劉益芬 陳敦金 趙 揚(yáng) 劉啟才 李映桃 陳艷紅 鄧運(yùn)芝 胡雪嫻

(1廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣州重癥孕產(chǎn)婦救治中心，廣東省產(chǎn)科重大疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510150；2廣州醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510182； 3廣東省人民醫(yī)院婦產(chǎn)科,廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，廣東 廣州 510080)

·論著·

子癇前期患者胎盤組織中Syncytin-2和MFSD2的表達(dá)

劉益芬1陳敦金1趙 揚(yáng)2劉啟才3李映桃1陳艷紅1鄧運(yùn)芝1胡雪嫻1

(1廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣州重癥孕產(chǎn)婦救治中心，廣東省產(chǎn)科重大疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510150；2廣州醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510182；3廣東省人民醫(yī)院婦產(chǎn)科,廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，廣東 廣州 510080)

目的:探討Syncytin-2及其受體MFSD2在不同程度子癇前期和正常晚期妊娠胎盤組織中的表達(dá)情況。方法：選擇2010年3月至2013年8月在廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院住院分娩的60例孕婦作為研究對(duì)象，分為輕度子癇前期組、重度子癇前期組和正常晚期妊娠組，每組各20例。采用定量RT-PCR 方法檢測(cè)Syncytin-2 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平，Western blotting法測(cè)定MFSD2蛋白表達(dá)強(qiáng)度。結(jié)果：3組Sycytin-2 mRNA和MFSD2蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中正常晚期妊娠組高于輕度子癇前期組和重度子癇前期組(P<0.05)，而輕度子癇前期組與重度子癇前期組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論：胎盤組織Syncytin-2和MFSD2表達(dá)下調(diào)與子癇前期發(fā)病密切相關(guān)。

子癇前期； Syncytin-2；MFSD2

子癇前期(preeclampsia,PE)是妊娠期特有的多系統(tǒng)疾病,是導(dǎo)致圍產(chǎn)期母親死亡的第二個(gè)主要并發(fā)癥[1]。目前認(rèn)為子癇前期不是單一病因的疾病,可能是多種因素相互作用的結(jié)果，滋養(yǎng)細(xì)胞分化異常導(dǎo)致螺旋動(dòng)脈重鑄失敗和胎盤淺著床是PE的特征性病理生理變化,在PE發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要的作用[2]。Syncytin-2和MFSD2是參與胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞分化、融合的重要基因，與胎盤正常形態(tài)和功能的維持關(guān)系密切，因而可能與PE的發(fā)病密切相關(guān)。本研究采用定量RT-PCR 方法檢測(cè)Syncytin-2 mRNA 的轉(zhuǎn)錄水平，Western blotting法測(cè)定MFSD2蛋白表達(dá)強(qiáng)度，探討Syncytin-2和MFSD2在PE發(fā)病中的作用，為子癇前期病因的深入研究提供線索，也為今后采取相應(yīng)的干預(yù)措施提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2010年3月至2013年8月在廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院住院分娩的60例孕婦作為研究對(duì)象，根據(jù)孕周匹配，分為輕度子癇前期組、重度子癇前期組和正常晚期妊娠組，每組各20例。PE診斷標(biāo)準(zhǔn)參考樂(lè)杰主編《婦產(chǎn)科學(xué)》教材第7版[3]，排除妊娠合并原發(fā)性高血壓、腎炎等；正常晚期妊娠組排除胎膜早破、早產(chǎn)等病理妊娠。3組孕婦年齡、孕周、孕產(chǎn)次比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

1.2 主要試劑

引物和探針由上海閃晶生物技術(shù)有限責(zé)任公司設(shè)計(jì)并合成， Quantitect Probe RT PCR試劑盒購(gòu)于Qiagen公司。Sv Total RNA提取試劑盒購(gòu)于Promega公司。羊抗Syncytin-2 抗體購(gòu)自Santa Crui生物技術(shù)公司,兔抗羊二抗購(gòu)自Sigma公司。熒光定量PCR儀為Mxpro 3000 型，產(chǎn)自美國(guó)Stratagene公司。

1.3 胎盤取材與處理

胎盤娩出后30 min內(nèi)取臍帶附著點(diǎn)至胎盤邊緣范圍的中間區(qū)域(避開鈣化灶及出血點(diǎn))，剔除外部的母體面組織至少1.0 cm，取胎盤組織總質(zhì)量約50～100 mg，生理鹽水洗凈后液氮凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 總RNA和蛋白提取

稱取約胎盤組織40 mg，充分研磨后依SV Total RNA 提取試劑盒說(shuō)明書操作， 提取總RNA后紫外分光光度計(jì)測(cè)定其純度并計(jì)算濃度后，2%瓊脂糖凝膠電泳確定RNA 完整性，-80 ℃保存?zhèn)溆?；胎盤組織剪碎后加入1 mL裂解液，充分勻漿后膠乳蛋白抽提液，離心后吸除液相，干燥沉淀蛋白，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)

