楊程程，韋俊杰，唐玉蘭，鄭明華，韋云飛

多發(fā)性硬化(Multiple Sclerosis，MS)是以中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)慢性炎性脫髓鞘為主要特征的自身免疫性疾病。實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)是研究MS 常用的動(dòng)物模型。我們之前的研究發(fā)現(xiàn)，載脂蛋白E(apolipoprotein E，apoE)可以減輕EAE 髓鞘和軸突的損傷［1］，抑制Th1 和Th17 細(xì)胞的免疫應(yīng)答［2］，下調(diào)CD4+T 細(xì)胞的表達(dá)［3］，對(duì)EAE 小鼠有神經(jīng)保護(hù)作用。水通道蛋白4(aquaporins 4，AQP4)和膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acdic protein，GFAP)均表達(dá)于CNS 星形膠質(zhì)細(xì)胞，與星形膠質(zhì)細(xì)胞水腫、增生有關(guān)，但apoE 對(duì)EAE 小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP4、GFAP 的表達(dá)是否有影響?作用機(jī)制如何?目前尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究采用apoE基因敲除的C57BL/6 小鼠及野生型C57BL/6 小鼠建立EAE 模型，對(duì)神經(jīng)功能缺損情況進(jìn)行評(píng)分，觀察大腦、脊髓病理改變及AQP4、GFAP 的表達(dá)，從而探索apoE 對(duì)EAE 病灶星形膠質(zhì)細(xì)胞的作用及其機(jī)制，以期為MS 的治療提供新思路。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 標(biāo)準(zhǔn)化飼養(yǎng)的6～8 w 雌性的apoE 基因敲除C57BL/6 小鼠及野生型C57BL/6 小鼠，體重18～20 g，北京華阜康生物科技股份有限公司提供。20 只野生型C57BL/6 小鼠隨機(jī)分成普通EAE 組及正常對(duì)照組，每組各10 只;10只apoE 基因敲除小鼠作為apoE-/-EAE 組。

1.1.2 主要試劑 髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(MOG35-55，純度＞95%，上海生工生物工程有限公司);百日咳毒素(PTX)、完全弗氏佐劑(CFA)(Sigma 公司);卡介苗(Difco 公司);兔抗小鼠AQP4 多克隆抗體(武漢博士德有限公司);兔抗小鼠GFAP多克隆抗體、SP 法免疫組化試劑盒、DAB 顯色試劑盒(北京中杉金橋有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 制備完全抗原及建立EAE 模型 用0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液將MOG35-55 稀釋成2 mg/ml，與等量含6 mg/ml 卡介苗的CFA 充分混合，全玻璃注射器抽打至呈油包水乳狀，制成完全抗原。普通EAE 組及apoE-/-EAE 組分別于小鼠背部皮下多點(diǎn)注射完全抗原0.2 ml/只，正常對(duì)照組以等量生理鹽水代替。免疫當(dāng)天為0 d，分別于0、2 d給apoE-/-EAE 組及普通EAE 組小鼠腹腔注射PTX0.5 g/次。

1.2.2 神經(jīng)功能缺損評(píng)分 免疫后每天上午由同一人對(duì)小鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分，測(cè)量體重并記錄。采用7 分評(píng)分法。0 分:不發(fā)病;1 分:尾巴半癱;2 分:尾巴全癱;3 分:步態(tài)異常;4 分:后肢輕癱;5 分:后肢重癱;6 分:前肢受累;7 分:瀕死或死亡。

1.2.3 解剖及病理染色 免疫誘導(dǎo)后35 d，麻醉小鼠，經(jīng)左心室插管灌注生理鹽水，繼以4%多聚甲醛緩沖液灌注。斷頭，分離大腦和脊髓，4%多聚甲醛4℃中固定24 h，逐級(jí)予乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，連續(xù)切片4 μm，行HE 染色，觀察病理學(xué)變化。

