曾慶蘭，崔向珍

(1.山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院婦產(chǎn)科，山東濟(jì)南250021;2.山東商業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品藥品學(xué)院，山東濟(jì)南250103)

六味地黃丸中馬錢苷大鼠藥代動力學(xué)研究

曾慶蘭1，崔向珍2

(1.山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院婦產(chǎn)科，山東濟(jì)南250021;2.山東商業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品藥品學(xué)院，山東濟(jì)南250103)

摘要:目的建立液質(zhì)聯(lián)用法測定大鼠血漿中馬錢苷濃度的方法，研究健康大鼠灌胃六味地黃丸后馬錢苷的藥代動力學(xué)特征。方法6只健康雄性Wistar大鼠，分別按10 g·kg－1灌胃給予六味地黃丸混懸液，按設(shè)定時間點(diǎn)采集血液樣本，采用已建立液質(zhì)聯(lián)用法測定血漿中馬錢苷濃度。采用DAS 2.0藥代動力學(xué)軟件計算藥代動力學(xué)參數(shù)。結(jié)果馬錢苷主要藥代動力學(xué)參數(shù)分別為t1/2(4.398±1.633) h，Tmax(2.083±1.021) h，Cmax(369.314± 53.452) ng·mL－1，AUC0～24(2 275.174±553.825) ng·mL－1·h，AUC0～∞(2 343.478±601.313) ng·mL－1·h。結(jié)論本研究建立的測定大鼠血漿中馬錢苷濃度的液質(zhì)聯(lián)用法靈敏度高，重現(xiàn)性好，適于大鼠體內(nèi)馬錢苷血濃度測定及藥代動力學(xué)研究。大鼠灌胃給予六味地黃丸后，馬錢苷藥時曲線呈雙峰。

關(guān)鍵詞:六味地黃丸;馬錢苷;藥代動力學(xué);液質(zhì)聯(lián)用

六味地黃丸由熟地黃、山藥、山茱萸、牡丹皮、茯苓、澤瀉6味中藥組成，是滋陰補(bǔ)腎的傳統(tǒng)中藥［1］。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，六味地黃丸具有較好的改善心血管系統(tǒng)、抗衰老、治療腎陰虛及保護(hù)免疫系統(tǒng)等藥理活性。六味地黃丸臨床應(yīng)用十分廣泛，可用于內(nèi)科、婦科、兒科及腫瘤等多個科別［2］。

已報道文獻(xiàn)對六味地黃丸藥理及藥效研究較多。由于組方化學(xué)成分復(fù)雜，包括苷類、酚類、酸類及鞣質(zhì)等，所以關(guān)于體內(nèi)代謝過程的研究較少。研究六味地黃丸效應(yīng)成分在體內(nèi)的藥代動力學(xué)特征，對其配伍機(jī)制研究及臨床應(yīng)用具有重要意義［3］。藥典中以丹皮酚和馬錢苷的含量作為質(zhì)量控制的指標(biāo)，同時結(jié)合文獻(xiàn)研究結(jié)果［4］，本研究主要以馬錢苷(結(jié)構(gòu)式見圖1)為檢測指標(biāo)進(jìn)行六味地黃丸大鼠體內(nèi)藥代動力學(xué)研究。

1　材料及方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物及飼養(yǎng)條件健康Wistar大鼠6只，雄性，體重為(300±20) g，購自山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，動物合格證號: SCXK(魯) 20090001，在正常條件下飼養(yǎng)1周。

圖1　馬錢苷結(jié)構(gòu)式

1.2藥品與試劑六味地黃丸(北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠生產(chǎn)，批號: 7073615) ;馬錢苷對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號: 111640－200503) ;巖白菜素(內(nèi)標(biāo)，中國藥品生物制品檢定所，批號: 111532－200202)。

甲醇(色譜純，美國JT.Baker公司，批號: H02E73) ;乙酸乙酯(色譜純，美國Burdick＆Jackson公司，批號: HCQG2H) ;甲酸(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號: T20060124)。

