劉曉麗　李　維　孟　夏　張玉萍

明宗娟　史紅陽　石　婕　鐘玉潔

王　薇　楊拴盈

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·論著·

鹽酸?？颂婺釋θ朔蜗侔┘?xì)胞系PC-9作用的比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究

劉曉麗李維孟夏張玉萍

明宗娟史紅陽石婕鐘玉潔

王薇楊拴盈

【摘要】目的應(yīng)用比較蛋白質(zhì)組學(xué)方法分析鹽酸埃克替尼作用前后人肺腺癌細(xì)胞系PC-9細(xì)胞相關(guān)蛋白的變化，從蛋白質(zhì)水平探討埃克替尼的作用機(jī)制。方法應(yīng)用人類EGFR基因突變檢測試劑盒和實(shí)時(shí)定量PCR儀檢測PC-9細(xì)胞EGFR突變；應(yīng)用MTT法檢測埃克替尼對PC-9細(xì)胞增殖的影響；應(yīng)用雙向凝膠電泳(2-DE)技術(shù)分別對未經(jīng)干預(yù)的PC-9細(xì)胞總蛋白和經(jīng)?？颂婺嶙饔玫腜C-9細(xì)胞總蛋白進(jìn)行分離，獲得蛋白質(zhì)表達(dá)譜；應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)結(jié)合生物信息學(xué)進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定。結(jié)果PC-9細(xì)胞的EGFR基因存在第19外顯子缺失突變；在10-4-10-9M濃度范圍內(nèi)，?？颂婺崦黠@抑制PC-9細(xì)胞的生長，且呈濃度依賴；?？颂婺嵴T導(dǎo)前后表達(dá)水平≥1.5倍的蛋白點(diǎn)共有56個(gè)。選取差異≥1.7倍的29個(gè)蛋白點(diǎn)進(jìn)行MALDI-TOF-MS分析，最終鑒定出16種蛋白質(zhì)。根據(jù)功能，這些蛋白可分為代謝酶類、細(xì)胞骨架類、分子伴侶、信號傳導(dǎo)分子、轉(zhuǎn)錄及翻譯相關(guān)蛋白。結(jié)論應(yīng)用比較蛋白質(zhì)組學(xué)方法初步鑒定了16種蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)與埃克替尼作用機(jī)制密切相關(guān)，部分可能成為新的分子治療靶點(diǎn)。

【關(guān)鍵詞】PC-9細(xì)胞；?？颂婺?；比較蛋白質(zhì)組學(xué)；生物信息學(xué)

肺癌是目前發(fā)病率及病死率最高的惡性腫瘤[1-2]。非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)約占肺癌發(fā)病總數(shù)的80%以上。其5年生存率僅15%。對于早期NSCLC，目前首選手術(shù)治療，晚期NSCLC的治療是以化療為主的綜合治療。然而傳統(tǒng)的化療和放療雖然可暫時(shí)緩解癥狀，使腫瘤縮小，但并不能有效提高生存期，且常因放化療的毒副反應(yīng)，使患者無法耐受治療。表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor receptor tyrosine inhibitor, EGFR-TKI)是目前抗癌藥研究中最受矚目的領(lǐng)域[3]。埃克替尼是一種小分子EGFR-TKI，由浙江貝達(dá)藥業(yè)有限公司自主研發(fā)。對于EGFR基因突變的患者，鹽酸?？颂婺峋哂忻黠@的抗腫瘤作用[4]。目前針對該藥作用機(jī)制的研究多集中在PI3K/AKT、Ras/Raf/MEK/MAPK、JAK/STAT3信號通路，其它作用機(jī)制尚不明確。比較蛋白質(zhì)組學(xué)是蛋白質(zhì)組學(xué)的重要組成部分，它不僅在探討發(fā)病機(jī)制、早期診斷等方面發(fā)揮巨大的作用，而且可以通過研究藥物處理前后蛋白的差異變化，深入探討藥物作用機(jī)制，并發(fā)現(xiàn)新的、潛在的藥物作用靶點(diǎn)。本研究通過比較蛋白質(zhì)組學(xué)方法觀察?？颂婺嶙饔们昂笙嚓P(guān)蛋白變化，以期從蛋白質(zhì)水平探討埃克替尼作用機(jī)制，并為開發(fā)新靶向治療藥物的提供理論依據(jù)。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

1. 細(xì)胞： 人肺腺癌細(xì)胞系PC-9細(xì)胞購自上海復(fù)祥生物科技有限公司，用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

2. 主要儀器： 細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；超凈工作臺(天津泰斯特儀器有限公司)；倒置顯微鏡(日本Nikon公司)；超聲細(xì)胞破碎儀(浙江新芝生物科技有限公司)；PowerWave XS 酶標(biāo)儀(Bio-tek公司)；ABl7500實(shí)時(shí)定量PCR儀(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)：Ettan IPGphor Isoelectric Focusing System(GE Amersham公司)；光密度掃描儀GS-710(美國Bio-Rad公司)；凝膠圖像分析軟件Image Master(GE Amersham公司)；4800 MALDI-TOF質(zhì)譜儀(AB SCIEX)；UMax Powerlook 2100XL掃描儀(GE Amersham公司)；Hofer SE 600(GE Amersham)。

3. 試劑： 鹽酸?？颂婺嵊烧憬∝愡_(dá)藥業(yè)有限公司饋贈；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶溶液均購自美國Hyclone公司；MTT、DMSO均購自美國Sigma公司；Amoy Dx試劑盒購自廈門艾德生物醫(yī)藥科技有限公司；DNA提取試劑盒購自日本Takara公司；PH3-10非線性膠條、PH3-10L IPG Buffer均購自美國Pharmacia公司；考馬斯亮藍(lán)G-250/R-350、Urea、CHAPS、DTT、IAA、Tris均購自美國GE Amersham公司；Bradford蛋白定量試劑盒、SDS、APS、TEMED、甘氨酸、甘油均購自美國Bio-Rad公司；Cocktail酶抑制劑購自美國Roche公司；氯化鈉、氯化鉀、十二水合磷酸氫二鈉、磷酸氫二鉀、乙醇、乙酸、戊二醛、甲醛、檸檬酸均為國產(chǎn)分析純試劑。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1. 細(xì)胞EGFR基因突變檢測: 將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，胰酶消化，離心重懸后提取DNA，所有步驟按培養(yǎng)貼壁細(xì)胞DNA提取操作說明；利用人類EGFR基因突變檢測試劑盒(Amoy Dx)和實(shí)時(shí)定量PCR儀檢測突變基因。

