王世強(qiáng)，常 蕓，馬曉雯，王 菲

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不同強(qiáng)度耐力運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠心肌膠原蛋白的影響及MMP-1/TIMP-1的調(diào)節(jié)作用

王世強(qiáng)1,2，常 蕓2，馬曉雯2，王 菲2

目的：探討不同強(qiáng)度耐力運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠心肌不同部位膠原蛋白的影響，并研究MMP-1/TIMP-1的表達(dá)變化，為運(yùn)動(dòng)性心律失常的發(fā)生機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法：72只健康成年雄性SD大鼠隨機(jī)分為安靜對(duì)照組、中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組和大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組，每組24只。分別進(jìn)行8周、12周和16周運(yùn)動(dòng)，每周訓(xùn)練5天，休息2天，每次1 h。運(yùn)動(dòng)8周、12周和16周后，24 h內(nèi)處死取材摘取心臟，分離出右心房、右心室和左心室。天狼星紅染色觀察心肌間質(zhì)中膠原蛋白的變化并計(jì)算膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF)。免疫熒光檢測(cè)Ⅰ型膠原蛋白的含量。Western Blot檢測(cè)MMP-1和TIMP-1的蛋白表達(dá)，并計(jì)算MMP-1/TIMP-1的比值。結(jié)果：大強(qiáng)度耐力運(yùn)動(dòng)提高了右心房和右心室CVF和Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)(P<0.01)，且運(yùn)動(dòng)時(shí)間越長(zhǎng)，增加幅度越大，對(duì)左心室CVF和Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)影響不明顯。中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)雖促進(jìn)了心肌CVF和Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。蛋白檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，16周的大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)右心室MMP-1表達(dá)的影響不明顯，卻顯著提高了右心室TIMP-1的表達(dá)(P<0.01)，使得MMP-1/TIMP-1(P<0.05)的比值顯著降低。中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)MMP-1和TIMP-1表達(dá)的影響不明顯。結(jié)論：長(zhǎng)期大強(qiáng)度耐力運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致大鼠右心房和右心室膠原容積分?jǐn)?shù)和Ⅰ型膠原蛋白顯著增加。12周大強(qiáng)度耐力運(yùn)動(dòng)后大鼠右心房發(fā)生纖維化，且隨運(yùn)動(dòng)時(shí)間增加，心房纖維化程度增大，右心室的纖維化出現(xiàn)在第16周。心肌纖維化的發(fā)生可能與長(zhǎng)期大強(qiáng)度耐力運(yùn)動(dòng)造成TIMP-1的表達(dá)增加、進(jìn)而引起MMP-1/TIMP-1的比例失調(diào)有關(guān)。

運(yùn)動(dòng)；心肌纖維化；膠原蛋白；基質(zhì)金屬蛋白酶；心臟；鼠；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

運(yùn)動(dòng)性心律失常是運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)和體育科學(xué)備受關(guān)注的問(wèn)題。常蕓針對(duì)我國(guó)優(yōu)秀運(yùn)動(dòng)員潛在的心臟隱患的調(diào)研也證實(shí)，長(zhǎng)期從事大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)的優(yōu)秀運(yùn)動(dòng)員存在較高的心律失常風(fēng)險(xiǎn)[1]。另外，研究者前期針對(duì)運(yùn)動(dòng)性心律失常的病理發(fā)生機(jī)制進(jìn)行了大量的實(shí)驗(yàn)性研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可導(dǎo)致心臟損傷或心律失常，其發(fā)生機(jī)制與長(zhǎng)期大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致心肌組織能量代謝障礙、心肌炎癥反應(yīng)、離子通道異常和細(xì)胞骨架蛋白受損等因素有關(guān)，但其病因、病理及發(fā)病機(jī)制尚不清楚[2]。

近年，人體實(shí)驗(yàn)研究表明，長(zhǎng)期大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致膠原蛋白過(guò)度增加，一定比例的耐力運(yùn)動(dòng)員存在心肌纖維化現(xiàn)象，這可能是引起運(yùn)動(dòng)性心肌損傷和心律失常的重要病理改變[21,36]。Chang等的研究結(jié)果也證實(shí)，4周反復(fù)力竭運(yùn)動(dòng)能引起大鼠心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)纖維化的發(fā)生[14]。2015年的一篇報(bào)道進(jìn)一步證實(shí)，長(zhǎng)期大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)能誘導(dǎo)小鼠心房纖維化發(fā)生，增加小鼠心房纖顫的敏感性[9]。

