牟靜靜，孟 星，孟盼盼，張雨晴，孫 莉

中藥腦脈泰是由紅參、三七、當(dāng)歸、丹參等組成的中藥制劑，具有益氣活血、化瘀通絡(luò)之功效。文獻(xiàn)研究證明腦脈泰對慢性腦缺血致血管性癡呆(VD)大鼠的學(xué)習(xí)記憶具有保護(hù)意義，可能通過以下幾個方面的作用機(jī)制:(1)提高腦組織中乙酰膽堿的含量;(2)降低VD 大鼠的血液黏度［1］，增加海馬局部腦血流量［2］;(3)減輕炎癥反應(yīng)，提高腦組織抗氧化能力［3］;(4)抑制海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡［4］。

腦脈泰對血管性癡呆的保護(hù)作用的確切作用機(jī)制尚未完全明了。本實驗通過建立2VO 大鼠模型，利用Morris 水迷宮和免疫組化等方法研究慢性腦缺血后大鼠的認(rèn)知功能、海馬CA1區(qū)神經(jīng)元變化、NGF和GFAP 的表達(dá)以及給予中藥腦脈泰后的影響，進(jìn)一步探討中藥腦脈泰對慢性腦缺血大鼠的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 健康雄性Wistar 大鼠60 只，由吉林大學(xué)實驗動物中心提供，體重250～300 g。

1.2 試劑與儀器 中藥腦脈泰為腦脈泰膠囊內(nèi)容物，由桂林三金藥業(yè)提供(批號:130904);兔抗鼠NGF 和兔抗鼠GFAP 購自武漢博士德生物公司(產(chǎn)品編號分別為3574102 和11cm28)，DAB 辣根過氧化物酶顯色試劑盒購自碧云天生物公司(產(chǎn)品編號P0202)。辣根過氧化物酶HRP 標(biāo)記羊抗兔二抗IgG 購自Jackson ImmunoResearch(產(chǎn)品編號:111-035-003)，動物運(yùn)動和行為分析系統(tǒng)購自荷蘭NOLDUS 公司(貨號:PS-M)。熒光顯微鏡購自日本(型號OLYMPUS-BX51)。

1.3 實驗分組 所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w 后進(jìn)行Morris 水迷宮預(yù)實驗篩選48 只合格大鼠，隨機(jī)分成假手術(shù)組、慢性腦缺血模型組、腦脈泰高劑量組、腦脈泰低劑量組，每組各12 只。

1.4 制備動物模型及給藥 采用雙側(cè)頸總動脈永久結(jié)扎法(2-VO)制備慢性腦缺血模型。大鼠術(shù)前12 h 禁食，自由飲水。用10% 水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔注射麻醉大鼠。仰臥固定，頸前部去毛消毒后沿頸正中切開，鈍性分離皮下組織，于切口正下方的斜方肌與氣管夾角處可見頸總動脈搏動。分離頸總動脈，以“4”號絲線雙重結(jié)扎。術(shù)中動作輕柔，避免鉗夾和過分牽拉迷走神經(jīng)，注意無菌原則。行間斷縫合組織和皮膚。假手術(shù)組動物手術(shù)過程同模型組，頸總動脈只分離不結(jié)扎。術(shù)中及術(shù)后注意大鼠保暖。術(shù)后連續(xù)3 d 給予腹腔注射青霉素以消毒傷口及周圍皮膚，防止切口感染。造模術(shù)后3 d 至術(shù)后45 d 給藥組給予腦脈泰高劑量和低劑量組灌胃，劑量分別為高劑量組2.24g/kg，低劑量組0.56 g/kg，灌胃體積為1.5 ml/只，模型組和假手術(shù)組給予相同劑量的生理鹽水，每周稱取大鼠體重調(diào)整給藥量。連續(xù)灌胃6 w。

1.5 Morris 水迷宮 應(yīng)用Morris 水迷宮對大鼠進(jìn)行學(xué)習(xí)記憶能力的測定。Morris 水迷宮實驗分為兩部分:(1)定位航行實驗:用于測量大鼠對水迷宮學(xué)習(xí)和記憶的獲取能力。實驗歷時6 d，1 d 讓大鼠自由游泳2 min;從2 d 起，每天下午訓(xùn)練4 次(每個象限各1 次)。訓(xùn)練時每個象限隨機(jī)選擇一個入水點(diǎn)，將大鼠面向池壁放入水中，系統(tǒng)自動記錄大鼠尋找并爬上平臺時所需時間(逃避潛伏期)及運(yùn)動軌跡，每次訓(xùn)練間隔為20 min。如果大鼠在120 s內(nèi)未找到平臺，須將其引至平臺，這時潛伏期計為120 s。(2)空間搜索實驗:在6 d 第5 次訓(xùn)練時撤除水下平臺，選擇同一入水點(diǎn)將大鼠面向池壁放入水中，系統(tǒng)自動記錄其在120 s 內(nèi)跨過原平臺相應(yīng)位置的次數(shù)及持續(xù)時間。

