朱琰　劉靜　范佳瑋　呂祥

(1. 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上?！?00021；2. 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬市中醫(yī)醫(yī)院，上?！?00071)

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·論著·

人大腸癌移植瘤裸小鼠的不同組織中細(xì)胞凋亡相關(guān)因子的表達(dá)差異

朱琰1劉靜2范佳瑋2呂祥2

(1. 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海200021；2. 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬市中醫(yī)醫(yī)院，上海200071)

摘要目的：研究人大腸癌移植瘤裸小鼠的腫瘤組織、腫瘤鄰近正常腸組織和遠(yuǎn)端正常腸組織中細(xì)胞凋亡相關(guān)因子的表達(dá)差異。方法： 用12只BALB/C裸小鼠建立人大腸癌原位移植瘤模型，于接種后8周處死。采用RT-PCR和免疫組化法檢測(cè)腫瘤組織、腫瘤鄰近(距腫瘤切緣1 cm)正常腸組織和遠(yuǎn)端(距腫瘤切緣>3 cm)正常腸組織中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子與激活子3(STAT3)、Bcl-2、Survivin、caspase-9、caspase-8和caspase-3等與細(xì)胞凋亡相關(guān)的因子的表達(dá)水平。結(jié)果：RT-PCR和免疫組化結(jié)果顯示，腫瘤組織中STAT3、Survivin的mRNA表達(dá)水平以及STAT3、Bcl-2、Survivin的蛋白表達(dá)水平均高于腫瘤鄰近正常腸組織與遠(yuǎn)端正常腸組織，腫瘤組織中caspase-3、caspase-8和caspase-9的蛋白表達(dá)水平均低于腫瘤鄰近正常腸組織與遠(yuǎn)端正常腸組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。腫瘤鄰近正常腸組織中STAT3的蛋白表達(dá)水平和Bcl-2的mRNA表達(dá)水平均高于遠(yuǎn)端正常腸組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其他基因在腫瘤鄰近正常腸組織與遠(yuǎn)端正常腸組織中的表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。腫瘤鄰近正常腸組織與腫瘤組織中Bcl-2的表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：人大腸癌移植瘤組織中的細(xì)胞凋亡情況明顯異于正常組織。腫瘤鄰近正常腸組織中STAT3和Bcl-2的表達(dá)水平高于遠(yuǎn)端正常腸組織，這可能是引起腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的原因之一，尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。

關(guān)鍵詞大腸癌；細(xì)胞凋亡；信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子與激活子3；Bcl-2

細(xì)胞凋亡對(duì)維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定及維持正常細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)至關(guān)重要[1]。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中, 細(xì)胞凋亡也扮演了重要角色[2]。目前已發(fā)現(xiàn)，大腸癌的發(fā)生發(fā)展與多種凋亡相關(guān)因子有密切關(guān)系，這些因子既可能獨(dú)立發(fā)揮作用，也可能通過(guò)相互影響，最終形成影響細(xì)胞凋亡的網(wǎng)絡(luò)[3-4]。本研究通過(guò)構(gòu)建人大腸癌移植瘤裸小鼠模型，觀察腫瘤組織、腫瘤鄰近正常腸組織和遠(yuǎn)端正常腸組織中細(xì)胞凋亡因子的表達(dá)情況。

1資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物BALB/C裸小鼠13只，SPF級(jí)，4~6周齡，體質(zhì)量18~20 g，由中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，在上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室(許可證號(hào)：SYXK[滬]2004-2005)按SPF級(jí)要求飼養(yǎng)，自由飲食。

1.2造模方法

1.2.1裸小鼠原位移植瘤塊的制備取BALB/C裸小鼠1只，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大腸癌HT-29細(xì)胞(由上海市腫瘤研究所提供)制備成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度至8×107/mL，用一次性無(wú)菌注射器在裸小鼠右側(cè)腋下行皮下注射，每只裸小鼠劑量為0.1 mL。連續(xù)觀察4周，當(dāng)皮下瘤直徑達(dá)1 cm時(shí)處死裸小鼠，切下瘤塊，去除壞死部分，切取淡黃色或呈魚肉狀的瘤組織并置于0.9%氯化鈉液中，剪成直徑2 mm的瘤塊備用。