臨床病理研究認(rèn)為，心肌纖維化是心臟長(zhǎng)期受到異常刺激后出現(xiàn)的一種組織學(xué)病理變化，結(jié)構(gòu)改變常表現(xiàn)為心肌組織中的成纖維細(xì)胞增殖和以膠原蛋白為主的細(xì)胞外基質(zhì)增多，細(xì)胞外基質(zhì)的合成和降解失調(diào)，Ⅰ型(Collagen I ，Col-I)、Ⅲ型(CollagenⅢ ，Col-Ⅲ)膠原比例增加，各型膠原比例的失調(diào)。心肌纖維化功能性改變表現(xiàn)為心肌僵硬度增加、順應(yīng)性減少、收縮力下降，心臟功能逐漸減退。心肌纖維化是心律失常發(fā)生的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，通過(guò)形成折返環(huán)、傳導(dǎo)延緩和傳導(dǎo)阻滯，誘發(fā)心律失常[19]。有研究報(bào)道，16周的跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)使大鼠右心房和右心室膠原蛋白顯著增加，導(dǎo)致心肌纖維化[11]。不同周期和不同強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)心肌不同部位膠原蛋白變化如何，目前鮮見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

MMP-1(matrix metalloproteinase-2，MMP-1)是調(diào)節(jié)心肌膠原蛋白降解的關(guān)鍵酶，可促進(jìn)膠原蛋白的降解。TIMP-1(tissue inhibitors of metalloproteinase-1， TIMP-1)是MMP-1內(nèi)源性生理抑制劑，可通過(guò)與其可逆結(jié)合形成復(fù)合物，從而抑制MMP-1的活性。MMP-1主要降解間質(zhì)中的Ⅰ型和Ⅲ型膠原[31]。生理狀態(tài)下，MMP-1和TIMP-1保持動(dòng)態(tài)平衡，共同維持心肌膠原蛋白的穩(wěn)定[32]。有研究表明，在高血壓和容量負(fù)荷過(guò)載的大鼠心肌組織中，存在MMP-1/TIMP-1比例失調(diào)的現(xiàn)象[26,33]。不同強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)MMP-1/TIMP-1的影響如何，MMP-1/TIMP-1是否介導(dǎo)了過(guò)度運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的心肌纖維化的發(fā)生？目前鮮見(jiàn)報(bào)道。

本研究觀測(cè)了不同強(qiáng)度和不同周期運(yùn)動(dòng)的大鼠右心房、右心室和左心室中膠原蛋白、Col-I以及MMP-1/TIMP-1的變化，從而探討運(yùn)動(dòng)性心肌纖維化的發(fā)病特點(diǎn)及可能機(jī)制，力圖進(jìn)一步闡明運(yùn)動(dòng)性心律失常的發(fā)生發(fā)展機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

8周齡SPF級(jí)健康雄性SD大鼠72只，體重為(220±8 g)，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)為SCXX(京)2012-0001。所有大鼠均以嚙齒類(lèi)動(dòng)物普通飼料喂養(yǎng)，在國(guó)家體育總局體育科學(xué)研究所ABSL-3級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)，室溫為22±2℃，空氣濕度為45%～55%，每天光照12 h。

1.2 分組和運(yùn)動(dòng)方案

1.3 取材

在運(yùn)動(dòng)8周、12周和16周后分別進(jìn)行取材，每周宰殺24只大鼠，每組8只。迅速取出心臟，切取右心房、右心室和左心室，每塊組織分為3份，其中1份經(jīng)OCT包埋用于做冰凍切片，1份組織經(jīng)多聚甲醛固定后用于制作石蠟切片，另外1份放入-80℃冰箱用于做Western blot。

1.4 天狼星紅染色

為觀察心肌間質(zhì)的纖維化程度，采用纖維化評(píng)價(jià)典型染色方法苦味酸-天狼星紅對(duì)大鼠的右心房、右心室和左心室膠原纖維進(jìn)行染色。組織經(jīng)脫水、透明、切片、脫蠟至水后入苦味酸-天狼猩紅飽和溶液(購(gòu)于北京普洛瑞斯生物公司)中15 min，經(jīng)脫水透明后，中性樹(shù)膠封片，400倍鏡攝取圖像。每組8個(gè)樣本，每個(gè)樣本隨機(jī)選取4個(gè)視野，采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件通過(guò)灰度值調(diào)節(jié)區(qū)分膠原和非膠原面積進(jìn)行半定量分析，得出膠原面積與視野總面積的比值，即膠原容積分?jǐn)?shù)(Collagen Volume Fraction，CVF)。

