88380268，

作者簡(jiǎn)介:王長(zhǎng)丹，女，研究方向:藥品檢驗(yàn)、質(zhì)量分析，E－mail: 408601682@ qq.com

中圖分類號(hào):R927.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

文章編號(hào):2095－5375(2015) 10－0574－004