2. 細(xì)胞增殖抑制率測定: 取生長狀態(tài)穩(wěn)定、對數(shù)生長期的細(xì)胞，接種至96孔板中，使每孔細(xì)胞數(shù)為5 000個(gè)左右。過夜細(xì)胞貼壁后，更換培養(yǎng)液，加入鹽酸埃克替尼，使各標(biāo)記孔內(nèi)藥物濃度分別為100 μmol/L、10 μmol/L、1 μmol/L、0.1 μmol/L、0.01 μmol/L、0.001 μmol/L，每個(gè)濃度組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，對照組加入等量培養(yǎng)液。繼續(xù)孵育72 h，每孔加5 mg/ml的MTT溶液20 μl，孵育4 h棄上清，每孔加入二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO) 150 μl，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解；將培養(yǎng)板放入酶聯(lián)免疫檢測儀，測量并記錄各孔的光吸收值。癌細(xì)胞存活率由下式計(jì)算:細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組光吸收值/對照組光吸收值)×100%，通過SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件，將實(shí)驗(yàn)組與對照組作t檢驗(yàn)。確定?？颂婺嶙饔肞C-9細(xì)胞72 h的半抑制濃度(IC50)；以抑制率為縱坐標(biāo)、藥物濃度為橫坐標(biāo)繪制曲線圖。

3. 細(xì)胞總蛋白的提取: PC-9細(xì)胞生長至對數(shù)生長期后，更換培養(yǎng)基，使實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞暴露于IC50的?？颂婺嶂?，繼續(xù)孵育72 h。吸出兩組細(xì)胞的培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS緩沖液清洗三遍，將PBS吸除干凈，加入250 μl細(xì)胞裂解液，每10 min充分混勻一次，于冰上裂解細(xì)胞1 h，用刮刀收集細(xì)胞。冰浴超聲裂解(80 w，5次，每次10 s，間隔15 s，冰上完成)，超聲后離心(12 000×g、45 min)，4 ℃，取上清；Bradford法蛋白定量，分裝，-80 ℃冰箱保存。

4. 2-DE: 將樣品100 μg與重泡漲液充分混合，低速離心后，加入持膠槽，將IPG干膠條(PH3-10L，13 cm)去保護(hù)膜，膠面朝下從一端放入持膠槽中，使重泡漲液浸潤整個(gè)膠條，用礦物油覆蓋，操作過程中注意不要產(chǎn)生氣泡；水化和等電聚焦在20 ℃自動進(jìn)行，設(shè)置參數(shù)如下：30 v 12 hrs，500 v 1 hrs，1 000 v 1 hrs，8 000 v 8hrs，500v 4hrs；將膠條進(jìn)行兩步平衡后，移至12.5%分離膠的上端，進(jìn)行十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gelelectrophoresis, SDS-PAGE)。電泳完成后，按蛋白質(zhì)銀染試劑盒的操作手冊進(jìn)行銀染。

5. 凝膠圖像分析: 兩組樣品常規(guī)各跑3次雙向凝膠電泳，GS-710光密度掃描儀對染色后的膠圖進(jìn)行掃描，通過Image-Master軟件對兩組圖像進(jìn)行背景消減、蛋白點(diǎn)檢測、匹配、量化及數(shù)據(jù)分析。應(yīng)用SPSS12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用t檢驗(yàn)。選取差異1.7倍以上的蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析。

6. 質(zhì)譜分析： 將銀染蛋白點(diǎn)進(jìn)行膠內(nèi)酶切，脫色，還原，烷基化，酶解，萃取，凍干。將制備好的樣品用串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(4 800 Plus MALDI TOF/TOFTM Analyzer)進(jìn)行測試分析，激光源波長為355 nm，離子源加速電壓為2 kV，采用正離子模式和自動獲取數(shù)據(jù)的模式采集數(shù)據(jù)，MS掃描范圍為800～4 000 Da，選擇信噪比大于50的母離子進(jìn)行MS/MS分析，每個(gè)樣品點(diǎn)上選擇8個(gè)母離子，二級質(zhì)譜(MS/MS)累計(jì)疊加2 500次，碰撞能量2 kV，CID關(guān)閉；質(zhì)譜測試原始文件用Mascot2.2軟件檢索相應(yīng)數(shù)據(jù)庫，最后得到鑒定的蛋白質(zhì)結(jié)果。

7. 生物信息學(xué)分析： 利用NCBI數(shù)據(jù)庫對差異表達(dá)明顯且與腫瘤密切相關(guān)蛋白進(jìn)行mRNA、蛋白質(zhì)序列進(jìn)行檢索，在此基礎(chǔ)上利用ProtParam、SOPMA、TMpred、PSORT、SWISS-MODEL、SMART、STRING、KEGG等工具對它們的理化性質(zhì)、二級結(jié)構(gòu)、跨膜結(jié)構(gòu)域、亞細(xì)胞定位、三維結(jié)構(gòu)、功能結(jié)構(gòu)域、蛋白相互作用、信號通路等進(jìn)行初步分析。

結(jié)果

一、EGFR基因表達(dá)情況

采用ADx-ARMS法對人肺腺癌細(xì)胞系PC-9細(xì)胞的EGFR基因18、19、20、21外顯子進(jìn)行突變檢測。結(jié)果顯示PC-9細(xì)胞的EGFR基因存在第19外現(xiàn)在缺失突變。

二、細(xì)胞增殖抑制率

藥物干預(yù)72 h后通過倒置顯微鏡可觀察到貼壁細(xì)胞生長速度減慢，形態(tài)改變，出現(xiàn)細(xì)小顆粒，并可見細(xì)胞碎片。不同濃度埃克替尼作用于PC-9細(xì)胞72 h后，MTT法檢測細(xì)胞OD值并計(jì)算抑制率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在10-4-10-9M濃度范圍內(nèi)，?？颂婺崦黠@抑制PC-9細(xì)胞的生長，且呈濃度依賴性，72 h IC50約為80 nmol/L，見圖1。

圖1　不同濃度?？颂婺釋C-9細(xì)胞生長的影響

三、2-DE凝膠圖譜

每組蛋白常規(guī)跑3次電泳，用GS-710光密度掃描儀對膠圖進(jìn)行掃描，采用Image-master軟件進(jìn)行分析，結(jié)果顯示對照組3塊膠的平均蛋白斑點(diǎn)數(shù)為1 410±52，平均匹配率為63.45%；實(shí)驗(yàn)組的平均蛋白斑點(diǎn)數(shù)為1 480±52，平均匹配率為66.61%。對照組和實(shí)驗(yàn)組間蛋白差異≥1.5倍的點(diǎn)共有56個(gè)。圖2為對照組和實(shí)驗(yàn)組間蛋白差異點(diǎn)。