1.5 免疫熒光檢測(cè)膠原蛋白Ⅰ蛋白表達(dá)

冰凍切片入丙酮固定后PBS沖洗，山羊血清封閉30 min，滴加一抗(兔抗CollagenⅠ、1∶500，購(gòu)于美國(guó)Abcam公司)后4℃過(guò)夜，PBS沖洗后滴加FITC標(biāo)記的二抗(1∶200，購(gòu)于美國(guó)Abcam公司)，PBS沖洗后甘油封片，200倍鏡檢。在相同拍攝條件下攝取，每個(gè)樣本隨機(jī)攝取4張圖像，采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件對(duì)目標(biāo)蛋白熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量，以陰性對(duì)照樣本中的熒光強(qiáng)度作為參照，熒光強(qiáng)度用積分灰度表示(Integrated Optical Density，IOD)。

1.6 Western Blot法檢測(cè)心肌組織MMP-1和TIMP-1的蛋白表達(dá)

提取總蛋白后，用BCA法測(cè)定并調(diào)整蛋白濃度一致，加入上樣緩沖液沸水中10 min使蛋白變性。120 V恒壓SDS-PAGE電泳1 h后，200 mA恒流轉(zhuǎn)膜2 h。5%脫脂奶粉(購(gòu)于美國(guó)BD公司)封閉1 h，一抗(Anti-MMP-1和Anti-TIMP-1稀釋比例都為1∶1 000，分別購(gòu)于美國(guó)SantaCruz和Abcam公司)置于搖床4℃過(guò)夜。TBST洗滌3次后，加HRP標(biāo)記的二抗(1∶5 000，購(gòu)于北京欣博盛公司)，室溫?fù)u床孵育1 h。TBST洗膜3次，滴加ECL化學(xué)發(fā)光試劑(購(gòu)于美國(guó)Millipore)，室溫2 min，濾紙吸干后置于保鮮膜內(nèi)封存，置于暗匣內(nèi)，X光片曝光約1～5 min，顯影液中顯影2 min，定影數(shù)十秒，條帶用Image J1.46軟件進(jìn)行圖像分析。內(nèi)參為β-actin(購(gòu)于北京欣博盛公司)，計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參蛋白條帶的積分光密度(IOD)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所得數(shù)據(jù)用 GraghPad Prism 6.0軟件轉(zhuǎn)換作圖。所有數(shù)據(jù)均用SPSS 18.0進(jìn)行分析處理，結(jié)果采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用多因素方差分析組間差異。

2 結(jié)果

2.1 大鼠膠原分?jǐn)?shù)的變化

結(jié)果如表1、圖1和圖2所示。8周運(yùn)動(dòng)后，與C組相比，M組和H組大鼠右心房、右心室和左心室CVF均有增加，但均不具有顯著性差異，其中，H組大鼠CVF增加幅度較大。

表 1 本研究大鼠心肌組織CVF變化情況一覽表
Table 1 Change of Myocardium CVF of rats (%)

CMH8周右心房2．207±0．3222．128±0．3842．567±0．594 右心室1．913±0．4812．133±0．3592．412±0．183左心室1．680±0．6251．787±0．3761．828±0．45712周右心房2．060±0．2392．213±0．2533．175±0．427??##右心室2．265±0．4482．558±0．5423．220±0．860左心室2．241±0．2361．814±0．2742．367±0．43216周右心房1．984±0．3082．347±0．1364．295±0．416??##右心室2．427±0．4332．872±0．3614．392±0．542??##左心室2．371±0．5892．294±0．5322．601±0．406

注： **P<0.01，與C組比較；##P<0.01，與M組比較；n=8。

圖 1 本研究大鼠右心室心肌組織天狼星紅染色示意圖(×400)Figure 1. Sirius Red Dyeing Results in Rat Right Ventricle(×400)注：紅色代表膠原纖維。n=8。

