萬 鵬，顏 顥，邵素娟，段振華

(海南大學(xué)食品學(xué)院，?？?570228)

靈芝(Ganoderma lucidum)外形呈傘狀，菌蓋腎形、半圓形或近圓形，為多孔菌科真菌靈芝的子實(shí)體。我國最早的藥學(xué)專著《神農(nóng)本草經(jīng)》將靈芝列為上品，有紫、赤、青、黃、白、黑六種，被稱之為:“上上之藥，方中妙品”［1］。靈芝多糖GLA、GLB、GLC 對超氧陰離子自由基(O－2 ·)的產(chǎn)生和紅細(xì)胞脂質(zhì)過氧化均有抑制作用，并對羥基自由基(·OH)有清除作用，具有超氧化物歧化酶樣活性，是靈芝抗氧化、延緩衰老的重要因素［2-4］。

甘靈茶的原料來自于甘草和靈芝，接種過靈芝的甘草布滿了靈芝菌絲體，通過靈芝菌絲的分解，將甘草里難以被人吸收的物質(zhì)轉(zhuǎn)化成易被人體吸收的成分，因而營養(yǎng)、保健與藥用價(jià)值得到了更大的提高。本文以甘靈茶為原料，從中提取抗氧化成分，以甘靈茶提取液清除DPPH 的效果為評(píng)價(jià)指標(biāo)，研究甘靈茶中抗氧化成分的提取技術(shù)，并對提取液中的多酚和多糖進(jìn)行測定，旨在為甘靈茶的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

甘靈茶，海南全仙禾生物科技有限公司提供;96%DPPH，上海源葉生物科技有限公司;95%乙醇、氫氧化鈉、鹽酸、福林酚、碳酸鈉、無水葡萄糖、苯酚、濃硫酸均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器及設(shè)備

EL204 型電子天平，梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司;A11BS 型高速組織搗碎機(jī)，IKA 集團(tuán);HHS26S 型電熱恒溫水浴鍋，江蘇金壇市大地自動(dòng)化儀器廠;PHS-3C 型pH 計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司;722 可見分光光度計(jì)，上海奧普勒有限公司;101-2 型電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱，常州市華普達(dá)教學(xué)儀器有限公司。

1.3 溶液配制

1.3.1 蒽酮試劑的配制 精確稱取蒽酮2.000g，用98%濃硫酸溶解并定容至1 000mL。

1.3.2 DNS 試劑的配制 精確稱取6.5g 3，5-二硝基水楊酸溶于少量熱水，移入1000mL 容量瓶，加入2moL/L 氫氧化鈉溶液325mL，再加入丙三醇45g，搖勻，定容至1000mL。

1.4 DPPH 清除率的測定方法［5-6］

稱取DPPH 試劑7.9mg，用乙醇溶液溶解，定量轉(zhuǎn)入100mL 容量瓶中，并定容至刻度，搖勻得濃度為79.0mg/L DPPH 儲(chǔ)備液(2.0×10－4mol/L)置于冰箱中冷藏備用。利用DPPH 自由基的溶液特征紫紅色團(tuán)的吸收峰，用分光光度法分別測定各樣品提取液在波長517nm 處吸收值。按表1 加反應(yīng)液。

表1 試樣加樣表

將Ai所表示的樣品溶液在室溫下避光反應(yīng)一定時(shí)間(30min)后，在517nm 處，以調(diào)零管為基準(zhǔn)，先測定每個(gè)條件下空白對照組的吸收值(A0)，再平行測定該條件下三次吸收值(Ai)，求得清除率的平均值。DPPH 清除率的計(jì)算公式為(1)式:

DPPH 清除率(%)=1－Ai/A0×100 (1)

1.5 多酚的測定方法［7］

標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定;采用福林—酚法。精密稱取20mg 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，蒸餾水溶解并定容至200mL 分別吸取0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL 標(biāo)準(zhǔn)品溶液，各補(bǔ)水至0.5mL。然后加入10%FC 試劑2.5mL，充分搖勻。反應(yīng)5min 后加入溶液7.5%Na2CO3溶液5mL，50℃水浴鍋中反應(yīng)5min。室溫避光保存1h。于波長760nm 處測定吸光度。標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程結(jié)果為:Y=5.398 6X+0.020 2，R2=0.995 4，Y:吸光度;X:沒食子酸質(zhì)量濃度(mg/mL)。

樣品測定;吸取甘靈茶提取液0.5mL，按上述步驟操作測定吸光度，以標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程和用量計(jì)算甘靈茶提取液多酚得率見(2)式。