1.3主要儀器Agilent 1200－6410液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國安捷倫科學(xué)技術(shù)公司) ; XW－80A型旋渦混合器(上海精科實(shí)業(yè)有限公司) ;梅特勒－托利多AX－205 DR電子天平(瑞士梅特勒公司)。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1動物給藥與樣本采集給藥:大鼠于實(shí)驗(yàn)前12 h禁食不禁水，六味地黃丸粉末用0.4%羧甲基纖維素鈉制成混懸液，按10 g·kg－1(馬錢苷為14.4 mg·kg－1)劑量進(jìn)行灌胃給藥。

樣品采集:灌胃給藥前(0)和給藥后0.083、0.167、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24 h頸靜脈竇取靜脈血約0.5 mL于含肝素的試管中，搖勻，充分抗凝，5 000 rpm離心5 min，取血漿，－20℃保存，備測。

1.4.2生物樣本處理取血漿樣品100 μL，加入10 μL內(nèi)標(biāo)溶液(100 ng·mL－1)，渦旋混勻，加入3.5 mL乙酸乙酯，渦旋萃取2 min。以5 000 rpm離心5 min，吸取上清液，40℃水浴氮?dú)獯蹈桑?00 μL流動相復(fù)溶，10 μL進(jìn)樣分析。

1.4.3樣本分析方法色譜條件:色譜柱為Wondasil C18(4.6 mm×150 mm，5 μm) ;流動相:甲醇: 水(含0.02%甲酸) (28∶72，V/V)，在線脫氣;流速0.7 mL·min－1;進(jìn)樣量10 μL;柱溫30℃。

質(zhì)譜條件:負(fù)離子模式，ESI離子源，干燥氣(N2)流速9 L·min－1，干燥氣溫度為350℃，毛細(xì)管電壓4 000 V，霧化壓力50 psi，選擇性離子監(jiān)測(SIM)方式，監(jiān)測離子對m/z 435.2(馬錢苷)和m/z 327.1(內(nèi)標(biāo))，碎片電壓均為110 V。

1.5數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計血漿樣本經(jīng)處理后，采用已建立的HPLC－MS法檢測大鼠血漿中馬錢苷濃度，用DAS 2.0藥代動力學(xué)軟件計算大鼠灌胃給予六味地黃丸后馬錢苷藥代動力學(xué)參數(shù)。

2　結(jié)果

2.1方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果專屬性:分別取大鼠空白血漿0.1 mL、含100 ng·mL－1馬錢苷空白血漿溶液以及2號大鼠灌胃六味地黃丸混懸液10 g·kg－1后45 min血漿樣品，按“1.4.2”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣分析，考察分析方法的專一性，結(jié)果見圖2。

圖2　色譜圖A.空白血漿; B.標(biāo)準(zhǔn)品加空白血漿; C.大鼠單次給藥后45 min樣本

結(jié)果表明，該分析條件下空白血漿中無干擾馬錢苷和內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)，可用于檢測大鼠血漿樣本中馬錢苷濃度。

標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量下限:分別精密稱取馬錢苷10.02 mg及內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品10.06 mg，用甲醇溶解配制1.0 mg·mL－1馬錢苷母液和0.1 mg·mL－1內(nèi)標(biāo)溶液。馬錢苷母液用甲醇稀釋得到濃度分別為10、1.0和0.1 μg·mL－1的儲備液。取儲備液適量置試管中，氮?dú)獯蹈珊蠹尤?00 μL空白血漿，分別配成濃度為5、10、50、100、250、500、750和1 000 ng·mL－1的馬錢苷標(biāo)準(zhǔn)血漿樣本，樣本按“1.4.2”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣分析(平行5樣本)，線性回歸方程為Y=0.017 1X+0.002 6，R2=0.995 7。馬錢苷在5～1 000 ng·mL－1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，定量下限5ng·mL－1(S/N＞10)，RSD為11.8%，可以滿足大鼠血漿中馬錢苷測定要求。

絕對回收率:配制低、中、高(10、100和750 ng·mL－1)濃度的馬錢苷質(zhì)控血漿樣本，按“1.4.2”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)行分析(平行5樣本)，得到提取后馬錢苷色譜峰面積A;用溶劑代替空白血漿配制低、中、高濃度樣本，同法操作，得到馬錢苷標(biāo)準(zhǔn)譜峰面積A0;以A/A0×100計算絕對回收率，結(jié)果低、中、高3個濃度絕對回收率均大于70% (RSD＜ 8%)，內(nèi)標(biāo)絕對回收率大于65% (RSD)可以滿足血漿中馬錢苷定量檢測要求。