圖 2 本研究大鼠心肌CVF示意圖Figure 2. CVF of Rat Myocardium(n=8)

12周運(yùn)動(dòng)后，M組大鼠右心房和右心室CVF低于C組，而左心室CVF高于C組，但均無(wú)顯著性差異。H組右心房CVF顯著高于C組和M組(P<0.01)，分別增加0.54倍和0.43倍。與C組相s比，H組右心室和左心室CVF雖然也有增高趨勢(shì)，但均無(wú)顯著性差異。

16周運(yùn)動(dòng)后，M組大鼠右心房和右心室CVF低于C組，而左心室CVF高于C組，但均無(wú)顯著性差異。H組右心房CVF顯著高于C組和M組(P<0.01)，分別增加1.16倍和0.83倍。H組右心室CVF顯著高于C組和M組(P<0.01)，分別增加1.78倍和1.53倍。

綜上所述，和C組相比，M組對(duì)心肌CVF無(wú)明顯變化，而H組顯著促進(jìn)了右心房和右心室CVF的增加，隨時(shí)間延長(zhǎng)，CVF增加幅度越大。

2.2 大鼠Col-I的動(dòng)態(tài)變化

免疫熒光染色結(jié)果如圖3和圖4所示。與C組相比，8周中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)右心房、右心室和左心室Col-I的表達(dá)均無(wú)顯著影響。H組右心房Col-I的表達(dá)顯著高于C組(P<0.05)，右心室和左心室Col-I的表達(dá)也高于C組，但均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖 3 本研究大鼠右心室I型膠原蛋白(Col-I)免疫熒光染色結(jié)果(×200)Figure 3. Immunofluorescence of Collagen in Rat Right Ventricle(×200)注：綠色代表Col-I。

圖 4 本研究I型膠原蛋白(Col-I)積分光密度示意圖Figure 4. Integrated Optical Density of CollagenⅠ(n=8)

12周中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)右心房、右心室和左心室Col-I的表達(dá)均無(wú)顯著影響。12周H組右心房Col-I的表達(dá)均顯著高于C組與M組(P<0.05)。12周H組右心室Col-I的表達(dá)均顯著高于C組與M組(P<0.01)，而左心室Col-I的表達(dá)和C組無(wú)明顯差異。

16周中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)右心房、右心室和左心室Col-I的表達(dá)均高于C組，但均無(wú)顯著性差異。16周H組右心房和右心室Col-I的表達(dá)均顯著高于C組與M組(P<0.01)，而對(duì)左心室膠原蛋白無(wú)明顯影響。

綜上所述，和C組相比，中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)心肌Col-I的表達(dá)無(wú)明顯改變，而H組顯著促進(jìn)了右心房和右心室Col-I的表達(dá)，而對(duì)左心室Col-I的表達(dá)影響不顯著。

2.3 MMP-1和TIMP-1的變化

為進(jìn)一步研究MMP-1和TIMP-1在運(yùn)動(dòng)性心肌纖維化中的作用，采用Western Blot檢測(cè)16周大鼠右心室MMP-1和TIMP-1蛋白的表達(dá)情況，并計(jì)算其比值。

結(jié)果如圖5所示，與C組相比，M組運(yùn)動(dòng)對(duì)MMP-1和TIMP-1無(wú)明顯影響。而16周大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)促進(jìn)了MMP-1的表達(dá)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。H組TIMP-1顯著高于C組和M組(P<0.01)。計(jì)算其比值發(fā)現(xiàn)，和C組相比，H組MMP-1/TIMP-1的比值低于C組和M組(P<0.05)。

圖 5 16周運(yùn)動(dòng)后大鼠右心室MMP-1、TIMP-1及MMP-1/TIMP-1的比值變化Figure 5. Expression of MMP-1 and TIMP-1 of Right Ventricle after 16 Weeks and Ratio of MMP-1/TIMP-1(n=8)

