徐成成，張鵬飛，丁新生，李文磊，吳明華

缺血性腦血管病占腦血管病的80%～85%［1～3］，是導(dǎo)致人類死亡和殘疾的主要原因，在中國已經(jīng)位居第一位［2］。腦缺血后能激發(fā)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖反應(yīng)和軸突再生、突觸再聯(lián)系的研究報(bào)道，為腦缺血后的再生修復(fù)帶來了希望［4，5］，尋找促進(jìn)神經(jīng)再生修復(fù)的有效途徑是目前研究的熱點(diǎn)。

淫羊藿是傳統(tǒng)中醫(yī)藥里經(jīng)常用的一種補(bǔ)益肝腎藥物，最近的研究發(fā)現(xiàn)，其主要成分淫羊藿苷能夠上調(diào)神經(jīng)生長因子的表達(dá)，促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和神經(jīng)元分化，改善癡呆大鼠記憶功能［6～8］。因此淫羊藿苷在神經(jīng)再生修復(fù)領(lǐng)域具有廣闊的研究前景，但是其是否能促進(jìn)腦缺血后神經(jīng)功能恢復(fù)及通過何種機(jī)制尚未得到有效闡述。PTEN(phosphatase and tensinhomology deleted on chromosome ten)作為一種腫瘤抑制基因，近年來發(fā)現(xiàn)其在神經(jīng)的發(fā)生和神經(jīng)再生過程中起著重要作用，是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育成熟過程中軸突生長和再生能力逐漸下降的一個(gè)非常重要的內(nèi)在控制分子，抑制PTEN 能明顯促進(jìn)成熟神經(jīng)系統(tǒng)再生修復(fù)［9］。GAP-43(Growth associated protein-43)是一種胞膜磷酸蛋白質(zhì)，是一種神經(jīng)特異性的蛋白質(zhì)，廣泛存在于神經(jīng)組織中，在生長、分化和再生的軸突末端以及突觸前膜含量極高，主要參與神經(jīng)細(xì)胞外生長及突觸發(fā)育形成和神經(jīng)細(xì)胞再生［10，11］。

本實(shí)驗(yàn)旨在通過觀察淫羊藿苷對(duì)胡須體覺皮質(zhì)局灶性腦缺血大鼠功能的恢復(fù)以及腦梗死周邊區(qū)組織PTEN 和GAP-43 蛋白的表達(dá)情況，以探究淫羊藿苷對(duì)腦缺血后神經(jīng)再生修復(fù)的影響及可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年雄性SD 大鼠24 只，體重300±10 g，年齡2.5～3 m。由江蘇省中醫(yī)院藥理實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 主要試劑及儀器 10%水合氯醛;2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC);磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.4);SDS、Tween-20、過硫酸胺、TEMED，丙烯酰胺，甲叉雙丙烯酰胺，PMSF，甘氨酸，Tris(Sigma，St Louis，MO，USA);PVDF 膜(BioRad，Hercules，CA，USA);最適切割溫度復(fù)合物(OCT，Sakura Finetek USA Inc，Torrance，CA，USA);生理鹽水(0.9%NaCl);兔源抗PTEN(CST，USA);兔源抗P-S6R(CST);鼠源抗GAP43(CST，USA);鼠源抗Actin(santa cruz);辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔、羊抗鼠二抗(santa cruz，USA)。解剖顯微鏡;垂直電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀;凝膠成像系統(tǒng);恒冷振動(dòng)切片機(jī)(Ultapro 5000，St Louis，MO，USA);熒光顯微鏡(尼康)。