批內(nèi)和批間精密度:配制低、中、高(10、100和750 ng·mL－1)濃度的馬錢苷質(zhì)控血漿樣本，提取后進(jìn)行分析(平行5樣本)，連續(xù)3 d，每天測定1個分析批，計算批內(nèi)和批間的準(zhǔn)確度均在95%～110%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于6% (見表1)，均符合生物樣本中藥物檢測要求。

表1　準(zhǔn)確度與精密度(x±s)

穩(wěn)定性考察:配制低、中、高(10、100和750 ng·mL－1)濃度馬錢苷質(zhì)控血漿樣本，－20℃條件下進(jìn)行凍融1次、凍融2次、－20℃存放1 d和7 d的穩(wěn)定性以及提取后放置10 h穩(wěn)定性考察，提取后進(jìn)行分析(平行5樣本)。測定結(jié)果表明，馬錢苷血漿樣品在以上條件下放置后準(zhǔn)確度均在95%～102%之間(見表2)，樣本穩(wěn)定性較好。

表2　馬錢苷血漿中穩(wěn)定性考察(n=5)

2.2大鼠藥代動力學(xué)研究結(jié)果6只健康大鼠灌胃六味地黃丸后，血漿樣本采用上述建立的分析方法測定。血漿中馬錢苷濃度均值－時間曲線見圖3。

圖3　大鼠灌胃后馬錢苷血漿濃度均值－時間曲線(n=6)

根據(jù)大鼠灌胃給予六味地黃丸混懸液后馬錢苷血漿濃度－時間數(shù)據(jù)，采用DAS 2.0藥代動力學(xué)軟件計算馬錢苷藥動學(xué)參數(shù)，結(jié)果見表3，其中Cmax和Tmax為實(shí)測值。

3　討論

文獻(xiàn)報道馬錢苷測定方法多為高效液相色譜法，

表3　大鼠灌胃六味地黃丸(10 g·kg－1)后馬錢苷藥動學(xué)參數(shù)(n=6)

其最低定量限較高［5，6］，無法滿足較低濃度檢測。為保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，本實(shí)驗(yàn)建立液質(zhì)聯(lián)用(HPLC－MS)方法測定大鼠血漿中馬錢苷濃度，方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果表明靈敏度高，重現(xiàn)性好。血漿中馬錢苷在5～1 000 ng·mL－1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好;最低定量限5 ng·mL－1;絕對回收率均大于75%;批內(nèi)及批間精密度均小于15%;馬錢苷血漿樣本在－20℃冷凍及反復(fù)凍融條件下穩(wěn)定，可用于大鼠體內(nèi)馬錢苷血漿濃度的測定及其藥代動力學(xué)研究。

文獻(xiàn)表明，單劑量給予馬錢素單體后，t1/2(α) 為3.2 min; t1/2(β)為25.1 min［7］。六味地黃湯中馬錢苷小鼠體內(nèi)藥代動力學(xué)參數(shù)為Tmax為42.4 min，t1/2(α)為17.4 min，t1/2(β)為35.75 min，馬錢苷在小鼠體內(nèi)為單室模型一級吸收，而單體馬錢苷為二室模型一級吸收，組方中馬錢苷消除變慢，可能是組方配伍成分對馬錢苷藥代動力學(xué)產(chǎn)生影響［8］。

本實(shí)驗(yàn)中大鼠灌胃給予六味地黃丸后，馬錢苷藥時曲線出現(xiàn)雙峰現(xiàn)象。肝腸循環(huán)是藥物呈雙峰的主要原因，但大鼠無膽囊，肝腸循環(huán)可能不是馬錢苷雙峰的原因。由于六味地黃丸組方復(fù)雜，而中藥組方配伍彼此影響各成分藥動學(xué)參數(shù)的

研究已有報道［9，10］。因此，可能是六味地黃丸中其他成分通過影響體內(nèi)藥物代謝酶與馬錢苷產(chǎn)生相互作用［11］，從而影響馬錢苷在體內(nèi)的代謝過程。

參考文獻(xiàn):

［1］李保院，姜宏，邊瑞民，等.六味地黃丸的臨床應(yīng)用進(jìn)展［J］.藥學(xué)研究，2014，33(3) : 170－171.

