劉占濤，楊志宏，趙永娟，冀立霞，郭錫春，岳 旺，尹 磊（青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東青島 266021）

動(dòng)脈粥樣硬化（Atherosclerosis）是最常見(jiàn)的心血管疾病之一，主要累及大中動(dòng)脈，并可引起一系列繼發(fā)性病變[1]。近年來(lái)，人們逐漸認(rèn)識(shí)到動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病與炎性反應(yīng)有著十分密切的關(guān)系。血管內(nèi)皮細(xì)胞受損時(shí)，釋放大量的炎性因子如腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素6（IL-6）等，引起平滑肌細(xì)胞增殖，最終形成動(dòng)脈粥樣硬化[2]。通過(guò)抑制血管平滑肌細(xì)胞移行及增殖的物質(zhì)，可延緩或抑制動(dòng)脈粥樣硬化病變的形成[3]。

吲哚-2，3-二酮的化學(xué)結(jié)構(gòu)明確，生物活性廣泛。本課題組前期研究表明，其具有抗炎和抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用[4-6]。本研究采用大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞A7r5，觀察吲哚-2，3-二酮對(duì)TNF-α所致A7r5 細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響，初步探討吲哚-2，3-二酮對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化炎性反應(yīng)的作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

BB5060UV 型CO2培養(yǎng)箱（德國(guó)赫利公司）；SW-CJ-40 型超凈工作臺(tái)（上海蘇凈實(shí)業(yè)有限公司）；CKX41 型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；550型酶標(biāo)儀（瑞典Rosys Anthos公司）；流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）。

1.2 藥品與試劑

吲哚-2，3-二酮（青島大學(xué)藥物研發(fā)基地提供，純度：99.7%）；高糖改良馬丁瓊脂（DMEM）培養(yǎng)基、胎牛血清、MTT（美國(guó)Sigma 公司）；碘化丙啶（PI）染液（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）；TNF-α（北京天來(lái)生物醫(yī)學(xué)科技有限公司）。

1.3 細(xì)胞

大鼠主動(dòng)脈平滑肌A7r5 細(xì)胞，購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

2 方法

2.1 培養(yǎng)基和溶液的組成

10%DMEM 培養(yǎng)基：10%胎牛血清、100 μg/ml 鏈霉素、100 u/ml青霉素、DMEM培養(yǎng)基。20%DMEM培養(yǎng)基：20%胎牛血清、100 μg/ml 鏈霉素、100 u/ml 青霉素、DMEM 培養(yǎng)基。磷酸鹽緩沖液（PBS）：氯化鉀0.10 g/L、磷酸氫二鈉1.75 g/L、氯化鈉8.00 g/L、磷酸二氫鉀0.10 g/L，雙蒸水配制。

2.2 細(xì)胞的培養(yǎng)

取A7r5 細(xì)胞用10% DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，在37 ℃下5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)傳代培養(yǎng)，取指數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

2.3 吲哚-2，3-二酮試驗(yàn)質(zhì)量濃度的確定

收集指數(shù)生長(zhǎng)期A7r5 細(xì)胞，確定細(xì)胞濃度為1×105ml－1，接種到96 孔板，每孔100 μl，24 h 細(xì)胞貼壁后分為（1）對(duì)照組：加入100 μl無(wú)血清培養(yǎng)基；（2）試驗(yàn)組：加入含不同質(zhì)量濃度吲哚-2，3-二酮的無(wú)血清培養(yǎng)基100 μl，最終質(zhì)量濃度分別為10－11、10－10、10－9、10－8、10－7、10－6、10－5mg/ml。24 h后棄上清液，每孔加入MTT溶液20 μl，37 ℃孵育4 h后棄孔內(nèi)液體，每孔加入150 μl 二甲基亞砜（DMSO）溶液，振蕩1 min，在570 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)光密度（OD），用OD值表示細(xì)胞存活情況。試驗(yàn)重復(fù)3次。以O(shè)D值確定吲哚-2，3-二酮的試驗(yàn)質(zhì)量濃度。

2.4 TNF-α造模質(zhì)量濃度的確定

收集指數(shù)生長(zhǎng)期A7r5 細(xì)胞，確定細(xì)胞濃度為1×105ml－1，每孔100 μl，接種到96 孔板內(nèi)，24 h 細(xì)胞貼壁后，將培養(yǎng)基更換為無(wú)血清培養(yǎng)基，24 h后使細(xì)胞同步化于G0/G1期。將細(xì)胞分為（1）空白組：加入20%DMEM 培養(yǎng)基；（2）TNF-α組：加入含不同質(zhì)量濃度TNF-α的20%DMEM培養(yǎng)基，使其最終質(zhì)量濃度分別為0.078、0.156、0.625、2.5、5、10、20、40、80 ng/ml。48 h后棄去上清液，每孔加入MTT溶液20 μl，孵育4 h后吸出MTT 溶液，每孔加入DMSO 150 μl，在氣浴振蕩儀中振蕩10 min使結(jié)晶物完全溶解，在570 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)OD值。試驗(yàn)重復(fù)3次。以O(shè)D值確定TNF-α的造模質(zhì)量濃度。