1.2.4 免疫組化 取上述蠟塊行4 μm 連續(xù)切片，按SP 法免疫組化試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，顯微鏡下觀察大腦和脊髓AQP4、GFAP 的表達(dá)，陰性對(duì)照用PBS 取代一抗。細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)呈黃色或棕黃色為陽(yáng)性表達(dá).每只小鼠的大腦和脊髓各取3 張切片，每張切片取互不重復(fù)的5 個(gè)高倍視野(×200 倍)，應(yīng)用Image-proplus 6.0 軟件測(cè)量每個(gè)高倍視野的積分光密度值(IOD)和陽(yáng)性表達(dá)面積(area)，計(jì)算平均積分光密度(IOD/area)。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，正態(tài)計(jì)量資料以±s 表示，非正態(tài)計(jì)量資料以組中值(M)和95%可信區(qū)間(95%CI)表示;兩個(gè)獨(dú)立樣本均數(shù)的比較用成組t 檢驗(yàn)，多組間均數(shù)的比較用單因素方差分析，組間差異用SNK 檢驗(yàn)(方差齊時(shí))或Games-Howell 檢驗(yàn)(方差不齊時(shí))，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 發(fā)病情況 apoE-/-EAE 組和普通EAE 組于免疫后11 d 相繼發(fā)病，癥狀隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸加重。兩組潛伏期比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。臨床功能缺損評(píng)分峰值apoE-/-EAE 組顯著高于普通EAE 組(P＜0.05)(見(jiàn)表1)。正常對(duì)照組無(wú)小鼠發(fā)病，活動(dòng)度正常。

2.2 HE 染色 apoE-/-EAE 組和普通EAE 組小鼠大腦、脊髓的小血管周?chē)l(fā)現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，典型者呈“袖套樣”改變，其中apoE-/-EAE 組的上述病理學(xué)改變明顯重于普通EAE 組(見(jiàn)圖1)。正常對(duì)照組大腦和脊髓未見(jiàn)異常。

表1 臨床癥狀觀察(M，95%CI)

表2 AQP4 在小鼠大腦、脊髓中的表達(dá)(±s)

表2 AQP4 在小鼠大腦、脊髓中的表達(dá)(±s)

與普通EAE 組比較* P＜0.05;與正常對(duì)照組比較△P＜0.05

表3 GFAP 在小鼠大腦、脊髓中的表達(dá)(±s)

與普通EAE 組比較* P＜0.05;與正常對(duì)照組比較△P＜0.05

2.3 各組AQP4 的表達(dá)比較 通過(guò)免疫組化測(cè)定各組織AQP4 的平均積分光密度，發(fā)現(xiàn):apoE-/-EAE 組和普通EAE 組大腦、脊髓中AQP4 的表達(dá)量均高于正常對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);apoE-/-EAE 組大腦和脊髓AQP4 表達(dá)量均高于普通EAE 組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(見(jiàn)表2、圖2)。

2.4 各組GFAP 的表達(dá)比較 通過(guò)免疫組化測(cè)定各組織GFAP 的平均積分光密度，發(fā)現(xiàn):apoE-/-EAE 組和普通EAE 組大腦、脊髓中GFAP 的表達(dá)量均高于正常對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);apoE-/-EAE 組大腦和脊髓GFAP 表達(dá)量均高于普通EAE 組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(見(jiàn)表3、圖3)。

3 討論

星形膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)元的衛(wèi)星細(xì)胞，對(duì)神經(jīng)元起支持作用，參與血腦屏障(blood-brain barrier，BBB)的形成。apoE 在CNS 主要由星形膠質(zhì)細(xì)胞合成，主要功能是調(diào)節(jié)CNS 脂類(lèi)代謝，此外還可以通過(guò)下調(diào)中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)、減輕氧化應(yīng)激等機(jī)制，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用［4］。Chiasserini 等報(bào)道，apoE在MS 患者中有不同程度的下降［5］;而且我們前期研究發(fā)現(xiàn)，apoE 擬肽可以減輕EAE 的臨床癥狀和炎性浸潤(rùn)［2］。本研究結(jié)果顯示，apoE-/-EAE 組較普通EAE 組神經(jīng)功能缺損加重，病理檢查可見(jiàn)血管周?chē)仔约?xì)胞浸潤(rùn)增多，與國(guó)內(nèi)外報(bào)道相符。進(jìn)一步證明了apoE 缺乏可加重EAE 對(duì)小鼠造成的神經(jīng)功能損害。