［2］趙廣文.六味地黃丸現(xiàn)代研究的文獻(xiàn)分析［J］.現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2006，15(24) : 3410－3411.

［3］趙春麗，劉建芳，劉會臣.中藥藥物動力學(xué)研究進(jìn)展［J］.解放軍藥學(xué)學(xué)報，2003，19(2) : 125－128.

［4］文紅梅，過科家，杏文龍，等.六味地黃方在大鼠及家兔體內(nèi)的吸收入血成分的研究［J］.南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2007，23(2) : 96－100.

［5］唐益華，肖凱華.RP－HPLC法測定濃縮六味地黃丸中馬錢苷的含量［J］.中國藥事，2007，21 (10) : 834 －835.

［6］曾常青，曾宇，趙越，等.六味地黃湯中4種有效成分的含量測定［J］.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2007，27(8) : 1034－1036.

［7］李小娜，王巧，張?zhí)m桐，等.山茱萸中馬錢苷在大鼠體內(nèi)的藥物動力學(xué)研究［J］.藥物分析雜志，2007，27 (1) : 4－7.

［8］謝躍生，張振清，阮金秀.小鼠血漿中馬錢素的高效液相色譜測定法及藥代動力學(xué)［J］.藥學(xué)學(xué)報，2002，37 (7) : 548－550.

［9］潘璐琳，歐陽臻，楊雨，等.葛根及復(fù)方中葛根素在大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)研究［J］.中國藥學(xué)雜志，2009，44 (9) : 703－705.

［10］洪戰(zhàn)英，樂健，范國榮，等.延胡索伍用白芷對延胡索乙素藥動學(xué)的影響［J］.中國藥學(xué)雜志，2009，44(8) : 620－623.

［11］魏玉輝，秦紅巖，段好剛，等.六味地黃丸對大鼠肝微粒體代謝酶P450活性的影響［J］.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2008，28(19) : 1665－1669.

Study on the pharmacokinetic of loganin in Liuwei Dihuang Pills in rats

ZENG Qing-lan1，CUI Xiang-zhen2
(1.Department of Gynaecology and Obstetrics，Shandong Provincial Hospital Affiliated to Shandong University，Jinan 250021，China;2.Institute of Food and Drug，Shandong Institute of Commerce and Technology，Jinan 250103，China)

Abstract:Objective To establish an HPLC－MS methods for the determination of loganin in rats plasma and to study the pharmacokinetic of loganin after administration of Liuwei Dihuang Pills.Methods 6 Wistar rats were administrated with Liuwei Dihuang Pills suspension (10 g·kg－1).The blood samples were collected as scheduled time and analyzed by HPLC－MS.The pharmacokinetic parameters of loganin were calculated by DAS 2.0 pharmacokinetic software.Results The main parameters of loganin in Liuwei Dihuang Pills were shown as follows: t1/2(4.398±1.633) h，Tmax(2.083± 1.021) h，Cmax(369.314±53.452) ng·mL－1，AUC0～24(2 275.174±553.825) ng·mL－1·h，AUC0～∞(2 343± 601.313) ng·mL－1·h.Conclusion The HPLC－MS method was sensitive and selective for determination of loganin in plasma.A bimodal phenomenon was observed in the plasma prole after administration of Liuwei Dihuang Pills.

Key words:Liuwei Dihuang Pills; Loganin; Pharmacokinetics; HPLC－MS

通訊作者:崔向珍，女，副教授，研究方向:生化藥物與藥物分析，Tel: 13864186415，E－mail: cxzjinan@163.com

作者簡介:曾慶蘭，女，主管護(hù)師，研究方向:老年病護(hù)理干預(yù)和相關(guān)藥物分析，E－mail: xy@ sdcoal.gov.cn

中圖分類號:R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A

文章編號:2095－5375(2015) 10－0571－004