翟慧娟，朱明明

（河南省新鄉(xiāng)市新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院，新鄉(xiāng)453003）

皮膚的衰老見于多種疾病，也與自然的生理過程和非自然的因素有關(guān)，預(yù)防和延緩皮膚衰老一直是醫(yī)學(xué)界研究的焦點(diǎn)。運(yùn)用祖國(guó)的傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)治療衰老也備受臨床各科的青睞[1-2]。目前中藥注射液穴位注射抗衰老的研究卻鮮有報(bào)道，本文在制備小鼠衰老模型的基礎(chǔ)上，應(yīng)用黃芪注射液足三里穴位注射法，觀察小鼠血液與皮膚中的超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）及羥脯氨酸（Hydroproline，HYP）含量的變化，探討黃芪穴位注射在延緩皮膚衰老過程中的抗氧化干預(yù)作用，以期為臨床預(yù)防皮膚衰老提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)BALB/c-nu/nu 小鼠，雌性，體質(zhì)量20～22 g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，合格證號(hào)0066091，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（京）2007-0001，標(biāo)準(zhǔn)飼料飼養(yǎng)。

1.1.2 主要器材 Biofugel5R 低溫離心機(jī)；UV-1700 分光光度計(jì)；DY89-1 勻漿器；WH-861 渦旋混勻器型號(hào)（WH－861）；JA-1003 電子分析天平。

1.1.3 主要試劑 SOD、MDA、HYP 測(cè)定試劑盒，均購(gòu)自南京建成生物工程公司。黃芪注射液由石家莊神威藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字Z13020999。D-半乳糖（D－galactose）系上?；瘜W(xué)試劑二廠生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 分組與造模 將40 只小鼠隨機(jī)分為模型組、黃芪組、生理鹽水組和對(duì)照組，每組10 只。前3組小鼠于背部正中線兩側(cè)處用脫毛膏脫毛，面積約1.5 cm×1.5 cm 大小, 然后生理鹽水清洗。參照文獻(xiàn)[3]制備D-半乳糖致小鼠亞急性衰老模型：每天于小鼠頸背部皮下注射D-半乳糖（125 mg/kg），連續(xù)注射42 d。在造模21 d 后，黃芪組于小鼠足三里穴位注射黃芪注射液,每側(cè)穴位各注射0.01 mL[4-5]；生理鹽水組在同樣穴位注射等量生理鹽水；模型組和對(duì)照組不進(jìn)行穴位注射。注射過程均按無菌操作進(jìn)行，連續(xù)注射21 d 后處死動(dòng)物，取材備用。

1.2.2 動(dòng)物取血 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)腹主動(dòng)脈采血，每只取3～5 mL，放置10 min 后離心（3 000 轉(zhuǎn)/min，10 min）。移取血漿1 mL 備用樣品,按照試劑盒說明書測(cè)定小鼠血漿SOD 活性和血漿MDA 及HYP 含量，SOD 采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定，MDA 和HYP 采用硫代巴比妥法測(cè)定。

1.2.3 制備皮膚組織勻漿 動(dòng)物處死前1 d 脫毛，用10%Na2S 溶液涂于每組小鼠兩肩胛至兩髂骨之間背部皮膚，第2 天按3.5 mL/kg 腹腔注射10%水合氯醛麻醉，然后剪下動(dòng)物背部脫毛后的皮膚，鋪平后打孔器對(duì)稱取下4 塊皮膚，每塊直徑約1.4 cm左右，預(yù)冷生理鹽水漂洗，除去皮下脂肪和結(jié)締組織，眼科小剪剪碎組織塊，倒入勻漿管中，用電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)，在冰水中進(jìn)行操作，要反復(fù)凍融3 次，使細(xì)胞內(nèi)容物完全游離于液相之中，用冰凍生理鹽水制成10%的組織漿液，置于-70 ℃冰箱備用。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行資料數(shù)據(jù)分析，各組間比較采用t 檢驗(yàn)，若各組方差不齊時(shí)，用Dunnett′s C 法做兩兩比較，P＜0.05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4 組小鼠血清中SOD 活性以及MDA 和HYP含量變化 見表1。