1.3 動(dòng)物模型制備及分組 參照文獻(xiàn)［12］建立胡須體覺皮質(zhì)局灶性腦梗死模型。大鼠經(jīng)10%水合氯醛400 mg/kg 腹腔注射麻醉后，將動(dòng)物左側(cè)臥位固定于手術(shù)臺(tái)上。顯微鏡下靠近眶后切開右顳側(cè)皮膚及顳肌，鈍性分離肌肉組織，暴露右側(cè)顳骨;手術(shù)電鉆在前囟水平距中線右側(cè)4.1 mm 處(ML+4.1 mm)開一3～4 mm 的顱骨窗，保持硬腦膜完整。11.0 手術(shù)線穿過硬腦膜，結(jié)扎胡須體覺皮質(zhì)周圍2～3 支大腦中動(dòng)脈的分支，同時(shí)結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈10 min，之后用可吸收縫合線縫合皮膚。3 d 后將造模大鼠隨機(jī)分為8 只淫羊藿苷治療組與8 只模型組，8 只假手術(shù)組大鼠做同樣處理，但不結(jié)扎大腦中動(dòng)脈。治療組給予淫羊藿苷灌胃，淫羊藿苷用生理鹽水按10 mg/ml 配制，每天灌胃1 次，每次每只大鼠按10 ml/kg 比例給藥。模型組和假手術(shù)組每天給予等量的生理鹽水灌胃。

1.4 行為學(xué)測定 通過Corner Test 方法［13］，分別于造模前3 d，造模后3 d、給藥后7 d、14 d 和21 d 進(jìn)行行為學(xué)檢測。具體方法為將大鼠放入一個(gè)一端封閉的由兩塊30 cm×20 cm×1 cm 的平板構(gòu)成的30°的夾角，將一塊底16 cm，腰30 cm 的等腰三角形的平板覆蓋于夾角之上，并且在夾角的上半部有15 cm×1 cm 的縫隙(見圖1A)。當(dāng)大鼠進(jìn)入夾角(corner)深部，雙側(cè)的觸須將受到刺激，繼而大鼠將“站立轉(zhuǎn)身”或“貼地轉(zhuǎn)身”(頭部從腹部下方鉆過的屈曲轉(zhuǎn)身)面向夾角的開口端。每只大鼠每次做10 次，計(jì)算左轉(zhuǎn)、右轉(zhuǎn)次數(shù)，常大鼠在進(jìn)行檢測時(shí)，向左向右轉(zhuǎn)身的次數(shù)基本相等，右側(cè)腦缺血大鼠向右側(cè)(病灶側(cè))轉(zhuǎn)身的次數(shù)會(huì)明顯增加。

1.5 Western blotting 檢測 腦缺血后21 d，斷頭處死大鼠并取出梗死區(qū)周邊腦組織，運(yùn)用Western blot 法檢測其PTEN 和GAP-43 蛋白的表達(dá)情況。首先提取組織蛋白，應(yīng)用eppendorf 分光光度計(jì)測出樣品中濃度，用0.01 mol/L PBS(pH=7.4)稀釋所有樣品到4 μg/μl。樣本進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳，轉(zhuǎn)PVDF，放入封閉緩沖液中，室溫封閉1H，后分別進(jìn)行一抗及二抗的孵育:一抗在-4℃冰箱中搖床過夜，取出后用TBST 搖床清洗6 次，每次10 min，之后進(jìn)行二抗孵育，二抗在37℃孵育箱內(nèi)孵育2 h。按試劑盒要求配制化學(xué)發(fā)光試劑，滴加在膜上，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)掃描并分析目的蛋白的表達(dá)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所以數(shù)據(jù)經(jīng)過方差齊性檢驗(yàn)和正態(tài)性檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用±s 表示，采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。相關(guān)圖形采用Graphpad Prism 5 軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果