3 討論

運(yùn)動(dòng)員心律失常發(fā)生率高于常人已是普遍認(rèn)可的事實(shí)，是影響運(yùn)動(dòng)員體能、健康以及正常訓(xùn)練比賽的重要原因。為了進(jìn)一步揭示運(yùn)動(dòng)性心律失常的病理變化與發(fā)生機(jī)制，預(yù)防和降低運(yùn)動(dòng)性心律失常的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)和發(fā)病率，更好地保護(hù)運(yùn)動(dòng)員生命健康，規(guī)避運(yùn)動(dòng)場(chǎng)上心血管意外的發(fā)生，有必要深入開(kāi)展運(yùn)動(dòng)性心肌損傷纖維化病理與發(fā)病機(jī)制的研究，力圖為運(yùn)動(dòng)性心肌心律失常發(fā)生機(jī)制的闡釋提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。研究表明，反復(fù)大強(qiáng)度訓(xùn)練或力竭運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致心肌細(xì)胞氧自由基增多、能量代謝失調(diào)、離子通道障礙、細(xì)胞過(guò)度凋亡受損等病理現(xiàn)象綜合誘發(fā)了運(yùn)動(dòng)性心肌損傷和心律失常的發(fā)生[37]。人體[12]和動(dòng)物[11]研究均有證據(jù)顯示，長(zhǎng)期大強(qiáng)度耐力運(yùn)動(dòng)造成心肌損傷和心肌纖維化現(xiàn)象的發(fā)生，可能是造成運(yùn)動(dòng)心律失常的主要病理改變。Wilson等研究了12名高水平耐力運(yùn)動(dòng)員，發(fā)現(xiàn)50%的運(yùn)動(dòng)員存在一定程度的心肌纖維化[38]。有研究報(bào)道，長(zhǎng)期疲勞訓(xùn)練后，大鼠心室肌膠原纖維出現(xiàn)過(guò)度增生、扭曲和局部溶解現(xiàn)象[6]。膠原蛋白(主要是Col-I)的合成增加、降解減少導(dǎo)致膠原過(guò)度沉積是造成心肌纖維化發(fā)生的主要病理變化。因此在本研究中，觀察了運(yùn)動(dòng)性心肌纖維化發(fā)生過(guò)程中膠原蛋白的動(dòng)態(tài)變化，以及降解膠原蛋白的關(guān)鍵酶MMP-1及其抑制劑TIMP-1的變化。

天狼星紅染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，和C組相比，8周、12周和16周中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠右心房、右心室膠原和左心室CVF均有增加，但均不具有顯著性差異。12周大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后,右心房CVF顯著高于C組和M組，右心室和左心室CVF也高于C組但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。16周大強(qiáng)度耐力運(yùn)動(dòng)后,右心房和右心室CVF均顯著高于C組和M組，左心室CVF無(wú)明顯改變。結(jié)果提示，M組運(yùn)動(dòng)沒(méi)有造成大鼠心肌纖維化病變，12周大強(qiáng)度耐力運(yùn)動(dòng)后大鼠右心房發(fā)生纖維化，且隨運(yùn)動(dòng)時(shí)間的延長(zhǎng)，心房纖維化程度增大，右心室的纖維化出現(xiàn)在第16周。Benito等發(fā)現(xiàn)，16周大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)大鼠右心室而非左心室發(fā)生纖維化[11]，與本研究結(jié)果一致。這提示，右心房和右心室可能是運(yùn)動(dòng)性心肌損傷的易發(fā)部位。這也與近年的人體實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果一致，即大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)造成心肌病變的主要部位為右心室而非左心室。Ector等也發(fā)現(xiàn)，具有心律失常的耐力運(yùn)動(dòng)員右心室收縮末期容積顯著高于沒(méi)有心律失常的耐力運(yùn)動(dòng)員[16]。La等發(fā)現(xiàn)，3～11 h的耐力運(yùn)動(dòng)后，運(yùn)動(dòng)員血液肌鈣蛋白I(cTnI)和B型鈉尿肽顯著增加，這與右心室射血分?jǐn)?shù)的降低成正相關(guān)，與左心室射血分?jǐn)?shù)沒(méi)有相關(guān)性[21]。大負(fù)荷訓(xùn)練時(shí)，運(yùn)動(dòng)員右心室收縮末期壓力的增加值遠(yuǎn)大于左心室，認(rèn)為這可能是耐力運(yùn)動(dòng)員右心室容易受損的重要原因[23,24]。