1.2.2裸小鼠原位移植瘤模型的制作12只裸小鼠術(shù)前禁食12 h，腹腔內(nèi)注射氯胺酮麻醉，仰臥固定，選擇下腹正中切口，打開腹腔，找到盲腸，在距離盲腸末端1 cm處腸系膜側(cè)的漿膜面用手術(shù)刀輕輕刮傷漿膜層，然后用8-0無(wú)損傷尼龍線和圓針將已制備好的新鮮瘤塊行“8”字全層透壁包埋縫合在損傷處，再用無(wú)損傷縫線全層縫合，術(shù)畢觀察至無(wú)活動(dòng)性出血后關(guān)腹。術(shù)后暫時(shí)分籠飼養(yǎng)所有裸小鼠，至完全清醒。整個(gè)手術(shù)過(guò)程在切除皮下瘤后1 h內(nèi)完成。

1.3標(biāo)本處理所有裸小鼠均于接種后8周處死。處死后立即打開腹腔，切取腫瘤組織，并取腫瘤鄰近(距腫瘤切緣1 cm)正常腸組織和遠(yuǎn)端(距腫瘤切緣>3 cm)正常腸組織。各取小塊組織立刻保存于-80℃液氮；其余經(jīng)10%福爾馬林溶液固定，送病理檢查。

1.4指標(biāo)檢測(cè)

1.4.1免疫組化檢測(cè)采用免疫組化法檢測(cè)STAT3、Bcl-2、Survivin、caspase-3、caspase-8和caspase-9的表達(dá)情況，試劑由美國(guó)Santa Cruz公司提供，檢測(cè)方法詳見說(shuō)明書。

1.4.2RT-PCR檢測(cè)對(duì)STAT3、Bcl-2和Survivin進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，組織中總RNA的抽提、逆轉(zhuǎn)錄方法參照試劑說(shuō)明書(試劑由上海申能博彩生物技術(shù)有限公司和美國(guó)Invitrogen公司提供)。引物序列見表1，由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。PCR擴(kuò)增條件：50℃ 2 min，95℃ 5 min，95℃ 15 s，60℃ 45 s，40個(gè)循環(huán)。用RT-PCR檢測(cè)儀(美國(guó)ABI公司，型號(hào)ABI-7300)的自帶軟件(ABI Prism 7300 SDS Software)采集和分析數(shù)據(jù)，采用公式2-ΔΔCT計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

表1　凋亡相關(guān)因子的引物序列

2結(jié)果

2.1病理檢查從各裸鼠獲得的瘤塊組織均為低至中度分化腺癌，癌細(xì)胞異型性明顯，多呈實(shí)體狀排列，部分呈腺樣排列，腫瘤間質(zhì)少，均有不同程度的腫瘤組織壞死和炎細(xì)胞浸潤(rùn)。對(duì)鄰近正常腸組織和遠(yuǎn)端正常腸組織的病理檢查均未發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞。

2.2各細(xì)胞凋亡相關(guān)因子轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)情況腫瘤組織和腫瘤鄰近正常腸組織中Bcl-2 的mRNA表達(dá)水平高于遠(yuǎn)端正常腸組織(P<0.05)；腫瘤鄰近正常腸組織與腫瘤組織中Bcl-2 的mRNA表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。腫瘤組織中STAT3和Survivin的mRNA表達(dá)水平高于遠(yuǎn)端正常腸組織與腫瘤鄰近正常腸組織(P<0.05)。STAT3和Survivin的的mRNA表達(dá)水平在腫瘤鄰近正常腸組織與遠(yuǎn)端正常腸組織間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