圖2　對照組和實(shí)驗(yàn)組間蛋白差異點(diǎn)凝膠圖譜

四、質(zhì)譜分析結(jié)果

選取差異≥1.7倍的29個(gè)蛋白點(diǎn)進(jìn)行MALDI-TOF-MS分析，最終成功獲得16種蛋白的PMF，其中?？颂婺岣深A(yù)后下調(diào)的蛋白有13種，分別為細(xì)胞角蛋白9(cytokeratin9, CK9)、吡咯琳-5-羧酸還原酶(pyrroline-5-carboxylate reductase, PYCR)、ran特異性GTP酶活化蛋白(ran-specific GTPase-activating protein, RANBP1)、腫瘤蛋白18(stathmin1/oncoprotein18, STMN1)、NEM1-NEM2 蛋白、rasGTP酶激活蛋白結(jié)合蛋白1(ras GTPase-activating protein-binding protein1, G3BP1)、泛素結(jié)合酶E2D3(ubiquitin-conjugating enzyme E2D3, UBE2D3)、微管蛋白α-1A鏈亞型2(tubulin alpha-1A chain isoform2, TUBA1A isoform2)、 視黃醇脫氫酶(retinol dehydrogenase, RDH)、熱休克蛋白40(DnaJ homolog, subfamily B, member1, DNAJB1)、不均一核糖核蛋白A/B(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A/B, hnRNPA/B)、電壓依賴性陰離子選擇性通道蛋白1(voltage-dependent anion-selective channel protein1, VDAC1)、真核翻譯起始因子3亞組1(eukaryotic translation initiation factor 3 subunit1, EIF31)；加藥后上調(diào)的蛋白點(diǎn)有3種：層黏連蛋白結(jié)合蛋白(laminin-binding protein, RPSA)、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase, G6PD)、果糖-1,6二磷酸酶(fructose-1，6-bisphosphatase, FBPase)，見表1，圖3。

表1　差異表達(dá)蛋白質(zhì)譜分析結(jié)果

圖3　1872點(diǎn)的一級肽質(zhì)量指紋圖譜

五、生物信息學(xué)結(jié)果

查閱相關(guān)文獻(xiàn)，對差異表達(dá)明顯且與腫瘤密切相關(guān)的NME1-NME2、STMN1、G3BP1蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析。NME1-NME2蛋白由267個(gè)氨基酸構(gòu)成，相對分子質(zhì)量約為3 0137.0，理論等電點(diǎn)9.06，是一種可溶性、親水性蛋白質(zhì)；其二級結(jié)構(gòu)主要有α-螺旋(37.83%)和無規(guī)則卷曲(26.97%)；TMpred結(jié)構(gòu)域分析軟件顯示NME1-NME2蛋白有2個(gè)可能的跨膜結(jié)構(gòu)域；SMART數(shù)據(jù)庫搜索結(jié)果提示該蛋白有2個(gè)NDK結(jié)構(gòu)域；亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示NME1-NME2可能存在于細(xì)胞質(zhì)中；圖4為NME1-NME2蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)圖；STRING庫預(yù)測所得與NME1-NME2相互作用蛋白得分高的主要有KCNN4、CCND1、PAPD4、ACLY、MYC、CNOT8、HSP72、NME1、EEF1A1，另外，NME1-NME2可能與STAT3通路有一定的關(guān)聯(lián)(圖5)。

圖4　NME1-NME2蛋白的三維結(jié)構(gòu)圖

圖5　STRING數(shù)據(jù)庫：NME1-NME2相互作用蛋白預(yù)測結(jié)果

STMN1基因有四個(gè)mRNA轉(zhuǎn)錄變本，轉(zhuǎn)錄變本1、2、3翻譯合成同一種蛋白質(zhì)stathmin亞型a，轉(zhuǎn)錄變本4翻譯合成stathmin亞型b；stathmin亞型a由149個(gè)氨基酸組成，相對分子質(zhì)量為17 302.5，理論等電點(diǎn)5.75；stathmin亞型b由174個(gè)氨基酸組成，相對分子質(zhì)量為19 823.5，理論等電點(diǎn)為6.52；兩種蛋白均為可溶性、親水性蛋白；stathmin亞型a二級結(jié)構(gòu)主要有α-螺旋(78.52%)和無規(guī)則卷曲(18.79%)；stathmin亞型b二級結(jié)構(gòu)主要由a螺旋(71.84%)和無規(guī)則卷曲(21.84%)構(gòu)成；TMpred軟件顯示stathmin亞型a多肽鏈可能并不存在跨膜結(jié)構(gòu)域，stathmin亞型b有1個(gè)可能的跨膜結(jié)構(gòu)域； stathmin亞型a和亞型b均含有一個(gè)stathmin結(jié)構(gòu)域；亞細(xì)胞定位顯示STMN1存在于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞骨架中；圖6為STMN1蛋白的三維結(jié)構(gòu)圖；與STMN1蛋白相互作用密切的有AURKB、MAPK3、MAPK13、CDK1、TP53、MAPK1、CAMK2B、CAMK2G、NACA、ADCYAP1，可見其參與MAKP信號通路、細(xì)胞周期調(diào)控，并與TP53密切相關(guān)(圖7)。

圖6　STMN1蛋白的三維結(jié)構(gòu)圖

圖7　STRING數(shù)據(jù)庫：STMN1相互作用蛋白預(yù)測結(jié)果

G3BP1：該蛋白質(zhì)由466個(gè)氨基酸構(gòu)成，相對分子質(zhì)量為52 164.2，理論等電點(diǎn)為5.36；二級結(jié)構(gòu)主要有a-螺旋(23.82%)和無規(guī)則卷曲(55.79%)；沒有跨膜結(jié)構(gòu)域，是親水性、可溶性蛋白；G3BP1蛋白含有NTF2和RRM結(jié)構(gòu)域；G3BP1分布廣范，主要存在于細(xì)胞質(zhì)中；圖8為G3BP1蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)；與G3BP1蛋白相互作用密切的主要有CAPRIN1、USP10、EIF4G1、RASA1、CSK、HDAC6、OGFOD1、PRMT1、STYXL1、ALPP，是ras信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的一個(gè)重要元素(圖9)。

