彭榮　費鳳英　張斌

(復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院青浦分院　a檢驗科，b感染科，上海　201700)

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·論著·

上海青浦地區(qū)結(jié)核分枝桿菌基因分型及其人群分布特點

彭榮a費鳳英a張斌b

(復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院青浦分院a檢驗科，b感染科，上海201700)

摘要目的：探討上海市青浦區(qū)結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，M.tb)的主要分型及其人群分布特點。方法： 收集2011年12月—2013年12月上海中山醫(yī)院青浦分院分離培養(yǎng)的266株M.tb，分別提取M.tb基因組，應(yīng)用多重PCR法鑒定北京基因型和非北京基因型，并分析兩種分型在本地區(qū)不同性別、年齡及戶籍患者中的分布差異。結(jié)果：266株M.tb中，北京基因型菌株242株(90.98%)，非北京基因型24株(9.02%)，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=357.32，P<0.01)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，北京基因型菌株與非北京基因型菌株在不同性別(χ2=0.071，P>0.05)、不同年齡(χ2=0.152，P>0.05)及不同戶籍(χ2=0.053，P>0.05)的人群分布的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論：北京基因型菌株可能是上海市青浦區(qū)M.tb的主要流行株，但其分布與性別、年齡及戶籍的關(guān)系不明顯。

關(guān)鍵詞結(jié)核分枝桿菌；基因分型；北京基因型；人群分布

上世紀(jì)末，隨著基因研究的深入，人們對結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，M.tb)有了較深的認(rèn)識。1995年Van Soolingen等[1]在中國及周邊國家發(fā)現(xiàn)了M.tb北京基因型家族，該家族具有相同的IS6110基因標(biāo)記特征。目前，北京基因型M.tb已在全球傳播，有研究[2]表明其分布約占全球已分離M.tb菌株的13%。北京基因型M.tb作為世界范圍內(nèi)的第二大流行結(jié)核桿菌，具有毒力高、傳播能力強、易突變等特點，能夠逃脫卡介苗的免疫保護(hù)，并易產(chǎn)生耐藥甚至耐多藥 (multidrug-resistant，MDR)[3]。國內(nèi)有學(xué)者分別研究了天津[4]、浙江[5]等區(qū)域M.tb的基因分型，結(jié)果表明北京基因型菌株在這些區(qū)域占主導(dǎo)地位，但流行特征不盡相同。為進(jìn)一步做好上海市青浦區(qū)的結(jié)核防治工作，本研究分析了2011年12月—2013年12月復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院青浦分院分離培養(yǎng)的266株M.tb的基因分型，并比較了不同基因型的性別、年齡及戶籍分布差異。

1資料與方法

1.1菌株來源從復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院青浦分院(該院是上海市青浦區(qū)唯一的結(jié)核病定點醫(yī)院，收治了該地區(qū)大多數(shù)的肺結(jié)核病患者) 2011年12月—2013年12月收治的肺結(jié)核患者(排除非M.tb感染者及攜帶多菌種的患者)痰標(biāo)本中初次分離出培養(yǎng)的266株M.tb，并收集菌株對應(yīng)患者的性別、年齡以及戶籍信息。H37Rv標(biāo)準(zhǔn)菌株由同濟(jì)大學(xué)附屬上海市肺科醫(yī)院檢驗科惠贈。

1.2主要試劑與儀器羅氏培養(yǎng)基購自上海疾控生物科技有限公司；PCR儀、電泳儀及電泳槽購自美國Bio-Rad公司；快速細(xì)菌基因提取試劑盒購自廣州東盛生物科技有限公司；引物及Marker由上海劍鈍生物科技有限公司合成。

1.3方法

1.3.1基因組提取將菌株轉(zhuǎn)種于中性羅氏培養(yǎng)基，37℃孵育4周，待長出后，取菌落，用500 μL含有吐溫-80的磷酸鹽溶液(PBS，pH7.8)充分分散，經(jīng)80℃水浴2 h滅活后，用快速細(xì)菌基因提取試劑盒(Cat:N1152)提取基因組。

1.3.2基因型的鑒定采用經(jīng)改進(jìn)的多重PCR方法及瓊脂糖凝膠電泳[6-7]鑒定北京及非北京基因型M.tb。北京基因型菌株上游引物為5′-ACAGGAAGCCGAATGAGGAC-3′，下游引物為5′-CGAAGGAGACCTCGTAGACAAG-3′ (GenBank AF390039)；非北京型基因型菌株上游引物為5′-TGGGTCTGACGACTTGAACAC-3′，下游引物為5′-ACCTTCAGCACCACCATCATC -3′ (GenBank BX842581)。北京基因型和非北京型基因型的目的擴(kuò)增片段長度分別為261 bp和491 bp。PCR體系的建立：采用15μL體系，引物終濃度為0.2 μmol/L，DNA模板為10～20 ng，2×Master Mix 7.5 μL。PCR反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)；72℃延伸5 min。多重PCR方法的建立[6]：將H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株、已確定的北京型基因M.tb和本研究臨床分離的菌株基因組作為模板，用北京及非北京基因型混合引物進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增。每次試驗均設(shè)置無模板對照組。瓊脂糖凝膠電泳：PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠(含4 μL/80 mL的溴化乙錠DNA染料)恒電壓(5V/1cm)電泳，將100 bp DNA leader 作為分子量標(biāo)志物。應(yīng)用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)分析目的基因片段。