1.6 腦組織病理檢測及免疫組織化學(xué)測定

1.6.1 腦組織固定 水迷宮實驗結(jié)束后，大鼠禁食12 h 以上，10%水合氯醛進(jìn)行腹腔注射麻醉大鼠。迅速開胸充分暴露胸腔，自心尖插入灌注針頭到主動脈根部，剪掉右心耳，灌注生理鹽水200 ml至流出液體澄清后再灌注4%多聚甲醛200 ml 進(jìn)行內(nèi)固定，待大鼠肢體僵硬，肝臟發(fā)白，則灌流成功。斷頭取大腦，留取海馬和額葉放入4%多聚甲醛固定24 h 以上。對腦組織標(biāo)本石蠟包埋后從前往后冠狀位連續(xù)切片，每片約5 μm。

1.6.2 蘇木精-伊紅(HE)染色 石蠟切片常規(guī)脫蠟:二甲苯(I)、二甲苯(II)各10 min，轉(zhuǎn)移至100%乙醇(I)、100%乙醇(II)、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇各2 min，然后蒸餾水沖洗2 min。蘇木精染色5～10 min，自來水沖洗多余染色液約1～3 s。1%鹽酸乙醇分化1～3 s，自來水沖洗10～15 min。伊紅染色30 s～3 min。常規(guī)脫水，經(jīng)80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、100%乙醇(I)、100%乙醇(II)脫水各1 min，二甲苯(I)、二甲苯(II)透明各1 min，中性樹膠封片，鏡下觀察。

1.6.3 免疫組織化學(xué)染色 NGF 和GFAP 免疫組化染色采用SP 法:常規(guī)脫蠟，3%H2O2/甲醇室溫孵育10 min，消除內(nèi)源性過氧化物酶PBS 漂洗3次，每次5 min。將組織切片置于10 mmol/L、pH6.0的檸檬酸鈉緩沖液中98 ℃左右10～15 min，冷卻后反復(fù)1～2 次，自然冷卻30 min。5%BSA 阻斷非特異性抗體，37℃濕盒孵育20 min。滴加一抗，分別為NGF(1∶100)、GFAP(1∶100)，4℃過夜。PBS 漂洗3 次，每次5 min。滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗IgG，37℃濕盒孵育40 min。PBS 漂洗3 次，每次5 min。DAB 顯色，蒸餾水充分沖洗。蘇木精復(fù)染。酒精梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。鏡下觀察。免疫織化對照組不加一抗，用PBS 代替，其余步驟同前。

1.7 圖像采集和統(tǒng)計學(xué)處理 切片在日本OLYMPUS-BX51 顯微鏡下觀察結(jié)果，每張切片在高倍鏡下隨機(jī)選擇3 個視野，利用Image-Pro plus 6.0 專業(yè)圖像分析軟件進(jìn)行分析，取平均光密度值OD=IOD/area(統(tǒng)計區(qū)域內(nèi)陽性物質(zhì)的光密度值總量/有效統(tǒng)計區(qū)域的面積)。并取其平均值作為該只大鼠測量結(jié)果的最終值。數(shù)據(jù)以±s 表示，所有結(jié)果采用SPSS17.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，P＜0.05時差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腦脈泰對慢性腦缺血大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響 Morris 水迷宮實驗顯示，在定位航行試驗中，模型組與假手術(shù)組相比，隨著訓(xùn)練次數(shù)的增加，兩組之間差異具有顯著性。經(jīng)過水迷宮訓(xùn)練后，與模型組相比，高劑量和低劑量組大鼠潛伏期時間明顯縮短(P＜0.01)，與假手術(shù)組相比，低劑量組具有顯著差異(P＜0.05)，高劑量組潛伏期時間沒有顯著差異。腦脈泰改善慢性腦缺血大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，給予高劑量時作用更顯著(見表1)。