圖8　G3BP1蛋白的三維結(jié)構(gòu)圖

圖9　STRING數(shù)據(jù)庫：G3BP1相互作用蛋白預(yù)測結(jié)果

討論

肺癌的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多基因參與，多分子調(diào)控的復(fù)雜過程，且早期缺乏特異性癥狀，發(fā)病機(jī)制不明，容易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，預(yù)后極差。EGFR-TKI能特異性、競爭性地結(jié)合在EGFR激酶功能區(qū)的ATP結(jié)合位點(diǎn)，抑制其激酶活性從而阻斷癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移等相關(guān)信號傳導(dǎo)通路，已成為肺癌治療研究中的熱點(diǎn)。國外上市的EGFR-TKI包括吉非替尼和厄洛替尼，其主要適應(yīng)癥為二線或三線用于其它抗癌藥物治療失敗的晚期NSCLC患者和用于EGFR基因突變的NSCLC患者的一線治療。鹽酸?？颂婺崾俏覈灾髟O(shè)計(jì)、合成、篩選出的具有自主知識產(chǎn)權(quán)的EGFR-TKI。大量臨床前及臨床數(shù)據(jù)表明?？颂婺崮軌蛎黠@抑制腫瘤細(xì)胞的生長，且毒副作用較易瑞沙、特羅凱明顯減少。

EGFR基因敏感突變是EGFR-TKI分子靶向治療發(fā)揮療效的關(guān)鍵預(yù)測因素。常見敏感突變主要有G719X、Exon19 deletions、L858R、L861Q、S768I突變，耐藥突變包括單獨(dú)的T790M突變和外顯子20插入突變等。人肺腺癌細(xì)胞系PC-9經(jīng)ADx-ARMS法檢測提示存在exon19 deletion突變，其余exon 18(G719X)、exon 20(S768I、Insertion、T790M)、exon 21(L858R、L861Q)突變陰性，是對EGFR-TKI敏感的細(xì)胞系。本研究提示低濃度的鹽酸?？颂婺峋湍苊黠@抑制PC-9細(xì)胞的生長，其72 h IC50為80 nmol/L。既往研究表明吉非替尼72 h IC50接近50 nmol/L[5-6]。由此可見，?？颂婺酙C50較吉非替尼IC50相近，是一種對NSCLC有治療潛力的藥物。

比較蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于腫瘤發(fā)病機(jī)制、早期診斷及治療的各個(gè)方面。目前對鹽酸埃克替尼的研究多集中在PI3K/AKT、Ras/Raf/MEK/MAPK、JAK/STAT3信號通路方面，其它作用機(jī)制尚不明確。PC-9細(xì)胞系存在EGFR酪氨酸激酶區(qū)19外顯子突變(E746-A750缺失)，是目前對EGFR突變與肺癌的分子機(jī)制研究采用的主要細(xì)胞系之一。我們應(yīng)用比較蛋白質(zhì)組學(xué)方法，通過比較埃克替尼作用前后PC-9細(xì)胞蛋白差異表達(dá)的變化，發(fā)現(xiàn)了16種蛋白。根據(jù)功能，這些蛋白可分為代謝酶類、細(xì)胞骨架類、分子伴侶、信號傳導(dǎo)分子、轉(zhuǎn)錄及翻譯相關(guān)蛋白。

細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性和機(jī)械穩(wěn)定性依賴于細(xì)胞骨架蛋白家族的維系。該蛋白家族包括微絲、中間絲及微管蛋白。角蛋白是中間絲家族的主要成員，表達(dá)于正常上皮細(xì)胞、部分非上皮細(xì)胞及上皮源性惡性腫瘤中。CK可分為Ⅰ型CK(酸性細(xì)胞角蛋白，CK9-20)和Ⅱ型(堿性細(xì)胞角蛋白，CK1-8)，其結(jié)構(gòu)由頭、桿、尾三部分組成，桿部位于中間，其始端、末端均為高保守序列。所有上皮細(xì)胞至少表達(dá)一種Ⅰ型和一種Ⅱ型角蛋白單體(CK19例外)，以獨(dú)特的成對方式存在于真核細(xì)胞，并具有組織特異性。在腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移時(shí)，腫瘤細(xì)胞多保留起源細(xì)胞的CK類型，對上皮組織的定性具有獨(dú)特意義。細(xì)胞角蛋白在骨髓、血液及淋巴結(jié)中不表達(dá)，因此，被認(rèn)為是檢測循環(huán)癌細(xì)胞的敏感標(biāo)記物[7]，其中細(xì)胞角蛋白19片段已廣泛應(yīng)用于NSCLC的診斷及預(yù)后判斷。既往研究表明CK7、CK8、CK20、CK18、CK19等與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，而并未發(fā)現(xiàn)CK9與人類惡性腫瘤的特殊關(guān)聯(lián)[8]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)CK9在?？颂婺崽幚砗蟮娜朔蜗侔┘?xì)胞系PC-9中表達(dá)呈下調(diào)狀態(tài)。另外，F(xiàn)u等[9]應(yīng)用差異蛋白質(zhì)組學(xué)方法進(jìn)行肝癌患者血清篩查時(shí)發(fā)現(xiàn)CK9在肝內(nèi)轉(zhuǎn)移的肝癌組血清CK9的表達(dá)水平也是上調(diào)的，提示CK9可能參與了?？颂婺嵋种颇[瘤細(xì)胞生長的過程。

自從1920年Warburg[10]發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞即使在正常的氧氣供應(yīng)情況下，糖酵解依然增加并伴隨大量乳酸生成，線粒體呼吸大幅減少這一現(xiàn)象后，人們普遍意識到代謝途經(jīng)改變是細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化必不可少的因素之一。研究證實(shí)脯氨酸代謝與血脯氨酸過多癥、精神分裂癥、皮膚松弛癥及腫瘤有密切聯(lián)系。在后者中，腫瘤細(xì)胞傾向于依賴脯氨酸的生物合成，其主要合成途經(jīng)有兩條：一條途徑為以谷氨酸為底物合成脯氨酸，另一條途徑為以鳥氨酸為底物合成脯氨酸。谷氨酸在吡咯琳合成酶作用下生成吡咯琳-5-羧酸，然后在PYCR作用下還原為脯氨酸。鳥氨酸在鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ornithine aminotransferase, OAT)、PYCR作用下還原為脯氨酸。人類PYCR有三種同工酶：PYCR1位于染色體17q25.3；PYCR2定位于1q42.12；PYCRL基因定位于8q24.3。目前已證實(shí)PYCR在原發(fā)性及轉(zhuǎn)移性肺腫瘤中明顯升高[11]，PYCR1參與乳腺腫瘤的發(fā)生，而對PYCR2、PYCRL的研究較少[12]。De Ingeniis等[13]通過13C同位素標(biāo)記對黑素瘤細(xì)胞進(jìn)行觀察，首次提出PYCR1、PYCR2主要存在于線粒體中，介導(dǎo)谷氨酸轉(zhuǎn)化為脯氨酸，而PYCRL存在于胞質(zhì)中，參與鳥氨酸轉(zhuǎn)化為脯氨酸的過程。