1.6 多糖的測定方法［8］

1.6.1 總糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

采用蒽酮—硫酸法。精確量取0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液(100mg/mL)于6 支試管中，再分別加入蒸餾水至總體積為1mL，搖勻后分別加入5mL 蒽酮試劑，混勻后置于沸水浴中加熱6min，取出冷卻至室溫，以空白管為對照，在620nm 波長處測定吸光度。以吸光度為橫坐標(biāo)，葡萄糖濃度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。線性回歸方程為:y=192.56x-0.386 7，R2=0.999 9。

樣品測定:吸取甘靈茶提取液1mL，按上述步驟操作測定吸光度，以線性回歸方程和用量計(jì)算甘靈茶提取液總糖含量。

1.6.2 還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

采用DNS 法。分別精密吸取0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4mL 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液(1 000mg/L)，加入8 個(gè)25mL 容量瓶中，加水至總體積為2.5mL，再分別加入3mL DNS 試劑，混勻后置于沸水浴中加熱5min，取出后立即冷卻至室溫，加水定容至25mL，搖勻后，以空白管為對照，在540nm 處測定吸光度。以吸光度為橫坐標(biāo)，葡萄糖濃度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。線性回歸方程為:y=4326.2x +101.01，R2=0.999 7。

樣品測定:吸取甘靈茶提取液2.5mL，按上述步驟操作測定吸光度，以線性回歸方程和用量計(jì)算甘靈茶提取液還原糖含量。

1.6.3 多糖含量計(jì)算

多糖含量=總糖含量－還原糖含量

1.7 試驗(yàn)方法

1.7.1 單因素試驗(yàn)

(1)提取溫度的確定:在蒸餾水pH 為7.0、提取時(shí)間為15min、甘靈茶用量為3%的情況下，提取溫度分別為40、50、60、70、80℃條件下，以提取液清除DPPH 的能力為指標(biāo)，確定最佳提取溫度。

(2)pH 的確定:在提取溫度為60℃，提取時(shí)間為15min、甘靈茶用量為3%的情況下，溶劑(蒸餾水)pH 分別為2.5、4.5、6.5、8.5、10.5 的條件下，以提取液清除DPPH 的能力為指標(biāo)，確定最佳pH。

(3)提取時(shí)間的確定:在提取溫度為60℃、蒸餾水的pH 為6.5、甘靈茶用量為3%的情況下，提取時(shí)間分別為5、15、25、35、45、55min，以提取液清除DPPH 的能力為指標(biāo)，確定最佳提取時(shí)間。

(4)甘靈茶用量的確定:在提取溫度為60℃、蒸餾水的pH 為6.5、提取時(shí)間為15min 的情況下，甘靈茶用量分別為1%、2%、3%、4%、5%時(shí)，以提取液清除DPPH 的能力為指標(biāo)，確定最佳用量。

1.7.2 測定甘靈茶提取液DPPH 清除率［9］

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以提取溫度、溶劑pH、提取時(shí)間、甘靈茶用量為因素，DPPH 清除率為指標(biāo)，設(shè)計(jì)了四因素三水平的正交試驗(yàn)，各因素水平見表2。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2 結(jié)果與討論

2.1 溫度對甘靈茶提取液的抗氧化性影響

在蒸餾水pH 為7.0、提取時(shí)間為15min、甘靈茶用量為3%的情況下，分別測定40、50、60、70、80℃等5 個(gè)不同溫度條件下的甘靈茶提取液的DPPH 清除率，結(jié)果見圖1。

從圖1 可知，隨著溫度的升高，DPPH 清除率呈現(xiàn)先上升后下降然后趨于平穩(wěn)的變化趨勢。溫度在50～60℃的范圍內(nèi)，曲線的斜率最大，即DPPH 清除率值增加最快，當(dāng)溫度高于60℃時(shí)，曲線下降后趨于平穩(wěn)。因而提取溫度以60℃最佳。原因可能是隨著溫度的升高，抗氧化物質(zhì)如多酚和多糖等滲出、擴(kuò)散速率加快，從而DPPH 清除率升高，但溫度高于60℃，DPPH 清除率反而下降，這是由高溫對抗氧化物質(zhì)活性不利。