AQP4 是水通道蛋白家族的一員，在CNS 表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞的足突，主要功能是介導(dǎo)水分子轉(zhuǎn)運(yùn)。本研究結(jié)果顯示，AQP4 在普通EAE 組的表達(dá)較正常對(duì)照組顯著增高，與Miyamoto 的報(bào)道一致［6］，表明EAE 中存在星形膠質(zhì)細(xì)胞水腫。我們還發(fā)現(xiàn)，與普通EAE 組相比，apoE-/-EAE 組中AQP4 表達(dá)水平顯著升高，提示apoE 缺乏可以加重EAE 星形膠質(zhì)細(xì)胞水腫。AQP4 有介導(dǎo)水跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)和促進(jìn)前炎性細(xì)胞因子分泌的特性［7］，而apoE 缺乏造成了AQP4 的表達(dá)升高。因此我們推測(cè)，高表達(dá)的AQP4 一方面通過(guò)正反饋調(diào)節(jié)，促使更多水分子進(jìn)入星形膠質(zhì)細(xì)胞，使其體積增大、內(nèi)壓升高，進(jìn)而形成細(xì)胞毒性水腫，甚至導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞破裂;另一方面也增強(qiáng)了促炎性細(xì)胞因子的分泌。加之a(chǎn)poE 缺乏會(huì)增加EAE 小鼠基質(zhì)金屬蛋白酶-9 活性［8］，有可能影響B(tài)BB 的功能，這些作用共同加重了EAE 星形膠質(zhì)細(xì)胞的水腫。

GFAP 為星形膠質(zhì)細(xì)胞的骨架蛋白，其表達(dá)的高低可反映星形膠質(zhì)細(xì)胞增生及壞死的程度。有研究報(bào)道，在MS/EAE 病灶中心和邊緣，有反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞聚積［9］。反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞在MS/EAE 中發(fā)揮雙重作用:雖然它在血管周?chē)纬神：蹣悠琳?，限制炎癥細(xì)胞侵入CNS，但病灶周?chē)z質(zhì)過(guò)多，也阻礙了少突膠質(zhì)細(xì)胞遷移至病灶產(chǎn)生新髓鞘;并且小膠質(zhì)細(xì)胞隨之激活，可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞二次損傷。可見(jiàn)，膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)多可惡化EAE 病情。本研究發(fā)現(xiàn)，GFAP 在普通EAE 組的表達(dá)較正常對(duì)照組顯著增高，與國(guó)內(nèi)外報(bào)道一致［10］，表明EAE 中有星形膠質(zhì)細(xì)胞增生。我們還發(fā)現(xiàn)，與普通EAE 組相比，apoE-/-EAE 組GFAP 表達(dá)水平更高，提示apoE缺乏加重了EAE 反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生，增多的星形膠質(zhì)細(xì)胞易形成膠質(zhì)瘢痕，惡化EAE 病情。研究表明，低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(LDLR-related protein，LRP)作為apoE 的配體之一，表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞膜，與膠質(zhì)細(xì)胞的激活有關(guān)［11］。我們推測(cè)，apoE 與星形膠質(zhì)細(xì)胞表面的LRP 結(jié)合，直接阻礙其星形膠質(zhì)細(xì)胞增生;apoE 也可能影響了細(xì)胞因子的分泌，從而間接抑制反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖。另外，AQP4 可以加快星形膠質(zhì)細(xì)胞遷移［6］。我們認(rèn)為apoE 也可能通過(guò)減少AQP4 的生成，使質(zhì)膜的水通透性減弱，從而阻礙星形膠質(zhì)細(xì)胞的遷移，抑制其在病灶周?chē)奂纬赡z質(zhì)瘢痕，改善EAE 病情進(jìn)展。

本研究結(jié)果表明，EAE 中存在星形膠質(zhì)細(xì)胞水腫、增生，apoE 缺乏可以加重EAE 星形膠質(zhì)細(xì)胞的水腫和增生，從而惡化EAE 的病情。因此，本研究的發(fā)現(xiàn)可能成為MS 治療的切入點(diǎn)。但由于MS 星形膠質(zhì)細(xì)胞水腫和增生的形成機(jī)制復(fù)雜，尚需進(jìn)一步研究。

圖2 D:apoE-/-EAE 組大腦;E:普通EAE 組大腦;F:正常對(duì)照組大腦;G:apoE-/-EAE 組脊髓;H:普通EAE 組脊髓;I:正常對(duì)照組脊髓(AQP4 免疫組化染色，×400)

圖3 J:apoE-/-EAE 組大腦;K:普通EAE 組大腦;L:正常對(duì)照組大腦;M:apoE-/-EAE 組脊髓;N:普通EAE 組脊髓;O:正常對(duì)照組脊髓(GFAP 免疫組化染色，×400)

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