G蛋白作為一種信號蛋白，實(shí)質(zhì)是一種GTP水解酶，可根據(jù)其為單體還是多聚體分為異三聚體G蛋白和小G蛋白[14]。異三聚體G蛋白由α、β、γ亞基組成，β、γ亞基以二聚體形式錨鏈于細(xì)胞質(zhì)膜上，其可結(jié)合或解離α亞基。當(dāng)α亞基結(jié)合GTP后，其構(gòu)象發(fā)生改變，從二聚體上解離下來，與下游效應(yīng)分子結(jié)合，從而控制相關(guān)信號通路。真核生物的小G蛋白是單體蛋白分子，又可以分為5個(gè)家族：Ras、Rab，Rho，Arf和Ran。Ran是小G蛋白的一個(gè)亞族，具有GTP水解酶活性，分子量約為(20～30)×103，與其它小G蛋白一樣，在信號傳導(dǎo)通路中起“分子開關(guān)”的作用。Ran蛋白活性主要受Ran鳥苷酸交換因子(Ran guanine exchang factor, RanGEF)RCC1、Ran結(jié)合蛋白(Ran binding proteins, RanBPs)、RanGTPase激活蛋白(RanGTPase activator protein, RanGAP)調(diào)控。RANBP1位于細(xì)胞質(zhì)中，它可以抑制RCC1活性，間接促進(jìn)RanGTP水解為RanGDP的過程，在細(xì)胞的核質(zhì)運(yùn)輸、紡錘體組裝、細(xì)胞周期、控制有絲分裂和有絲分裂后的核重組中有一定的調(diào)節(jié)作用[15]。

抑微管裝配蛋白(Stathmin 1, STMN1)，又被稱為p17, p18, p19, 19K, 腫瘤蛋白18(oncoprotein18, Op18)及LAP18，是一種分子量為19kDa，存在于細(xì)胞質(zhì)中的微管不穩(wěn)定蛋白。它主要調(diào)節(jié)微管聚合、解聚的動態(tài)過程，促使微管在細(xì)胞周期的間期及有絲分裂后期解聚。在細(xì)胞周期進(jìn)展的不同階段Stathmin通過自身磷酸化水平調(diào)節(jié)細(xì)胞微管系統(tǒng)的動力學(xué)平衡，并以此改變細(xì)胞的增殖、分化、活性等生物學(xué)行為[16]。研究發(fā)現(xiàn)，Stathmin為多種細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路的中繼站，在人類肺癌、急性白血病、前列腺癌、乳腺癌等惡性腫瘤均可檢測到Stathmin的高表達(dá)[17-21]。另外，其mRNA的高表達(dá)水平亦與紫杉醇、長春瑞濱耐藥性密切相關(guān)[22]。由此可見，stathmin有望成為治療惡性腫瘤的新藥物作用靶點(diǎn)[23]。

NM23基因(non-metastatic 23，也稱為NME基因)是人類發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的基因，其表達(dá)與多種腫瘤轉(zhuǎn)移潛能病理學(xué)指標(biāo)、淋巴結(jié)浸潤及不良預(yù)后密切相關(guān)[24]。目前已發(fā)現(xiàn)NME基因家族中有10個(gè)成員，根據(jù)基因組結(jié)構(gòu)及磷酸轉(zhuǎn)移酶活性不同可分為兩組：Ⅰ組和Ⅱ組，Ⅰ組主要包括NME1，NME2，NME3，NME4基因(亦即NM23-H1~H4)，這些基因具有較高的同源性，分別編碼具有二磷酸核苷激酶(nucleoside diphosphate kinase, NDK)活性蛋白NDPK-A~D；Ⅱ組成員為NME5、NME6、NME7、NME8、NME9基因，編碼不具有或具有較低NDPK活性的蛋白質(zhì)。其中NME10的分組目前仍頗受爭議[25]。在NME10個(gè)家族成員中，NME1、NME2亞型與腫瘤發(fā)展、轉(zhuǎn)移相關(guān)性最為密切。另有相關(guān)研究表明，NME1、NME2與肺癌轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)[26]。

G3BP是一個(gè)在真核生物進(jìn)化過程中高度保守的RasGAP(ras GTPase-activating protein) 結(jié)合蛋白[27]。它是由3.3kb的mRNA編碼，分子量為68×103的蛋白質(zhì)，主要定位于細(xì)胞質(zhì)中。寧鈞宇等[28]通過原核表達(dá)G3BP蛋白誘導(dǎo)免疫制備抗G3BP單克隆抗體，應(yīng)用ELISA、蛋白免疫印跡、免疫組化等方法進(jìn)行抗體鑒定和腫瘤檢測，發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸癌、肺癌、胃癌、乳腺癌組織中，G3BP均明顯表達(dá)。另外還發(fā)現(xiàn)，G3BP2的過表達(dá)在原位癌形成的早期就已經(jīng)出現(xiàn)[29]；G3BP可通過與p53 C-端結(jié)合，致使p53不能形成多聚體，阻礙p53活性位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄后修飾，影響其活性，導(dǎo)致p53不能發(fā)揮正常功能[27]；G3BP與抑癌基因PTEN的表達(dá)量相反，G3BP高表達(dá)引起的PTEN表達(dá)下調(diào)可能是腫瘤發(fā)生的機(jī)制之一[30]。已有研究表明G3BP N-端單克隆抗體具有良好的抗腫瘤效應(yīng)。由此可見，G3BP與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵潤及轉(zhuǎn)移等關(guān)系密切，G3BP有望成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)。

泛素(Ubiquitin)是一種高度保守的小蛋白，存在于大多數(shù)真核細(xì)胞中，其主要功能為標(biāo)記需要分解掉的蛋白質(zhì)。參與泛素化過程的酶類主要有三種：泛素激活酶(ubiquitin-activating enzymes, E1s)、泛素結(jié)合酶(ubiquitin-conjugating enzymes, E2s)、泛素蛋白連接酶(ubiquitin-protein ligases, E3s)。泛素通過三種酶相互作用與目標(biāo)蛋白結(jié)合，引起靶蛋白的降解。在惡性腫瘤中，泛素-蛋白酶體途經(jīng)發(fā)生異常是細(xì)胞獲得無限增殖性及永生性的重要原因，一些癌基因產(chǎn)物、腫瘤抑制因子p53、細(xì)胞周期蛋白等均通過此途經(jīng)降解[31]。本研究顯示UBE2D3在?？颂婺嶙饔煤驪C-9細(xì)胞中下調(diào)，說明?？颂婺峥赡芡ㄟ^UBE2D3促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞凋亡、抑制其增殖。