Mxpro 3000 型熒光定量PCR 儀檢測(cè)Syncytin-2的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平，引物和探針序列：正向序列5′-ATGGCCCTCCCTTATCA-3′，反向序列5′-TGGGTG TGGGCAGTGAA-3′,一步法實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR反應(yīng)條件如表2。每次反應(yīng)均設(shè)由DEPC 水作模板的陰性對(duì)照，以GAPDH為內(nèi)參照，計(jì)算機(jī)軟件分析各管反應(yīng)物的熒光強(qiáng)度，標(biāo)準(zhǔn)曲線法半定量計(jì)算各目的基因相對(duì)反應(yīng)起始拷貝數(shù)。

1.6 Western blotting檢測(cè)

生物分光光度比色分析測(cè)定蛋白質(zhì)含量后，各取50 μg蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，1:500 一抗孵育過(guò)夜，1∶3 000 二抗標(biāo)記，ECL液顯色，然后依次曝光、顯影、定影，凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的分子質(zhì)量和凈光密度值，用灰度分析軟件得出MFSD2表達(dá)圖像峰面積值，與β-actin表達(dá)峰面積值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Sycytin-2 mRNA相對(duì)表達(dá)情況

PCR 檢測(cè)結(jié)果顯示，3組Sycytin-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中正常晚期妊娠組高于輕度子癇前期組和重度子癇前期組(P<0.05)，而輕度子癇前期組與重度子癇前期組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

表1 3組孕婦一般資料比較±s)

表2 檢測(cè)條件

表3 3組Sycytin-2mRNA的相對(duì)表達(dá)情況

注：內(nèi)參校正后的Syncytin-2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量=Syncytin-2 mRNA的表達(dá)量/GAPDHmRNA的表達(dá)量；與正常晚期妊娠組比較，*P<0.05。

2.2 MFSD2蛋白表達(dá)情況

Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，3組胎盤組織中MFSD2蛋白表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中正常晚期妊娠組高于輕度子癇前期組和重度子癇前期組(P<0.05)，而輕度子癇前期組與重度子癇前期組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖1，2。

MFSD2β-actin123123

注：1.正常晚期妊娠組;2.輕度子癇前期組;3.重度子癇前期組

圖1 3組胎盤組織MFSD2蛋白表達(dá)情況

121086420MFSD2蛋白的相對(duì)表達(dá)**123

注：1.正常晚期妊娠組;2.輕度子癇前期組;3.重度子癇前期組；與正常晚期妊娠組比較，*P<0.05

圖2 3組MFSD2蛋白的相對(duì)表達(dá)情況

3 討 論

Syncytin-2是人內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄缺陷病毒HERV家族成員之一的HERV-FRD 編碼的包膜蛋白。HERV基因家族是2 500～4 000萬(wàn)年前侵入靈長(zhǎng)類動(dòng)物體內(nèi)的逆轉(zhuǎn)錄病毒基因片段[4]。哺乳動(dòng)物在漫長(zhǎng)進(jìn)化過(guò)程中捕獲感染的逆轉(zhuǎn)錄病毒部分基因片段,整合入自身基因組,并在體內(nèi)加以表達(dá)，其組成約占人類基因組8%[5-7]。HERV的確切功用目前尚不十分清楚，但有研究顯示， HERV可影響基因組的有序運(yùn)作及其生物功能，在分子演變中HERV基因的某一編碼序列可翻譯出具有特異功能的蛋白質(zhì)，對(duì)細(xì)胞生物功能起重要作用[5]。Syncytin是人內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄缺陷病毒HERV家族成員編碼的包膜蛋白，分為Syncytin-1和Syncytin-2，最新研究提示，HERV家族中的HERV-FRD的包膜蛋白Syncytin-2在胎盤細(xì)胞融合過(guò)程中，細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞形成合胞體滋養(yǎng)細(xì)胞中起著比Syncytin-1更重要的作用[8]。Syncytin-2的表達(dá)隨著孕周的延長(zhǎng)，其表達(dá)水平顯著下降，在早期，其轉(zhuǎn)錄水平比Syncytin-1低10倍，但足月妊娠時(shí)，在胎盤組織中檢測(cè)低到40倍左右，這也意味著Syncytin-2在合胞體形成過(guò)程中與Syncytin-1相比起著不同的作用[9]，這種不同可能與Syncytin-2蛋白僅表達(dá)于CT與ST交界的部分絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)有關(guān)[10]。但臺(tái)灣有學(xué)者報(bào)道Syncytin-2的表達(dá)隨著孕周的延長(zhǎng)，早中晚孕期表達(dá)水平顯著上升，并且在PE中表達(dá)明顯下降[11]。這與本組前期研究的結(jié)果一致，Syncytin-2 mRNA在PE中明顯降低[12]。Syncytin-2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物1 038 bp，在胎盤形態(tài)建成中，Syncytin-2作為靈長(zhǎng)類的真正細(xì)胞基因維持它的融合特性的功能的結(jié)構(gòu)狀態(tài)，對(duì)比感染病毒基因組有非常低的突變率，這歸因于Syncytin-2的晶體結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)的中央由化石般的外功能區(qū)組成，容許相應(yīng)的目前感染的逆轉(zhuǎn)錄病毒大量的疊加，有60%的分叉序列，正是由于Syncytin-2的這種獨(dú)特結(jié)構(gòu)通過(guò)它的融合功能從HERV的包膜蛋白中選擇出來(lái)[13]。本研究結(jié)果顯示，3組均有Syncytin-2 mRNA的表達(dá),不同程度PE胎盤組織中Syncytin-2 mRNA的表達(dá)量均比正常妊娠胎盤組織中低。輕度PE胎盤Syncytin-2 mRNA的表達(dá)跟重度PE胎盤Syncytin-2 mRNA的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Syncytin-2在胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞融合分化過(guò)程中的作用發(fā)揮尚依賴于獨(dú)特的受體MFSD2。MFSD2屬于設(shè)定的超過(guò)10～12跨膜區(qū)域的碳水化合物的運(yùn)載體，位于人類染色體1P34.2，在演變過(guò)程中相對(duì)保守。MFSD2在單核細(xì)胞滋養(yǎng)層中不斷的通過(guò)融合增殖使細(xì)胞滋養(yǎng)層形成合胞體滋養(yǎng)層，使MFSD2在合胞體滋養(yǎng)層中高度表達(dá)。MFSD2在胎盤組織表達(dá)具有特異性，除了在睪丸低4倍，在其余組織中低至十倍以上[14]。本研究結(jié)果也顯示，3組中均有MFSD2蛋白的表達(dá),不同程度PE胎盤組織中MFSD2蛋白的表達(dá)量均比正常晚期妊娠胎盤組織中低。輕度PE胎盤的表達(dá)跟重度PE胎盤的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這與Syncytin-2 mRNA在PE的表達(dá)下降完全一致,但與作者前期研究的MFSD2 mRNA在PE的表達(dá)差別無(wú)顯著性意義[2]不同，這可能與MFSD的定位不同有關(guān)。