2.3各細(xì)胞凋亡相關(guān)因子蛋白水平的表達(dá)狀況檢測(cè)腫瘤鄰近正常腸組織與遠(yuǎn)端正常腸組織中STAT3、Bcl-2、Survivin的蛋白表達(dá)水平均低于腫瘤組織(P<0.05)。腫瘤鄰近正常腸組織與遠(yuǎn)端正常腸組織中caspase-3、caspase-8和caspase-9的蛋白表達(dá)水平均高于腫瘤組織(P<0.05)。Bcl-2、Survivin、caspase-3、caspase-8和caspase-9的蛋白表達(dá)水平在腫瘤鄰近正常腸組織與遠(yuǎn)端正常腸組織間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。STAT3在腫瘤鄰近正常腸組織中的蛋白表達(dá)水平高于遠(yuǎn)端正常腸組織(P<0.05)。見表3。

表2　各種組織中STAT3、Bcl-2、Survivin的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

注：*與腫瘤組織比較，P<0.05；#與腫瘤鄰近正常腸組織比較，P<0.05

表3　各種組織中凋亡相關(guān)因子的免疫組化檢測(cè)結(jié)果

注：*與腫瘤組織比較，P<0.05；#與腫瘤鄰近正常腸組織比較，P<0.05

3討論

信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子與激活子家族(STAT)是公認(rèn)的癌基因家族，STAT3是STAT家族的重要成員[5]。研究[6-8]證實(shí)，STAT3參與腫瘤細(xì)胞增殖、抗細(xì)胞凋亡和腫瘤血管生成等多種致癌途徑，在多發(fā)性骨髓瘤、腸癌、肺癌以及頭頸部腫瘤等多種腫瘤中均發(fā)現(xiàn)STAT3過(guò)表達(dá)，且其表達(dá)水平與腫瘤的惡性程度及預(yù)后密切相關(guān)。在大腸癌的研究[9]中發(fā)現(xiàn)，STAT3蛋白不僅在腫瘤組織中過(guò)表達(dá)，而且與腫瘤的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移以及Duke’s分期有關(guān)；提示STAT3在大腸癌發(fā)生發(fā)展中有重要作用，阻斷STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能對(duì)治療大腸癌有效。Bcl-2和Survivin均為STAT3下游的因子，兩者均可調(diào)控天冬氨酸特異性蛋白酶(cysteine aspartic acid specific protease，caspase)家族。Survivin可通過(guò)內(nèi)源性及外源性途徑最終作用于caspase家族，抑制細(xì)胞凋亡[10]。研究[11-13]表明，大腸癌中Survivin呈高表達(dá)或過(guò)表達(dá)，且其與大腸癌分期及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)。Bcl-2家族蛋白是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，其表達(dá)的改變不僅影響DNA損傷細(xì)胞或周期異常細(xì)胞的正常凋亡，還影響腫瘤細(xì)胞的凋亡[14]。Bcl-2可通過(guò)阻斷細(xì)胞色素c從線粒體釋放而影響caspase家族，抑制細(xì)胞凋亡。caspase家族結(jié)構(gòu)中含有半胱氨酸，可分為起始caspase和執(zhí)行caspase，其中caspase-8和caspase-9參與細(xì)胞凋亡的起始，caspase-7參與細(xì)胞凋亡的執(zhí)行。在凋亡信號(hào)的作用下，細(xì)胞色素c從線粒體釋放出來(lái)，使caspase-9前體轉(zhuǎn)變成caspase-9，后者再激活caspase-3，激活的caspase-3引起DNA斷裂和細(xì)胞骨架成分降解。