微管是真核生物細(xì)胞骨架的重要組成成分，由α、β微管蛋白異源二聚體及微管輔助蛋白組成，參與維持細(xì)胞形態(tài)、有絲分裂、染色體分離、細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等過程，其不斷延伸和縮短的特有動力學(xué)，在細(xì)胞有絲分裂和染色體分離中起關(guān)鍵的作用[32]。當(dāng)微管蛋白與紫杉醇、長春瑞濱、多西他賽結(jié)合后，微管動力學(xué)受到影響，使有絲分裂的紡錘體形成障礙，并啟動細(xì)胞固有死亡程序，從而抑制腫瘤的生長。TUBA1A亞型2是由TUBA1A基因的轉(zhuǎn)錄變體3翻譯合成的。目前關(guān)于NSCLC與微管蛋白的研究較多的為βⅢ-tubulin，a-tubulin研究較少。Chen等[33]應(yīng)用免疫組織化學(xué)法對158例原發(fā)NSCLC和30例癌旁組織中的微管蛋白α進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)微管蛋白α的表達(dá)率高達(dá)65.2%，而癌旁組織未見表達(dá)。另外，在腫瘤進(jìn)展期，其表達(dá)量亦逐漸增加，在Ⅲ-Ⅳ期肺癌患者和低分化腫瘤中明顯升高。在體外研究中發(fā)現(xiàn)a-tubulin表達(dá)參與紫杉醇耐藥機(jī)制。Han等[34]對紫杉醇耐藥的H460/T800細(xì)胞系進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)降低a-tubulin的表達(dá)能夠明顯增強(qiáng)細(xì)胞系對紫杉醇等抗紡錘體藥物的敏感性。由此可見a-tubulin是影響化療耐藥的因素之一。

維甲酸(retinoic acid, RA)或全反式維甲酸(all-trans retinoic acid, atRA)是人體內(nèi)重要的具有“激素樣”生理功能的物質(zhì)，它是維持胚胎發(fā)育中器官及正常結(jié)構(gòu)形成的重要物質(zhì)，并在抑制細(xì)胞生長、增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞分化、凋亡及調(diào)節(jié)免疫等方面具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)。維甲酸受體目前認(rèn)為主要有兩種：RAR和RXR，其作用機(jī)制主要通過與核內(nèi)受體結(jié)合影響轉(zhuǎn)錄來實(shí)現(xiàn)。動物實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)在致癌因素作用下，維甲類能夠阻止動物模型皮膚、口腔、肺、膀胱腫瘤的發(fā)生[35-38]。另外，大量實(shí)驗(yàn)及臨床研究亦發(fā)現(xiàn)維甲酸可阻止或逆轉(zhuǎn)人類細(xì)胞、組織的惡性轉(zhuǎn)化，如血液系統(tǒng)惡性腫瘤及肝臟、皮膚、肺臟、乳腺等原位癌[39-40]。維生素A也稱為視黃醇，經(jīng)過兩步生物化學(xué)反應(yīng)生成維甲酸，其中視黃醇脫氫酶為限速酶，顯示出較強(qiáng)的視黃醇氧化和視黃醛還原活性。本實(shí)驗(yàn)中，視黃醇脫氫酶明顯下調(diào)。綜上所述，維甲酸及視黃醇脫氫酶可能成為極具潛力的靶標(biāo)。

熱休克蛋白(heat shock proteins, HSPs)，是一類分布廣泛的在進(jìn)化過程中高度保守的蛋白質(zhì)，它在細(xì)胞新陳代謝、免疫過程、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)錄激活及信號傳導(dǎo)等方面發(fā)揮重要作用。根據(jù)分子量大小，HSPs被分為6個(gè)主要家族：HSP100、HSP90、HSP70、HSP60、HSP40和小分子HSPs(如HSP27)[41]。已經(jīng)證實(shí)HSP27、HSP70、HSP90均參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。HSP40/DNAJ家族共有41種蛋白質(zhì)，分布在細(xì)胞內(nèi)不同的位置，可分為DNAJA、DNAJB、DNAJC亞族，大部分成員含有保守的J結(jié)構(gòu)域，能夠與抗凋亡分子伴侶HSP70結(jié)合，調(diào)節(jié)ATP酶活性，從而參與蛋白的翻譯、折疊、異位等過程。目前對其研究仍較少，生理功能仍不明確，在既往研究中表明HSP40可通過泛素途經(jīng)調(diào)節(jié)角蛋白數(shù)量[42]；少數(shù)成員與腫瘤進(jìn)展及轉(zhuǎn)移相關(guān)，如DNAJB4(HLJ1)、DNAJA3(Tid1)、DNAJB6(MRJ)、DNAJC12(JDP1)、DNAJA1(HDJ2)[43]。本研究中DNAJB1在?？颂婺嶙饔玫姆蜗侔┘?xì)胞系PC-9中下調(diào)2.04倍。我們推測DNAJB1可能同其它熱休克蛋白一樣，參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。

應(yīng)用生物信息學(xué)方法對NME1-NME2、STMN1、G3BP1三種蛋白進(jìn)行分析，初步了解了它們的跨膜結(jié)構(gòu)域、理化性質(zhì)、亞細(xì)胞定位等生物學(xué)特征。NME1-NME2和stathmin亞型α均存在跨膜結(jié)構(gòu)域，而G3BP1和stathmin亞型β無跨膜結(jié)構(gòu)域，說明NME1-NME2、stathmin亞基α具有錨鏈于膜上的能力。結(jié)構(gòu)域分析顯示NME1-NME2具有兩個(gè)核苷二磷酸激酶(NDK)序列，它催化二磷酸核苷向三磷酸核苷的轉(zhuǎn)化，在信號傳導(dǎo)等方面發(fā)揮重要作用；stathmin亞型α、β均含有一個(gè)stathmin樣結(jié)構(gòu)域，主要參與微管的解聚活性，可調(diào)控細(xì)胞周期；G3BP1具有核轉(zhuǎn)運(yùn)因子2結(jié)構(gòu)域(nuclear transport factor 2, NTF2)和RNA識別基序的結(jié)構(gòu)域(RRM)，在真核生物基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮重要作用。亞細(xì)胞定位分析提示NME1-NME2主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，推測可能參與了胞質(zhì)內(nèi)信號過程；STMN1主要存在于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞骨架中，與其調(diào)節(jié)微管系統(tǒng)的動力學(xué)功能相吻合；G3BP1分布廣泛，主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，與Ras-GTPase激活蛋白結(jié)合活化Ras通路；STRING庫預(yù)測所得與NME1-NME2相互作用蛋白得分高的主要有KCNN4、CCND1、PAPD4、ACLY、MYC、CNOT8、HSP72、NME1、EEF1A1，另外，NME1-NME2可能與STAT3通路有一定的關(guān)聯(lián)；與STMN1蛋白相互作用密切的有AURKB、MAPK3、MAPK13、CDK1、TP53、MAPK1、CAMK2B、CAMK2G、NACA、ADCYAP1，可見其參與MAKP信號通路、細(xì)胞周期調(diào)控，并與TP53密切相關(guān)，相關(guān)研究表明p53可能是通過調(diào)節(jié)STMN1的表達(dá)，將細(xì)胞周期阻滯于G2/M期[44]；與G3BP1蛋白相互作用密切的主要有CAPRIN1、USP10、EIF4G1、RASA1、CSK、HDAC6、OGFOD1、PRMT1、STYXL1、ALPP，是ras信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的一個(gè)重要元素，參與腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移過程[45]。