綜上所述，胎盤中Syncytin-2、MFSD2表達(dá)下降可能引起合體滋養(yǎng)細(xì)胞形成減少，胎盤絨毛發(fā)育缺陷，導(dǎo)致胎盤缺血缺氧，從而使妊娠高血壓患者胎盤功能失調(diào)。對(duì)Syncytin-2 和MFSD2 的研究有助于進(jìn)一步了解PE的發(fā)病機(jī)制。

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(本文編輯:歐陽(yáng)菁)

Expression of Syncytin-2 and MFSD2 in placenta tissues of patient with preeclampsia

LiuYifen1,ChenDunjin1,ZhaoYang2,LiuQicai3,LiYingtao1,ChenYanhong1,DengYunzhi1,HuXuexian1

(1DepartmentofObstetricsandGynaecology,TheThirdAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity,GuangzhouMedicalCenterforCriticalDiseasesinPregnancy,GuangdongKeyLaboratoryofCriticalObstetricDiseases,Guangzhou510150;2CentralLaboratoryofGuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510150;3DepartmentofObstetricsandGynaecology,GuangdongProvincialPeople′sHospital,GuangdongAcademyofMedicalSciences,Guangzhou510080,China)

Objective:To investigate the expression of Syncytin-2 and its receptor MFSD2 in placenta tissues of different levels of preeclampsia and normal late pregnancy. Methods: Sixty pregnant women hospitalized for childbirth in the Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University between March 2010 and August 2013 were included as the subjects in the study, and were divided into the mild preeclampsia group, severe preeclampsia group, and normal late pregnancy group (n=20 each). The transcription level of Syncytin-2 mRNA was determined by quantitative real-time PCR (RT-PCR), and the expression intensity of MFSD2 protein was determined by Western blotting. Results: There were statistically significant differences in the relative expression levels between Syncytin-2 mRNA and MFSD2 protein among the three groups (P<0.05). The relative expression levels of Syncytin-2 mRNA and MFSD2 protein in the normal late pregnancy group was higher than those in the mild preeclampsia group and severe preeclampsia group (P<0.05), whereas no statistically significant differences was found between the mild preeclampsia group and severe preeclampsia group (P>0.05). Conclusion:Down-regulated expressions of Syncytin-2 and MFSD2 in placenta tissue are closely related to the occurrence of preeclampsia.

preeclampsia; syncytin-2; MFSD2

10.3969/j.issn.2095-9664.2015.04.001

廣州市醫(yī)藥衛(wèi)生科技項(xiàng)目(201102A213179)；廣州醫(yī)學(xué)院科研基金項(xiàng)目；廣州醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院科研基金項(xiàng)目(2010Y07)

劉益芬(1976-)，女，碩士，主治醫(yī)師。

R714.245

A

2095-9664(2015)04-0001-04

2015-02-01)

研究方向：圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)和產(chǎn)后保健。