Col-I占心肌總膠原蛋白的85%以上，是構(gòu)成心肌間質(zhì)的主要成分。研究發(fā)現(xiàn)，與膠原蛋白的含量變化一致，不同強(qiáng)度的耐力運(yùn)動(dòng)對(duì)心肌不同部位Col-I的表達(dá)不同，且具有時(shí)間依賴(lài)性。結(jié)果顯示，12周和16周的大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致右心房和右心室Col-I明顯增加，且隨著時(shí)間延長(zhǎng)，增加的幅度越大，而中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)心肌Col-I沒(méi)有明顯影響。與動(dòng)物研究結(jié)果一致，La等測(cè)量27名耐力運(yùn)動(dòng)員進(jìn)行一次超長(zhǎng)耐力運(yùn)動(dòng)后即刻的射血分?jǐn)?shù)后發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)員左心室的射血分?jǐn)?shù)沒(méi)有顯示變化，而右心室的射血分?jǐn)?shù)顯著降低[22]。以往研究表明，衰老[20]、糖尿病[27]和肥胖[13]等長(zhǎng)期慢性炎癥反應(yīng)都會(huì)誘導(dǎo)Col-I的過(guò)度表達(dá)，表現(xiàn)為心肌舒縮功能下降，心肌順應(yīng)性降低。另外，Col-I的過(guò)度增加也會(huì)影響心肌細(xì)胞間的電傳導(dǎo)，造成傳導(dǎo)阻滯誘發(fā)心律失常。

研究證實(shí)，炎癥因子可通過(guò)促進(jìn)膠原蛋白的表達(dá)參與心肌纖維化的發(fā)病過(guò)程。研究表明，TNF-α等炎癥因子是引起Col-I表達(dá)的重要因素[34]。外源性注射TNF-α抑制劑可降低Col-I的過(guò)度表達(dá)，緩解心肌纖維化的程度[35]。研究者前期研究表明，反復(fù)力竭運(yùn)動(dòng)后，大鼠心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)TNF-α[3]和ICAM-1[5]等炎癥因子會(huì)出現(xiàn)不同程度升高，誘發(fā)炎癥反應(yīng)。Aschar-Sobbi等的研究發(fā)現(xiàn)，6周力竭游泳運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)了心房TNF-α的高表達(dá)和心房纖維化，注射TNF-α抑制劑和敲除TNF-α基因的小鼠則抑制了炎癥反應(yīng)和心房纖維化[9]。研究者前期研究還發(fā)現(xiàn)，力竭運(yùn)動(dòng)后4～24 h心臟竇房結(jié)ADAMTS-1顯著低表達(dá)，ADTMTS-1的降低可通過(guò)促進(jìn)TGF-β1的表達(dá)促進(jìn)Col-I的表達(dá)，誘導(dǎo)心肌間質(zhì)纖維化的形成[7]。以上研究提示，長(zhǎng)期大強(qiáng)度耐力運(yùn)動(dòng)誘發(fā)體內(nèi)炎癥反應(yīng)，引起心肌膠原蛋白的過(guò)度增加，導(dǎo)致心肌纖維化的形成。

研究者進(jìn)一步研究了調(diào)節(jié)膠原代謝酶系的變化情況。MMP-1是降解膠原蛋白的關(guān)鍵酶，TIMP-1是其生理性抑制劑，MMP-1/TIMP-1在正常動(dòng)物體內(nèi)保持動(dòng)態(tài)平衡，其對(duì)維持膠原蛋白合成和降解的動(dòng)態(tài)平衡具有重要意義[40]。MMP-1的異常表達(dá)參與了許多心血管疾病的發(fā)病過(guò)程，MMP-1的表達(dá)增加和活性過(guò)度增強(qiáng)，TIMP-1的表達(dá)也相應(yīng)增加， MMP-1/TIMP-1的比例失調(diào)，導(dǎo)致膠原蛋白的合成和降解之間的平衡受到破壞，導(dǎo)致心肌纖維化的發(fā)生[30]。研究表明，在異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心衰大鼠模型中， MMP-1表達(dá)與TIMP-1的表達(dá)升高，兩者的比值增加[17]。在“兩腎一夾”(用銀鉗夾住左腎動(dòng)脈，使其狹窄)造成的腎性高血壓大鼠模型中，左室心肌MMP-1與TIMP-1 mRNA的表達(dá)均增加，兩者的比值顯著升高[4]。Wright等研究發(fā)現(xiàn)，衰老誘導(dǎo)心肌纖維化模型大鼠心肌組織的MMP-1和TIMP-1顯著高表達(dá)，MMP-1/TIMP-1平衡受到破壞[39]。本研究中發(fā)現(xiàn)，16周的大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)使大鼠右心室TIMP-1的蛋白顯著增加，MMP-1變化不明顯，M組運(yùn)動(dòng)對(duì)MMP-1和TIMP-1的表達(dá)影響不明顯。計(jì)算其比值發(fā)現(xiàn)，16周大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后，右心室MMP-1/TIMP-1的比值顯著低于C組和M組，造成MMP-1/TIMP-1顯著降低，MMP-1/TIMP-1平衡失調(diào)。TIMP-1可通過(guò)抑制MMP-1的活性，抑制膠原蛋白的降解，促進(jìn)纖維化的形成。有研究顯示，TNF-α和IL-1β可誘導(dǎo)細(xì)胞分泌TIMP-1[28]?？梢酝茰y(cè)，TIMP-1的高表達(dá)可能與長(zhǎng)期高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)引起的體內(nèi)TNF-α、IL-1β等炎性因子的增高有關(guān)。