2.5 吲哚-2，3-二酮對(duì)TNF-α所致A7r5細(xì)胞增殖的影響

收集指數(shù)生長(zhǎng)期A7r5 細(xì)胞，確定細(xì)胞濃度為1×105ml－1，接種到96孔板內(nèi)，每孔100 μl，24 h細(xì)胞貼壁后，將培養(yǎng)基更換為無(wú)血清培養(yǎng)基，24 h后使細(xì)胞同步化與G0/G1期。將細(xì)胞分為（1）空白對(duì)照組：加入20%DMEM培養(yǎng)基；（2）模型組：加入含5 ng/ml TNF-α的20% DMEM 培養(yǎng)基；（3）吲哚-2，3-二酮組：加入含5 ng/ml TNF-α和10－8、10－7、10－6、10－5mg/ml 吲哚-2，3-二酮的DMEM培養(yǎng)基。孵育48 h，棄去上清液，每孔加入20 μl MTT 溶液，孵育4 h 后吸出MTT 溶液，每孔加入DMSO 150 μl，在氣浴振蕩儀中振蕩10 min 使結(jié)晶物完全溶解，在570 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)OD值。試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.6 吲哚-2，3-二酮對(duì)TNF-α所致A7r5細(xì)胞增殖周期的影響

收集指數(shù)生長(zhǎng)期A7r5 細(xì)胞，分組和給藥同“2.5”項(xiàng)，孵育48 h，用0.25%的胰蛋白酶溶液消化細(xì)胞并收集細(xì)胞，以預(yù)冷的PBS 溶液洗滌細(xì)胞2 次，將細(xì)胞重懸于70%的冰乙醇溶液中，－20 ℃固定1 h。再將各組細(xì)胞用PBS清洗1次，分別加入500 μl PBS 與5 μl RNA 酶于37 ℃孵育1 h，加入5 μl PI 染液，檢測(cè)各組細(xì)胞的周期分布。試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。數(shù)值均以表示，組間比較采用方差分析。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 吲哚-2，3-二酮試驗(yàn)質(zhì)量濃度的確定

結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，10－11、10－10、10－9、10－8、10－7、10－6、10－5mg/ml 的吲哚-2，3-二酮對(duì)A7r5 細(xì)胞的存活無(wú)明顯影響，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。綜合考慮，選擇吲哚-2，3-二酮的試驗(yàn)質(zhì)量濃度為10－8、10－7、10－6、10－5mg/ml，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同質(zhì)量濃度吲哚-2，3-二酮對(duì)A7r5 細(xì)胞存活的影響（，n＝3）Tab 1 Effects of different concentrations of indol-2，3-dione on A7r5 cell survival（，n＝3）

表1 不同質(zhì)量濃度吲哚-2，3-二酮對(duì)A7r5 細(xì)胞存活的影響（，n＝3）Tab 1 Effects of different concentrations of indol-2，3-dione on A7r5 cell survival（，n＝3）

3.2 TNF-α造模質(zhì)量濃度的確定

與空白組比較，0.078、0.156、0.625、2.5、5、10、20、40、80 ng/ml的TNF-α均能增加A7r5細(xì)胞的存活，差異具有統(tǒng)計(jì)意義（P＜0.01）。其中5 ng/ml TNF-α與其余質(zhì)量濃度比較，細(xì)胞存活增加更明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。因此，確定5 ng/ml為TNF-α的造模質(zhì)量濃度。不同質(zhì)量濃度TNF-α對(duì)A7r5細(xì)胞存活的影響見(jiàn)表2。

表2 不同質(zhì)量濃度TNF-α對(duì)A7r5 細(xì)胞存活的影響（，n＝3）Tab 2 Effects of different concentrations of TNF-α on A7r5 cell survival（，n＝3）

表2 不同質(zhì)量濃度TNF-α對(duì)A7r5 細(xì)胞存活的影響（，n＝3）Tab 2 Effects of different concentrations of TNF-α on A7r5 cell survival（，n＝3）

注：與空白組比較，＊P＜0.01；與5 ng/ml比較，#P＜0.01Note：vs.blank group，＊P＜0.01；vs.5 ng/ml，#P＜0.01

3.3 A7r5細(xì)胞的增殖變化

與空白對(duì)照組比較，模型組A7r5細(xì)胞的OD值明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組比較，10－7、10－6、10－5mg/ml吲哚-2，3-二酮組A7r5細(xì)胞的OD值明顯減小，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01 或P＜0.05），其余差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。各組細(xì)胞的增殖變化見(jiàn)表3。

表3 各組細(xì)胞的增殖情況（，n＝3）Tab 3 The proliferation of cells in each group（，n＝3）

表3 各組細(xì)胞的增殖情況（，n＝3）Tab 3 The proliferation of cells in each group（，n＝3）

注：與空白對(duì)照組比較，＊P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01Note：vs.blank control group，＊P＜0.05；vs.model group，#P＜0.05，##P＜0.01