定位航行試驗5 d 撤除原平臺進(jìn)行空間探索實驗，與假手術(shù)組相比，模型組跨越原平臺所在象限的時間明顯縮短(P＜0.01)，且跨越次數(shù)明顯減少(P＜0.01)。與模型組相比，腦脈泰高、低劑量組大鼠跨越原平臺所在象限的時間明顯延長(P＜0.01)，而跨越次數(shù)明顯增加(P＜0.01)。腦脈泰可增強(qiáng)慢性腦缺血大鼠的空間記憶能力(見表2)。

2.2 腦脈泰對慢性腦缺血大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的影響 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠海馬錐體細(xì)胞壞死脫落明顯，層次紊亂，細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清晰，大量細(xì)胞出現(xiàn)核固縮和碎裂現(xiàn)象。腦脈泰給藥組大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞形態(tài)、層次、排列、細(xì)胞核染色均較模型組有明顯改善(見圖1)。

2.3 免疫組化結(jié)果

2.3.1 腦脈泰對慢性腦缺血大鼠海馬CA1區(qū)NGF 表達(dá)的影響 免疫組織化學(xué)染色顯示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠海馬CA1區(qū)NGF 表達(dá)明顯減少(P＜0.01)，與模型組相比，腦脈泰給藥低劑量和高劑量組都增加NGF 的表達(dá)(P＜0.05 和P＜0.01)，與假手術(shù)組相比，高劑量組沒有顯著差異(見圖2、表3)。

2.3.2 腦脈泰對慢性腦缺血大鼠GFAP 表達(dá)的影響 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腦組織GFAP 表達(dá)增加(P＜0.01)。與模型組相比，腦脈泰低、高劑量都能減低GFAP 的表達(dá)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。與假手術(shù)組相比，腦脈泰高劑量的作用顯著，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)(見圖3、表3)。

圖1 腦脈泰對慢性腦缺血大鼠海馬CA1區(qū)病理形態(tài)的影響(HE 染色)

圖2 腦脈泰對慢性腦缺血大鼠海馬CA1區(qū)NGF 表達(dá)的影響

圖3 腦脈泰對慢性腦缺血大鼠腦組織GFAP 表達(dá)變化

表1 腦脈泰對慢性腦缺血大鼠定位航行實驗潛伏期時間的影響(±s，s)

表1 腦脈泰對慢性腦缺血大鼠定位航行實驗潛伏期時間的影響(±s，s)

與假手術(shù)組相比* P＜0.05，＊＊P＜0.01;與模型組相比△P＜0.05，△△P＜0.01

表2 腦脈泰對慢性腦缺血大鼠空間探索實驗的影響(±s)

表2 腦脈泰對慢性腦缺血大鼠空間探索實驗的影響(±s)

與假手術(shù)組相比* P＜0.05，＊＊P＜0.01;與模型組相比△P＜0.05，△△P＜0.01

表3 腦脈泰對慢性腦缺血大鼠NGF、GFAP 表達(dá)的影響(±s)

表3 腦脈泰對慢性腦缺血大鼠NGF、GFAP 表達(dá)的影響(±s)

與假手術(shù)組相比* P＜0.05，＊＊P＜0.01;與模型組相比△P＜0.05，△△P＜0.01.