2.1 淫羊藿苷促進(jìn)腦缺血后功能恢復(fù) 假手術(shù)組和造模組大鼠在手術(shù)前1 d 向左、向右“貼地轉(zhuǎn)身”的幾率接近，均在50%左右。手術(shù)后3 d 淫羊藿苷組與模型組向右側(cè)(損傷同側(cè))轉(zhuǎn)身的次數(shù)較假手術(shù)組明顯增多(P＜0.05)，給藥7 d 后(術(shù)后10 d)淫羊藿苷組大鼠右轉(zhuǎn)次數(shù)開始減少(共10 次夾角實(shí)驗(yàn)及其右轉(zhuǎn)次數(shù)，下同)，而模型組大鼠右轉(zhuǎn)次數(shù)幾乎沒有變化，但二者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);給藥后14 d(術(shù)后17 d)淫羊藿苷組大鼠右轉(zhuǎn)次數(shù)繼續(xù)減少，模型組大鼠右轉(zhuǎn)次數(shù)稍有所減少，二者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);給藥21 d 后(術(shù)后24 d)淫羊藿苷組大鼠右轉(zhuǎn)次數(shù)較模型組大鼠右轉(zhuǎn)次數(shù)明顯減少(P＜0.05)，與假手術(shù)組大鼠基本接近(P＞0.05);假手術(shù)組大鼠不論何時(shí)向左、向右轉(zhuǎn)的幾率均接近(見圖1)。

圖1 Corner Test 檢測結(jié)果

2.2 淫羊藿苷抑制腦缺血后PTEN 蛋白表達(dá)

增加GAP-43 蛋白表達(dá) 給藥21 d 后各組大鼠腦組織PTEN 與GAP-43 蛋白的表達(dá)見圖2。模型組大鼠GAP-43 蛋白表達(dá)較假手術(shù)組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而淫羊藿苷組大鼠GAP-43 蛋白表達(dá)較模型組及假手術(shù)組大鼠均明顯增高(P＜0.05);模型組PTEN 蛋白的表達(dá)較假手術(shù)組下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而淫羊藿苷組PTEN蛋白表達(dá)較模型組及假手術(shù)組大鼠均明顯降低(P＜0.05)。

圖2 給藥后21 d Western blot 檢測結(jié)果

3 討論

目前，對(duì)于腦梗死的治療仍沒有有效的治療手段［14］。溶栓血管再通治療是急性腦梗死最有效和循證醫(yī)學(xué)支持的治療方法，但由于時(shí)間窗的限制，只有極少一部分患者能夠采取這項(xiàng)治療手段［15］。大部分腦梗死患者是不能溶栓而遺留不同程度的神經(jīng)功能缺失，對(duì)于這些患者，唯一長期有效的治療方法就是促進(jìn)神經(jīng)組織再生修復(fù)。

淫羊藿為小檗科(Berberidaceae)淫羊藿屬(Epimedium)植物，其作為藥物運(yùn)用具有很長的歷史，始載于《神內(nèi)本草經(jīng)》，別名仙靈脾。李時(shí)珍在《本草綱目》中記載其功效有“益精氣，堅(jiān)筋骨，實(shí)腰膝，強(qiáng)心力”。淫羊藿主要藥用成分是黃酮類化合物和多糖，淫羊藿總黃酮(total flavonoids of Epimedium，TFE)主要含有淫羊藿苷(Icariine，ICA)和淫羊藿次苷等。吳芹等［6］證實(shí)淫羊藿苷可以上調(diào)海馬組織中BDNF 和TrKBmRNA 的表達(dá)。YAO 等［8］研究發(fā)現(xiàn)淫羊藿總黃酮(EF)可有效的的促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和神經(jīng)元分化。Wu 等［7］通過給老年癡呆模型的老鼠給予淫羊藿苷治療后神經(jīng)再生和神經(jīng)干細(xì)胞活化能力得到改善，其認(rèn)知能力也得到很大改善。但是其是否能促進(jìn)腦缺血后神經(jīng)功能恢復(fù)及通過何種機(jī)制尚未得到有效闡述。