3.4 A7r5細(xì)胞周期變化

與空白對(duì)照組比較，模型組A7r5細(xì)胞S期與G2/M期明顯增加，G0/G1期細(xì)胞明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組比較，10－8mg/ml吲哚-2，3-二酮組A7r5細(xì)胞G2/M 期明顯減少，10－7、10－6mg/ml 吲哚-2，3-二酮組S 期細(xì)胞均明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其余差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。各組細(xì)胞的細(xì)胞周期分布情況見(jiàn)表4。

表4 各組細(xì)胞的細(xì)胞周期分布情況（，n＝3）Tab 4 Distribution of cell cycle in each group（，n＝3）

表4 各組細(xì)胞的細(xì)胞周期分布情況（，n＝3）Tab 4 Distribution of cell cycle in each group（，n＝3）

注：與空白對(duì)照組比較，＊P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05Note：vs.blank control group，＊P＜0.05；vs.model group，#P＜0.05

4 討論

血管平滑肌細(xì)胞的移行和過(guò)度增殖在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中起著關(guān)鍵的作用[6]。當(dāng)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷時(shí)，釋放大量的TNF-α、IL-6 等炎性因子。在其刺激下，血管平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞可以合成并分泌大量的纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子、血小板源性生長(zhǎng)因子等生長(zhǎng)因子，使內(nèi)膜平滑肌細(xì)胞增殖，中膜平滑肌細(xì)胞遷移至內(nèi)皮下間隙，攝取脂質(zhì)，逐步形成泡沫細(xì)胞，產(chǎn)生膠原、彈性纖維及蛋白多糖等，最終形成動(dòng)脈粥樣硬化。

本文用不同質(zhì)量濃度的吲哚-2，3-二酮處理平滑肌A7r5細(xì)胞，觀察其對(duì)A7r5細(xì)胞的增殖有無(wú)影響，從而為后續(xù)研究的試驗(yàn)質(zhì)量濃度確定提供依據(jù)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，吲哚-2，3-二酮在高質(zhì)量濃度（10－5mg/ml）時(shí)，對(duì)細(xì)胞增殖無(wú)影響。結(jié)合對(duì)吲哚-2，3-二酮的其他藥理作用的研究結(jié)果[4]，選用10－8、10－7、10－6、10－5mg/ml這4個(gè)質(zhì)量濃度作為本文中吲哚-2，3-二酮的試驗(yàn)質(zhì)量濃度。

TNF-α是一種重要的前炎性細(xì)胞因子，出現(xiàn)在炎癥早期，呈現(xiàn)出趨化、活化中性粒細(xì)胞及單核細(xì)胞，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)黏附分子等多種生物學(xué)活性，還能增加平滑肌細(xì)胞表達(dá)E-selectin，從而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成[7]。本試驗(yàn)采用不同質(zhì)量濃度的TNF-α處理平滑肌A7r5細(xì)胞，觀測(cè)其對(duì)A7r5細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果表明，各質(zhì)量濃度TNF-α均能明顯促進(jìn)A7r5 細(xì)胞的增殖，以TNF-α 5 ng/ml 促增殖作用最為明顯，因此最終確定5 ng/ml為TNF-α造模質(zhì)量濃度。結(jié)合對(duì)吲哚-2，3-二酮最大無(wú)毒濃度的探究，探討吲哚-2，3-二酮拮抗TNF-α誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞增殖的作用。結(jié)果表明，吲哚-2，3-二酮對(duì)5 ng/ml TNF-α誘導(dǎo)的A7r5 細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用，提示吲哚-2，3-二酮抗動(dòng)脈粥樣硬化炎性反應(yīng)的作用機(jī)制與抑制平滑肌細(xì)胞的增殖有關(guān)。

據(jù)報(bào)道，調(diào)控細(xì)胞周期也是控制細(xì)胞增殖的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一[8-9]。本試驗(yàn)采用5 ng/ml TNF-α誘導(dǎo)A7r5細(xì)胞增殖，同時(shí)用不同質(zhì)量濃度的吲哚-2，3-二酮進(jìn)行干預(yù)，觀測(cè)其對(duì)A7r5細(xì)胞周期的影響。結(jié)果表明，TNF-α可增加A7r5 細(xì)胞S 期和G2/M期的比例，即促進(jìn)A7r5 細(xì)胞的增殖。經(jīng)吲哚-2，3-二酮干預(yù)后，部分G2/M 期、S 期細(xì)胞比例下降，使細(xì)胞增殖周期停滯于G0/G1期，從而抑制A7r5細(xì)胞的增殖。這提示吲哚-2，3-二酮抑制A7r5細(xì)胞增殖的作用可能與阻止細(xì)胞周期有關(guān)。

本文從細(xì)胞水平初步研究表明，吲哚-2，3-二酮對(duì)TNF-α所致血管平滑肌細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期具有抑制作用，為進(jìn)一步尋找天然低毒的抗動(dòng)脈粥樣硬化藥物提供了參考。

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