3 討論

慢性腦缺血是神經(jīng)系統(tǒng)一種常見的病理生理狀態(tài)，由長期腦灌注不足引起，可出現(xiàn)能量代謝障礙、氧化應(yīng)激、神經(jīng)遞質(zhì)改變、神經(jīng)元缺失等變化，同時伴有大量膠質(zhì)細(xì)胞增生，是阿爾茲海默病和血管性癡呆等許多與年齡相關(guān)性疾病的共同的病理生理過程［5］。慢性腦缺血導(dǎo)致的血管性癡呆以持久性或進(jìn)展性認(rèn)知功能障礙為主要特點(diǎn)，表現(xiàn)為學(xué)習(xí)記憶能力下降。我們前期實驗［6］已證實，2VO 術(shù)后大鼠海馬區(qū)及額葉皮質(zhì)腦血流量的下降，大鼠出現(xiàn)進(jìn)行性認(rèn)知障礙。由于海馬和額葉皮質(zhì)特殊的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，成為腦缺血時受損最敏感的區(qū)域。海馬與學(xué)習(xí)和記憶有著密切關(guān)系，尤其是CA1區(qū)細(xì)胞參與信息的加工、強(qiáng)化和傳遞，其受損導(dǎo)致進(jìn)展性認(rèn)知功能障礙［7］。所以本實驗中采用2-VO 制備大鼠血管性癡呆模型。水迷宮是Morris 在1984 年發(fā)明的，隨后被實驗者用來評價動物的空間學(xué)習(xí)和記憶能力［8］。前人實驗證明Morris 水迷宮實驗時大鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降的程度與海馬神經(jīng)元密度減低呈高度相關(guān)。本實驗結(jié)果顯示在Morris 水迷宮實驗時2-VO 模型組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力與假手術(shù)組相比顯著下降，假手術(shù)組大鼠在2 d 潛伏期時間較1 d 明顯縮短，后幾天趨于穩(wěn)定，在軌跡圖上表現(xiàn)為直線式運(yùn)動軌跡。而模型組一直是迂回式的運(yùn)動軌跡，潛伏期時間呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢，且下降幅度不如假手術(shù)組。HE 染色觀察顯示2-VO 模型組大鼠海馬錐體細(xì)胞明顯缺失，與前人文獻(xiàn)報道一致。而腦脈泰給藥高、低劑量組大鼠認(rèn)知功能得到不同程度的恢復(fù)，通過HE 染色觀察腦脈泰對于慢性腦缺血后海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)破壞具有保護(hù)作用，從而保護(hù)了學(xué)習(xí)記憶能力。

NGF 作為最早發(fā)現(xiàn)的腦源性神經(jīng)生長因子，在腦內(nèi)廣泛分布于海馬、大腦皮質(zhì)，是神經(jīng)系統(tǒng)最重要的生物活性分子之一，不僅在生理狀態(tài)下對中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有營養(yǎng)作用，而且在腦缺血時對神經(jīng)再生、突觸重構(gòu)和損傷修復(fù)發(fā)揮重要的作用［9，10］。NGF 減少腦缺血時神經(jīng)細(xì)胞損傷的機(jī)制可能與抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡［11］、清除氧自由基、穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平及拮抗興奮性毒性［12］有關(guān)。本實驗中發(fā)現(xiàn)在慢性腦缺血后海馬CA1區(qū)NGF 的表達(dá)減少，腦脈泰給藥后可以逆轉(zhuǎn)這種減少，并且腦脈泰高劑量組的NGF 的表達(dá)幾乎達(dá)到正常水平，與假手術(shù)組比較沒有顯著差異。腦脈泰可能通過提高海馬CA1區(qū)NGF 的表達(dá)來發(fā)揮保護(hù)海馬神經(jīng)元的作用。由于本實驗未觀察不同時間段NGF 表達(dá)的變化，所以腦脈泰給藥后NGF 表達(dá)的時間依賴性及神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制需要進(jìn)一步探索。

腦缺血時，神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增生，而GFAP 作為星形膠質(zhì)細(xì)胞微絲的結(jié)構(gòu)蛋白，是其標(biāo)志性蛋白之一，反映了星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化狀態(tài)。星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化情況與神經(jīng)系統(tǒng)的損傷程度相關(guān)，輕度損傷時星形膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)變化可逆轉(zhuǎn)，但在重度損傷時則不能［13］。星形膠質(zhì)細(xì)胞活化在腦缺血中具有雙重作用:一方面產(chǎn)生神經(jīng)營養(yǎng)因子，促進(jìn)損傷神經(jīng)元的修復(fù);另一方面過度的膠質(zhì)化可形成物理屏障，干擾髓鞘和軸索的再生［14］，加重腦缺血損傷。活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌的一些細(xì)胞因子在腦損傷早期起保護(hù)作用，后期形成膠質(zhì)瘢痕后則不能發(fā)揮積極作用。本研究發(fā)現(xiàn)，慢性腦缺血2-VO 模型組大鼠腦組織的GFAP 表達(dá)明顯增加，說明慢性腦缺血存在星形膠質(zhì)細(xì)胞活化。腦脈泰給藥高、低劑量組都能不同程度的降低GFAP 的表達(dá)，減少星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化，低劑量組的作用與假手術(shù)組相比沒有明顯差別，幾乎達(dá)到正常水平。腦脈泰對慢性腦缺血大鼠的認(rèn)知功能具有保護(hù)作用，可能通過提高NGF 表達(dá)和減少慢性腦缺血時星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化來發(fā)揮腦保護(hù)的作用。

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