通過神經(jīng)再生機(jī)制促進(jìn)肢體功能恢復(fù)方面的研究已經(jīng)有很多，但目前最具說服力還是抑制PTEN這條途徑。2010 年，何志剛團(tuán)隊(duì)?wèi)?yīng)用類似的方法成功的證明抑制PTEN 活性能夠顯著促進(jìn)脊髓損傷后損傷部位的軸突再生和神經(jīng)功能的恢復(fù)［16］。其進(jìn)一步的研究表明，PTEN 是mTOR 通路的負(fù)性調(diào)節(jié)子，二者的表達(dá)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)發(fā)育過程中呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化。隨著發(fā)育的逐漸成熟，PTEN 表達(dá)逐漸升高，mTOR 表達(dá)逐漸下降，致使神經(jīng)元軸突的生長能力逐漸下降。軸突損傷后進(jìn)一步上調(diào)PTEN表達(dá)，抑制mTOR 活性，阻礙軸突再生。因此，抑制PTEN 后，重新激活mTOR 通路，使成年神經(jīng)系統(tǒng)回到胚胎時(shí)期的生長狀態(tài)，恢復(fù)胚胎時(shí)期的再生能力，從而促使CNS 損傷后再生［17］。類似的，Christie 等也在坐骨神經(jīng)損傷模型中發(fā)現(xiàn)抑制PTEN 能促進(jìn)周圍神經(jīng)軸突的再生能力［18］。由此可見，PTEN 是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育成熟過程中軸突生長和再生能力逐漸下降的一個(gè)非常重要的內(nèi)在控制分子，PTEN 在成年神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)高表達(dá)是軸突損傷后再生困難的主要原因之一，抑制PTEN 可有效地促進(jìn)損傷神經(jīng)軸突的再生、突觸聯(lián)系的建立和神經(jīng)功能的恢復(fù)。神經(jīng)元生長相關(guān)蛋白43(GAP-43)與軸突生長、突觸細(xì)胞膜再生和突觸的功能有著密切的關(guān)系［19］，其分布于神經(jīng)元、再生的施旺細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，是神經(jīng)元生長發(fā)育、神經(jīng)再生以及成熟中樞神經(jīng)系統(tǒng)中突觸重建和可塑性的分子標(biāo)志物［20］。

在本研究中，我們應(yīng)用胡須體覺皮質(zhì)局灶性腦缺血大鼠模型，觀察淫羊藿苷對(duì)腦缺血后功能恢復(fù)的情況及可能的機(jī)制。Corner text 行為學(xué)結(jié)果顯示，淫羊藿苷能明顯減少腦缺血后大鼠右轉(zhuǎn)次數(shù)，表明淫羊藿苷明顯促進(jìn)腦缺血后胡須功能的恢復(fù);Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果淫羊藿苷明顯抑制梗死灶周邊區(qū)PTEN 蛋白的表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)GAP-43 蛋白表達(dá)。我們的研究結(jié)果提示，淫羊藿苷促進(jìn)腦缺血后的神經(jīng)功能恢復(fù)，可能是通過抑制PTEN 后促進(jìn)神經(jīng)突觸再生、GAP-43 表達(dá)上調(diào)實(shí)現(xiàn)的。進(jìn)一步的研究需要通過藥物或基因的手段抑制和上調(diào)PTEN 的表達(dá)，來進(jìn)一步驗(yàn)證二者之間的因果關(guān)系。我們還觀察到，與假手術(shù)組相比，模型組沒有得到治療也出現(xiàn)PTEN 表達(dá)下降GAP-43 表達(dá)上調(diào)，而且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但夾角實(shí)驗(yàn)右轉(zhuǎn)次數(shù)出現(xiàn)下降但不明顯，這可能和卒中促進(jìn)機(jī)體內(nèi)源性神經(jīng)細(xì)胞和突觸再生有關(guān)，但再生的程度還沒有達(dá)到使神經(jīng)功能明顯改善的程度。

總之我們通過本實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)了，淫羊藿苷可以通過抑制PTEN 促進(jìn)神經(jīng)再生，恢復(fù)神經(jīng)功能。為腦缺血后神經(jīng)再生修復(fù)提供了新的途徑，為中醫(yī)藥在神經(jīng)再生領(lǐng)域的臨床應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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