1.3.3統(tǒng)計學(xué)處理所有數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 17.0軟件統(tǒng)計分析。計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1基因型鑒定266株M.tb中，北京基因型242株(90.98%)，非北京基因型24株(9.02%)，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=357.32，P<0.01)。見圖1。

圖1　多重PCR鑒定M.tb的瓊脂糖電泳結(jié)果

M：DNA標(biāo)志物；1：H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株擴(kuò)增條帶491 bp；2：已知北京基因型菌株擴(kuò)增條帶約261 bp； 3~24泳道為臨床分離株擴(kuò)增條帶(3，6，9，12，13，14，18泳道為非北京基因型菌株；4，5，7，8，10，11，15~17，19~24泳道為北京基因型菌株)。

2.2兩種基因型M.tb的性別、年齡、戶籍分布266株M.tb中，北京基因型和非北京基因型M.tb在不同性別(χ2=0.071，P>0.05)、不同年齡(χ2=0.152，P>0.05)及不同戶籍(χ2=0.053，P>0.05)人群中的分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

表1　上海市青浦區(qū)兩種基因型M.tb人群分布的基本特征(n,%)

3討論

本研究根據(jù)北京基因型菌株基因組中Rv2816和Rv2819序列缺失的特點，采用改進(jìn)的多重PCR反應(yīng)鑒定了北京基因型和非北京基因型M.tb，該方法與間隔區(qū)寡聚核苷酸分型法(spoligotyping)的鑒定結(jié)果一致率為100%[6-7]，而且較spoligotyping分型法簡單易行、經(jīng)濟(jì)實用，因而值得在臨床推廣應(yīng)用。

盡管國內(nèi)北京基因型M.tb流行已近半個世紀(jì)，但對其流行病學(xué)特點還不十分清楚。北京基因型M.tb在世界各地均有發(fā)現(xiàn)，但有明顯的地域差異，其中在亞洲達(dá)50%左右，而在中國比例更高，達(dá)86%[1]。本研究對上海市青浦地區(qū)266株M.tb進(jìn)行了基因分型，發(fā)現(xiàn)北京基因型菌株242株(242/266，90.98%)，非北京基因型24株(24/266，9.02%)，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=357.32，P<0.01)，表明北京基因型菌株可能是上海市青浦區(qū)M.tb的主要流行株。

目前，許多學(xué)者對不同地區(qū)M.tb不同基因型在人群中的分布特點進(jìn)行了研究。其中有學(xué)者[8]對新疆地區(qū)M.tb不同基因型的分布進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)北京基因型占43.7%，在維吾爾族和漢族病例中分別占39.5%和72.4%，有明顯的種族差異。也有學(xué)者[4]對天津地區(qū)的M.tb進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)北京基因型和非北京基因型M.tb的性別、年齡分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但戶籍差異有統(tǒng)計學(xué)意義。本研究顯示，北京基因型菌株與非北京基因型菌株在不同性別(χ2=0.071，P>0.05)、不同年齡(χ2=0.152，P>0.05)及不同戶籍(χ2=0.053，P>0.05)人群中的分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義。分析認(rèn)為，北京基因型M.tb的分布在不同區(qū)域及不同人群的研究結(jié)果不盡相同，可能是由于其本身亦存在亞型有關(guān)，因此有必要對其亞型分布規(guī)律做深入研究。

參考文獻(xiàn)

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The Genotyping of Mycobacterium Tuberculosis and Its Characteristics of Population Distribution in Qingpu District of Shanghai City

PENGRongaFEIFengyinaZHANGBinbaLaboratoryDepartment,bInfectionsDepartment,QingpuBranchofZhongshanHospital,FudanUniversity,Shanghai201700,China

AbstractObjective：To explore the predominant genotyping ofMycobacteriumtuberculosis(M.tb)and its population distribution in Qingpu District of Shanghai City. Methods:A total of 266 M.tb isolates were collected from Qingpu Branch of Zhongshan Hospital from December 2011 to December 2013, of which the genomes were extracted. Bejing genotype and non-Bejing genotype were identified by multiplex polymerase chain reaction(PCR), and the differences regarding distributions in gender, age, and domicile population between the two genotypes were analyzed. Results: Among the 266 M.tb isolates, there were 242 strains(90.98%) of Bejing genotype and 24 strains(9.02%) of non- Bejing genotype，and the difference was statistically significant (χ2=357.32，P<0.01). But there was no significant difference between Bejing genotype and non-Bejing genotype regarding population distribution in different gender (χ2=0.071，P>0.05)， age(χ2=0.152，P>0.05)and domicile (χ2=0.053，P>0.05). Conclusions: The main popular strain of M.tb in Qingpu District of Shanghai City may be Bejing genotype, but its distribution was not significantly related with gender, age and domicile.

Key WordsMycobacteriumtuberculosis;Genotyping;Beijing genotype;Population distribution

通訊作者張斌，Email：zhxy2010@163.com

基金項目：復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院青浦分院課題(編號：2013K05)

中圖分類號R 378.91+1

文獻(xiàn)標(biāo)識碼A