表1 小鼠血清中SOD 活性與HYP 和MDA 含量的變化比較 （n＝10,x±s）

2.2 4 組小鼠皮膚組織中SOD 活性以及MDA 和HYP 含量變化 見表2。

表2 小鼠皮膚SOD 活性以及MDA 和HYP 的含量變化（n＝10,x±s）

從表1、2 中可以看出：血清與皮膚組織中的變化基本一致，模型組小鼠血清與皮膚組織中SOD 活性和HYP 含量明顯低于對(duì)照組（P＜0．01）；MDA 明顯高于對(duì)照組（P＜0．01）；黃芪組小鼠血清與皮膚組織中SOD 活性和HYP 含量明顯高于模型組（P＜0．01）；MDA 明顯低于模型組（P＜0．01）。生理鹽水組小鼠血清與皮膚組織中SOD 活性和HYP 含量明顯高于模型組（P＜0．05）；MDA 明顯低于模型組（P＜0．05）。

3 討論

衰老與抗衰老一直是當(dāng)今醫(yī)學(xué)界討論與研究的熱點(diǎn)問題之一，探求有效的抗衰老中藥也是一個(gè)重要的醫(yī)學(xué)課題。黃芪為豆科植物膜莢黃芪，具有抗衰老、抑制細(xì)胞過度凋亡[6]，提高機(jī)體免疫力、抗氧化和清除自由基[7]的作用。機(jī)體的衰老與自由基有著密切關(guān)系，隨著年齡的增長(zhǎng)，機(jī)體抗氧化酶活性逐漸下降，使自由基不能完全被清除，其機(jī)體的損傷作用不斷積累，進(jìn)而引起皮膚衰老[8]。SOD 可以消除體內(nèi)自由基，使機(jī)體免受損傷，如果體內(nèi)SOD減少，就會(huì)導(dǎo)致自由基增多，并攻擊細(xì)胞膜不飽和脂肪酸，使其氧化和過氧化形成MDA，后者通過鏈?zhǔn)椒磻?yīng)引起細(xì)胞的代謝障礙，最終死亡。因此SOD反映了體內(nèi)自由基的清除情況，MDA 反映了體內(nèi)細(xì)胞的受損程度。SOD、MDA 與機(jī)體的抗氧化能力及自由基的清除密切相關(guān)[9]。黃芪注射液穴位注射能否延緩皮膚的衰老？筆者建立了小鼠衰老模型并進(jìn)行了該方面的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：黃芪組與模型組比較皮膚中SOD 的活性和HYP 的含量均明顯增加，MDA 明顯降低。

HYP 是一種主要存在于膠原纖維和膠原蛋白中的非必需氨基酸，其含量相對(duì)恒定，是檢測(cè)機(jī)體膠原代謝的重要指標(biāo)[10]。HYP 的含量可以間接反映出真皮內(nèi)膠原蛋白含量的變化[11]，也是衡量皮膚衰老的指標(biāo)之一，HYP 的減少是皮膚老化的主要表現(xiàn)[12-13]。本研究中黃芪組小鼠血液中的SOD、MDA 和HYP變化與皮膚改變趨勢(shì)一致，推測(cè)黃芪注射液加上穴位注射具有延緩皮膚衰老的作用，其機(jī)制可能是增強(qiáng)了機(jī)體免疫功能，提升了抗氧化能力，清除了體內(nèi)過剩的自由基[14]。這為祖國(guó)的中醫(yī)中藥在治療皮膚衰老的應(yīng)用上又提供了新的佐證和科學(xué)依據(jù)。

同樣本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，生理鹽水組小鼠血清和皮膚組織中SOD 活性及HYP 含量較模型組明顯增高，同時(shí)MDA 含量明顯下降。這一現(xiàn)象提示足三里的針刺作用同樣也可以延緩皮膚的衰老過程，就其功能而論較黃芪略顯遜色。

筆者采用D-半乳糖（D－galactose）制作小鼠衰老模型，針刺加黃芪注射液注入足三里穴位，有效地提升了皮膚中SOD 活性和HYD 含量，也即增加了皮膚的抗氧化能力，同時(shí)反映出皮膚的結(jié)締組織中膠原蛋白代謝減緩，合成增加，延緩了皮膚的衰

老[15]。

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