在本研究中，我們通過(guò)RT-PCR和免疫組化分析了人大腸癌移植瘤裸小鼠的腫瘤組織、腫瘤近端正常腸組織以及遠(yuǎn)端正常腸組織中的細(xì)胞凋亡相關(guān)因子(STAT3、Bcl-2、Survivin、caspase-3、caspase-8和caspase-9)的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，幾乎上述所有的細(xì)胞凋亡相關(guān)因子在腫瘤組織中都有異常表達(dá)，顯示為STAT3、Bcl-2和Survivin的高表達(dá)以及caspase-3、caspase-8和caspase-9的低表達(dá)。STAT3和Bcl-2在腫瘤鄰近組織中的表達(dá)高于遠(yuǎn)端正常腸組織。STAT3和Bcl-2是細(xì)胞凋亡相關(guān)因子中較為上游的因子。本研究發(fā)現(xiàn)，即使腫瘤鄰近組織的病理學(xué)檢查結(jié)果正常，其也可能有較早期的細(xì)胞凋亡異常，這是值得關(guān)注的。此外，研究[15]顯示，STAT3等因子也與腫瘤血管生成相關(guān)，在大腸癌中STAT3表達(dá)與血管表皮生長(zhǎng)因子(VEGF)表達(dá)均升高，并呈正相關(guān)；我們以往的研究也顯示，腫瘤鄰近正常腸組織的血管生成異常活躍，表現(xiàn)為VEGF、環(huán)氧化酶-2(COX-2)高表達(dá)和微血管密度增高[16]。結(jié)合以往的研究結(jié)果，腫瘤鄰近正常腸組織可能存在細(xì)胞凋亡和腫瘤血管生成的異常表現(xiàn)，這些因素可能與大腸癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移相關(guān)。

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The Differences Regarding Expression of Apoptosis Related Factors among Different Tissues of Nude Mice with Transplanted Human Colorectal Cancer

ZHUYan1LIUJing2FANJiawei2LVXiang21.ShuguangHospitalAffiliatedtoShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai200021,China; 2.MunicipalHospitalofTraditionalChineseMedicineAffiliatedtoShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai200071,China

AbstractObjective：To investigate the differences regarding expression of apoptosis related factors among tumor tissue, adjacent normal bowel tissue, and distal normal bowel tissue of nude mice with transplanted human colorectal cancer. Methods:Orthotopic tumor models of transplanted human colorectal cancer were established in 12 BALB/C nude mice, and the mice were killed eight weeks after transplantation. The expression levels of apoptosis related factors such as signal transducer and activator of transcription 3(STAT3), Bcl-2, Survivin, caspase-9, caspase-8 and caspase-3, in tumor tissues, adjacent (1 cm distance from tumor tissue) normal bowel tissues, and distal (>5 cm distance from tumor tissue) normal bowel tissues, were assessed by RT-PCR and immunohistochemistry assay. Results: The mRNA expression of STAT3 and Survivin, as well as the protein expression of STAT3, Bcl-2 and Survivin in tumor tissue were higher than those in adjacent normal bowel tissue and distal normal bowel tissue, as results of RT-PCR and immunohistochemistry assay showed, while the protein expression of caspase-8, caspase-9 and caspase-3 in tumor tissue were lower than those in adjacent normal bowel tissue and distal normal bowel tissue. And all the differences were statistically significant(allP<0.05). The protein expression of STAT3 and the mRNA expression of Bcl-2 in adjacent normal bowel tissue were higher than those in distal normal bowel tissue. Both the differences were statistically significant(bothP<0.05). The other genes showed no statistically significant difference between adjacent normal bowel tissue and distal normal bowel tissue regarding expression level. There was no statistically significant difference regarding Bcl-2 expression between tumor tissue and adjacent normal bowel tissue. Conclusions: The apoptosis status in tissue of transplanted human colorectal cancer was significantly different from that in normal tissue. The expression levels of STAT3 and Bcl-2 in adjacent normal bowel tissue were higher than those in distal normal bowel tissue. This may be one of the reasons for tumor recurrence and metastasis. However, further researches are needed for confirmation.

Key WordsColorectal cancer;Apoptosis;Signal transducer and activator of transcription 3;Bcl-2

通訊作者劉靜，E-mail：wildroselj@hotmail.com

基金項(xiàng)目：上海市中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)科研基金項(xiàng)目(編號(hào)：zxyQ-1226)；上海市自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：08ZR1419300)；上海市教委科研創(chuàng)新項(xiàng)目(編號(hào)：08YZ59)

中圖分類號(hào)R 735.3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A