本研究通過(guò)建立長(zhǎng)期大強(qiáng)度耐力運(yùn)動(dòng)大鼠模型，觀察到反復(fù)大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)誘發(fā)心肌纖維化，這可能是過(guò)度運(yùn)動(dòng)造成心肌反復(fù)損傷、修復(fù)最終導(dǎo)致的結(jié)果。美國(guó)運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)學(xué)者研究也指出，運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度與心臟患病風(fēng)險(xiǎn)存在U型關(guān)系，過(guò)度運(yùn)動(dòng)反而會(huì)增加心臟患病風(fēng)險(xiǎn)[29]。這提醒，雖然“運(yùn)動(dòng)是良藥”，但也要適度。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，反復(fù)大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)造成心臟損傷的部位為心房和右心室，而非左心室。國(guó)外研究指出，長(zhǎng)期耐力運(yùn)動(dòng)對(duì)右心室的重塑的時(shí)間要早于左心室，重塑的程度也大于左心室[8]。通過(guò)非侵入手段在耐力運(yùn)動(dòng)員心臟上進(jìn)行的觀察也證實(shí)了這一點(diǎn)[15,18]。這提示，在以后進(jìn)行的運(yùn)動(dòng)員心臟疾病篩查與診斷時(shí)，除了關(guān)注左心室，更應(yīng)該關(guān)注右心室和心房的健康情況，這對(duì)于我們及時(shí)發(fā)現(xiàn)和預(yù)防運(yùn)動(dòng)員心臟發(fā)生意外具有重要價(jià)值。

本研究還發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)大鼠心肌存在TIMP-1的高表達(dá)、MMP-1/TIMP-1的比例失調(diào)現(xiàn)象，其可能是心肌膠原過(guò)度增生沉積，心纖維化發(fā)生的重要調(diào)節(jié)機(jī)制。Lindsay等在耐力運(yùn)動(dòng)員血漿中也發(fā)現(xiàn)，膠原合成標(biāo)志物PICP和TIMP-1的表達(dá)顯著高于正常對(duì)照組[25]。因此可以推測(cè)，使用某些藥物干預(yù)如氯沙坦，抑制TIMP-1的表達(dá)，使MMP-1/TIMP-1的表達(dá)回歸于平衡，將有助于緩解大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)造成的膠原蛋白的過(guò)度增加，有助于抑制和預(yù)防心肌纖維化發(fā)生。因此，本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究對(duì)人類(lèi)運(yùn)動(dòng)性心律失常的治療靶點(diǎn)和干預(yù)措施選，提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)和借鑒思路，但對(duì)于干預(yù)措施的應(yīng)用仍有一段距離，還需要進(jìn)一步的研究與臨床觀察。使用哪些干預(yù)措施可以緩解過(guò)度運(yùn)動(dòng)造成的心肌損傷和纖維化，將是本課題組進(jìn)一步研究的方向。

本研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致膠原蛋白尤其是Col-I的含量過(guò)度增加，且隨著運(yùn)動(dòng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加幅度變大，最終導(dǎo)致右心室和右心房心肌纖維化的發(fā)生。膠原蛋白的過(guò)度增加會(huì)影響心肌舒縮性能和心肌細(xì)胞間的電傳導(dǎo)，導(dǎo)致傳導(dǎo)阻滯，誘發(fā)心律失常，這可能是運(yùn)動(dòng)性心律失常發(fā)生的重要病理基礎(chǔ)。膠原蛋白的過(guò)度增加可能與心肌組織中的TIMP-1的高表達(dá)、MMP-1/TIMP-1的失衡有關(guān)。