綜上所述，本研究首次應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究了EGFR-TKI類藥物的作用機(jī)制，目前尚未見相關(guān)報(bào)道。應(yīng)用2-DE/MALDI-MS方法對埃克替尼作用前后的PC-9細(xì)胞進(jìn)行了比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究，初步鑒定了16種蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)與?？颂婺嶙饔脵C(jī)制密切相關(guān)，部分有可能成為新的分子治療靶點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)

1錢桂生. 肺癌不同病理類型發(fā)病率的變化情況及原因[J/CD]. 中華肺部疾病雜志：電子版，2011，4(1)：1-6.

2Torre A, Bray F, Siegel RL, et al. Global cancer statistics, 2012[J]. CA Cancer J Clin, 2015, 65(2): 87-108.

3Ciardiello F, Tortora G. A novel approach in the treatment of cancer:

targeting the epidermal growth factor receptor[J]. Clin Cancer Res, 2001, 7 (10): 2958-2970.

4Guan YS, He Q, Li M. Icotinib: activity and clinical application in Chinese patients with lung cancer[J]. Expert Opin Pharmacother, 2014, 15(5): 717-728.

5鄭靜嫻, 張為民, 謝波, 等. 多西他賽與吉非替尼不同時(shí)序應(yīng)用對人肺腺癌細(xì)胞的作用[J]. 臨床腫瘤學(xué)雜志, 2012, 17(5): 385-391.

6Xuan X, An C, Zhou C. The mechanism of gefitinib resistance induced by hepatocyte growth factor in sensitive non-small cell lung cancer cells in vitro[J]. Zhongguo Fei Ai Za Zhi, 2013, 16(1): 1-6.

7Moll R, Franke WW, Schiller DL, et al. The catalog of human cytokeratins: patterns of expression in normal epithelia, tumors and cultured cells[J]. Cell, 1982, 31(1): 11-24.

8侯秀麗. 細(xì)胞角蛋白與腫瘤的關(guān)系[J]. 國際腫瘤學(xué)雜志，2009，36 (11)：4.

9Fu BS, Liu W, Zhang JW, et al. [Serum proteomic analysis on metastasis-associated proteins of hepatocellular carcinoma][J]. Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao, 2009, 29 (9): 1775-1778.

10Warburg O. On respiratory impairment in cancer cells[J]. Science, 1956, 124(3215): 269-270.

11Greengard O, Herzfeld A. The undifferentiated enzymic composition of human fetal lung and pulmonary tumors[J]. Cancer Res, 1977, 37(3): 884-891.

12Possemato R, Marks KM, Shaul YD, et al. Functional genomics reveal that the serine synthesis pathway is essential in breast cancer[J]. Nature, 2011, 476(7360): 346-350.

13De Ingeniis J, Ratnikov B, Richardson AD, et al. Functional specialization

in proline biosynthesis of melanoma[J]. PLoS One, 2012, 7(9): e45190.

14Hepler JR, Gilman AG. G proteins[J]. Trends Biochem Sci, 1992,

17(10): 383-387.

15曾曉, 孫露霜, 楊立琳, 等. Ran調(diào)節(jié)因子RanBP1的生物學(xué)作用[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，41(3)：150-153.

16Mistry SJ, Atweh GF. Role of stathmin in the regulation of the mitotic spindle: potential applications in cancer therapy[J]. Mt Sinai J Med, 2002, 69(5): 299-304.

17Curmi PA, Nogues C, Lachkar S, et al. Overexpression of stathmin in breast carcinomas points out to highly proliferative tumours[J]. Br J Cancer, 2000, 82(1): 142-150.

18Ocak S, Friedman DB, Chen H, et al. Discovery of new membrane-associated proteins overexpressed in small cell lung cancer[J]. J Thorac Oncol, 2014, 9(3): 324-336.

19Machado-Neto JA, de Melo Campos P, Favaro P, et al. Stathmin1 is involved in the highly proliferative phenotype of high-risk myelodysplastic syndromes and acute leukemia cells[J]. Leuk Res, 2014, 38(2): 251-257.

20Sabherwal Y, Mahajan N, Helseth DL, et al. PDEF downregulates stathmin expression in prostate cancer[J]. Int J Oncol, 2012, 40(6): 1889-1899.

21Brattsand G. Correlation of oncoprotein 18/stathmin expression in human breast cancer with established prognostic factors[J]. Br J Cancer, 2000, 83(3): 311-318.

22Seve P, Dumontet C. Chemoresistance in non-small cell lung cancer[J]. Curr Med Chem Anticancer Agents, 2005, 5(1): 73-88.

23Rana S, Maples PB, Senzer N, et al. Stathmin1: a novel therapeutic

target for anticancer activity[J]. Expert Rev Anticancer Ther, 2008, 8(9): 1461-1470.

24Li Y, Tong Y, Wong YH. Regulatory functions of Nm23-H2 in tumorigenesis: insights from biochemical to clinical perspectives[J]. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol, 2015, 388(2): 243-256.

25Desvignes T, Pontarotti P, Fauvel C, et al. Nme protein family evolutionary history, a vertebrate perspective[J]. BMC Evol Biol, 2009, 9: 256.

26Salerno M, Ouatas T, Palmieri D, et al. Inhibition of signal transduction

by the nm23 metastasis suppressor: possible mechanisms[J]. Clin Exp Metastasis, 2003, 20(1): 3-10.