圖1 不同提取溫度對甘靈茶提取液DPPH 清除率的影響

2.2 溶劑pH 值對甘靈茶提取液的抗氧化性影響

在提取溫度為60℃、提取時(shí)間為15min、甘靈茶用量為3%的情況下，測定了pH 分別為2.5、4.5、6.5、8.5、10.5 時(shí)甘靈茶提取液的DPPH 清除率。由圖2 可知，隨著pH 的升高，曲線開始相差不大，隨后呈先升后降的趨勢，當(dāng)pH 為6.5 時(shí)，甘靈茶提取液的DPPH 清除率最高。原因可能是是pH 過高或過低都會(huì)影響甘靈茶抗氧化物質(zhì)的活性，因而取pH 為6.5 最適宜。

圖2 不同提取pH 值對甘靈茶提取液DPPH 清除率的影響

2.3 提取時(shí)間對甘靈茶提取液的抗氧化性影響

在提取溫度為60℃、蒸餾水的pH 為6.5、甘靈茶用量為3%的情況下，測出提取時(shí)間分別為5、15、25、35、45、55min 的條件下對甘靈茶提取液的DPPH 清除率的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 不同提取時(shí)間對甘靈茶提取液DPPH 清除率的影響

由圖3 可知，隨著提取時(shí)間的增加，曲線呈先升后降的趨勢，當(dāng)提取時(shí)間為15min 時(shí)，甘靈茶提取液的DPPH 清除率最高。原因可能是時(shí)間過長多酚類等活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，如由于多酚類羥基的氧化、偶聯(lián)作用，多酚羥基數(shù)量減少，抗氧化能力相應(yīng)降低［10］，導(dǎo)致DPPH 清除率下降。

2.4 甘靈茶用量對甘靈茶提取液的抗氧化性影響

在提取溫度為60℃、蒸餾水的PH 為6.5、提取溫度為60℃的情況下，測出甘靈茶用量分別為1%、2%、3%、4%、5%時(shí)甘靈茶提取液的DPPH 清除率，結(jié)果見圖4。

由圖4 可知，隨著甘靈茶用量的增加，曲線呈先升后降的趨勢，當(dāng)甘靈茶的用量為3%時(shí)，甘靈茶提取液的DPPH 清除率最高。原因可能是隨著甘靈茶用量的增加，抗氧化活性物質(zhì)的溶出、擴(kuò)散速率加快，從而促進(jìn)提取液中多酚、多糖等成分的提高，因此DPPH 清除率升高。當(dāng)甘靈茶用量繼續(xù)增加時(shí)，在同樣的提取時(shí)間下用量大的甘靈茶浸泡不夠徹底，不利于原料中多酚、多糖的溶出，使DPPH 清除率下降。因此，甘靈茶用量取3%最佳。

圖4 不同甘靈茶用量對甘靈茶提取液DPPH 清除率的影響

2.5 甘靈茶提取液的正交試驗(yàn)

根據(jù)上述單因素試驗(yàn)結(jié)果，對提取溫度，提取pH，提取時(shí)間，甘靈茶用量進(jìn)行了正交試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果及方差分析結(jié)果分別見表3 和表4。可以看出各因素對甘靈茶提取液影響順序?yàn)锽 ＞D ＞A ＞C，即提取pH 的影響最大，甘靈茶用量其次，提取溫度次之，提取時(shí)間的影響最小。從正交試驗(yàn)結(jié)果看，提取溫度應(yīng)選水平3 較好，提取時(shí)間選水平3 較好。但是方差分析結(jié)果表明只有提取pH 和甘靈茶用量2 個(gè)因素的影響顯著，加上節(jié)能和提取速率的考慮，決定提取溫度選水平2、提取時(shí)間選水平1 較好。綜上，最佳提取工藝為A2B3C1D2。即pH 為8.5、甘靈茶用量為3%、溫度60℃、時(shí)間15min，在此條件下DPPH 清除率為86.24%。

多酚具有較強(qiáng)的清除自由基、抗氧化活性［7，11］。最近的研究表明，靈芝多糖對細(xì)胞的抗氧化作用十分明顯［12］。為此，對提取液中的多酚和多糖分別進(jìn)行了測定，發(fā)現(xiàn)多酚含量為0.187mg/mL，多糖含量為0.244mg/mL。因此，這些成分對DPPH 清除率的提高起著重要的作用。

表3 甘靈茶提取液正交試驗(yàn)結(jié)果

表4 方差分析結(jié)果

3 結(jié)論

通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，確定了抗氧化性高的甘靈茶提取液的提取工藝，最佳工藝為提取溫度為60℃、溶劑pH 值為8.5、提取時(shí)間為15min、甘靈茶用量為3%。在此條件下DPPH 清除率為86.24%，提取液中的多酚含量為0.187mg/mL，多糖含量為0.244mg/mL。

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