4 小結(jié)

1.長(zhǎng)期大強(qiáng)度耐力運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致大鼠右心房和右心室膠原蛋白含量顯著增加，CVF顯著增高，其中，Col-I的增加更加明顯。12周大強(qiáng)度耐力運(yùn)動(dòng)后大鼠右心房發(fā)生纖維化，且心房纖維化程度隨時(shí)間增加而增大，而右心室的纖維化出現(xiàn)在第16周。過(guò)度增加的膠原纖維勢(shì)必影響心肌收縮性和心電傳導(dǎo)，構(gòu)成運(yùn)動(dòng)性心律失常的病理基礎(chǔ)。

2.16周長(zhǎng)期大強(qiáng)度耐力運(yùn)動(dòng)可使大鼠右心室TIMP-1的表達(dá)顯著增加，進(jìn)而引起MMP-1/TIMP-1的比值降低，使膠原蛋白的降解減少，這可能是造成心肌纖維化發(fā)生的重要機(jī)制。

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Effects of Endurence Exercise of Different Intensity on Cardiac Collagen of Rats and Regulation of MMP-1/TIMP-1

WANG Shi-qiang1,2,CHANG Yun2,MA Xiao-wen2,WANG Fei2

Objective:To explore whether sustained intensive exercise induces myocardial fibrosis through observing the dyanamics of collagen expression,and discuss the change MMP-1/TIMP-1 expression,thus provide experimental evidence for clarifiying the mechanism of exercise- induced arrhythmia.Method:72 SD rats were divided into control group (C),moderate intensity group (M) and high instensity group (H) with 24 animals in each group.M and H group were conditioned to run 4,8,and 16 weeks,5 days/weeks,1h/day.Rats were euthanized to obtain hearts within 24h after exercise.Right atrium,Right ventricle and Left ventricle were collected.Cardiac collagen were quantified by CVF which is calculateed through by sirius red.Collagen expression were quantified by Immunofluorescence.MMP-1 and TIMP-1 expression were detected by Western Blot.Results:Increasing CVF and collagen expression along time were noted in right atrium and right vetricule by intensity endurance exercise(P<0.01).No differences were observed in left ventricle and M group.In further reserch,enhanced TIMP-1 expressed were noted (P<0.01),but only slight increase of MMP-1 in right ventricle after 16 weeks of intensive exercise.As a result,the ratio of MMP-1/TIMP-1 were decreased (P<0.05).We could not find difference of MMP-1 and TIMP-1 in M group compared to C group.Conclusion:Long-term intensity exercise promotes excessive expression of collagen in right atrium and right ventricle,thus leads to impaired right ventricular founction and myocardial fibrosis.Possible mechanism maybe involve overexpression TIMP-1,imbalance of MMP-1/TIMP-1 ratio induced by long-term extensive exercise.

exercise;myocardialfibrosis;collagen;MMP;heart;rat；animalexperiment

2015-03-19；

2015-07-25

國(guó)家體育總局體育科學(xué)研究所基本科研業(yè)務(wù)經(jīng)費(fèi)資助(14-01)。

王世強(qiáng)(1987-)，男，山東濟(jì)寧人，在讀博士研究生，主要研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)心臟生理和病理，E-mail：suswsq@163.com；常蕓(1957-)，女，內(nèi)蒙古呼和浩特人，研究員，博士，博士研究生導(dǎo)師，主要研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)員心臟病生理與醫(yī)務(wù)監(jiān)督，Tel：(010)87182526，E-mai：changyun@ciss.cn；馬曉雯(1989-)，女，北京人，在讀碩士研究生，主要研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)心臟生理和病理；王菲(1990-)，女，江蘇揚(yáng)州人，碩士，主要研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)心臟生理和病理。

1.上海體育學(xué)院 運(yùn)動(dòng)科學(xué)學(xué)院，上海 200438；2.國(guó)家體育總局體育科學(xué)研究所，北京 100061 1.Shanghai University of Sport，Shanghai 200438,China；2.China Institute of Sport Science，Beijing 100061，China.

1002-9826(2015)05-0060-07

10.16470/j.csst.201505010

G804.7

A