27張浩, 邵榮光. G3bp：一個(gè)潛在的腫瘤治療靶點(diǎn)[J]. 藥學(xué)學(xué)報(bào)，2010，45(8)：945-951.

28寧鈞宇, 由江峰, 裴斐, 等. G3bp單克隆抗體制備及g3bp在腫瘤組織中表達(dá)的檢測[J].中國病理學(xué)雜志，2005，34(4)：5.

29French J, Stirling R, Walsh M, et al. The expression of Ras-GTPase activating protein SH3 domain-binding proteins, G3BPs, in human breast cancers[J]. Histochem J, 2002, 34(5): 223-231.

30Huang Y, Wernyj RP, Norton DD, et al. Modulation of specific protein expression levels by PTEN: identification of AKAP121, DHFR, G3BP, Rap1, and RCC1 as potential targets of PTEN[J]. Oncogene, 2005, 24(23): 3819-3829.

31Popovic D, Vucic D, Dikic I. Ubiquitination in disease pathogenesis

and treatment[J]. Nat Med, 2014, 20(11): 1242-1253.

32Margolis RL, Wilson L. Opposite end assembly and disassembly of microtubules at steady state in vitro[J]. Cell, 1978, 13(1): 1-8.

33Chen QY, Jiang ZY, Wu LJ, et al. [Expression of alpha-tubulin and MDR1 and their correlation with the biological features of non-small cell lung carcinoma][J]. Zhonghua Zhong Liu Za Zhi, 2010, 32(4): 278-282.

34Han EK, Gehrke L, Tahir SK, et al. Modulation of drug resistance by alpha-tubulin in paclitaxel-resistant human lung cancer cell lines[J]. Eur J Cancer, 2000, 36(12): 1565-1571.

35Winslow S, Leandersson K, Larsson C. Regulation of PMP22 mRNA

by G3BP1 affects cell proliferation in breast cancer cells[J]. Mol Cancer, 2014, 12(1): 156.

36Wang Y, Wen W, Yi Y, et al. Preventive effects of bexarotene and budesonide in a genetically engineered mouse model of small cell lung cancer[J]. Cancer Prev Res (Phila), 2009, 2(12): 1059-1064.

37Shah RK, Valdez TA, Wang Z, et al. Pulsed-dye laser and retinoic acid delay progression of oral squamous cell carcinoma: a murine model[J]. Laryngoscope, 2001, 111(7): 1203-1208.

38Moon RC, Kelloff GJ, Detrisac CJ, et al. Chemoprevention of OH-BBN-induced bladder cancer in mice by oltipraz, alone and in combination with 4-HPR and DFMO[J]. Anticancer Res, 1994, 14(1A): 5-11.

39Okuno M, Kojima S, Matsushima-Nishiwaki R, et al. Retinoids in cancer chemoprevention[J]. Curr Cancer Drug Targets, 2004, 4(3): 285-298.

40Edelman MJ, Smith R, Hausner P, et al. Phase Ⅱ trial of the novel retinoid, bexarotene, and gemcitabine plus carboplatin in advanced non-small-cell lung cancer[J]. J Clin Oncol, 2005, 23(24): 5774-5778.

41Kampinga HH. Chaperones in preventing protein denaturation in living

cells and protecting against cellular stress[J]. Handb Exp Pharmacol, 2006, (172): 1-42.

42Yamazaki S, Uchiumi A, Katagata Y. Hsp40 regulates the amount of keratin proteins via ubiquitin-proteasome pathway in cultured human cells[J]. Int J Mol Med, 2012, 29(2): 165-168.

43Mitra A, Shevde LA, Samant RS. Multi-faceted role of HSP40 in cancer[J]. Clin Exp Metastasis, 2009, 26(6): 559-567.

44Lu Y, Liu C, Cheng H, et al. Stathmin, interacting with NF-κ B, promotes tumor growth and predicts poor prognosis of pancreatic cancer[J]. Curr Mol Med, 2014, 14(3): 328-339.

45Giehl K. Oncogenic Ras in tumour progression and metastasis[J]. Biol Chem, 2005, 386 (3):193-205.

(本文編輯：黃紅稷)

劉曉麗，李維，孟夏，等. 鹽酸?？颂婺釋θ朔蜗侔┘?xì)胞系PC-9作用的比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究[J/CD]. 中華肺部疾病雜志： 電子版， 2015， 8(6)： 674-683.

Comparative proteomics on mechanisms of lung adenocarcinoma cell line PC-9 induced by icotinib

LiuXiaoli,LiWei,MengXia,ZhangYuping,MingZhongjuan,Shihongyan,ShiJie,ZhongYnjie,WangWei,YangShanying.DepartmentofRespiratoryMedicine,theSecondAffiliatedHospital,MedicalSchoolofXi′anJiaotongUniversity,Xi′an710004,China

Correspondingauthor：YangShanying,Email:yangshuanying66@163.com

【Abstract】ObjectiveTo analyze icotinib-associated proteins of PC-9 cell with comparative proteomics and bioinformatics technique to discuss molecule mechanism of icotinib. MethodsAmoy Dx and real-time PCR were used to detect the EGFR mutation in PC-9 cells gene. MTT was used to investigate theproliferationinhibition oficotinibon PC-9 cells. Two dimensional gel electrophoresis (2-DE) was used to separate totally soluble proteins extracted from PC-9 cells either exposed to or not exposed to icotinib, and differentially expressed proteins were analyzed and identified by matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS). Proteins were identified by blasting NCBI or SWISS PORT database with Mascot software. ResultsThere was a deletion mutation located in exon 19.In the 10-4-10-9M concentration range,icotiib significantly concentration-dependent inhibited the growth of the PC-9 cells. 56 differentially expressed protein spots(Ratio≥1.5)were found. We finally selected 29 obviously differential protein spots (Ratio≥1.7) to analyze by MALDI-TOF-TOF-MS and got 16 proteins successfully. They can be classified into 5 categories based on their functions: enzymes related to cell metabolism, cytoskeleton proteins, signal transduction molecules, chaperone, proteins related to transcription and translation. Conclusions16 icotinib-related proteins are identified by comparative proteomics. These proteins may be associated with anti-tumor mechanism of icotinib and some of them may become potential drug targets.

【Key words】PC-9 cell;Icotinib;Lung cancer;Comparative proteomics;Bioinformatics

(收稿日期：2015-11-06)

中圖法分類號：R563，R743

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

通訊作者：楊拴盈，Email: yangshuanying66@163.com

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助(81172234)
作者單位： 710004 陜西，西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科

DOI：10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2015.06.002