靳久增，劉 宇，白 霜，黃 鑫

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymalstem cells，BMSCs)是一種來(lái)源于骨髓的成體干細(xì)胞，具有自我更新和多向分化特性，在一定的刺激因子和環(huán)境作用下可分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞、心肌細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞及脂肪細(xì)胞等。但有關(guān)干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化調(diào)控機(jī)制的研究尚未取得突破性進(jìn)展。研究表明組蛋白去乙?；敢种苿┠軌蛞种颇[瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和干細(xì)胞分化，本研究應(yīng)用組蛋白去乙?；敢种苿┍焖嶙鳛檎T導(dǎo)劑，探索大鼠BMSCs分化成神經(jīng)樣細(xì)胞對(duì)Oct-4 的影響。

1 材料和方法

1.1 主要試劑及儀器 主要試劑DMEM/F12、胎牛血清(FBS)均購(gòu)自hyclone 公司。兔抗NSE 抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology、GFAP 抗體購(gòu)自BD 公司、Oct-4 抗體購(gòu)自abcam 公司、免疫組化試劑盒為中杉金橋公司出品;β-ME 為Biotopped公司產(chǎn)品。其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)試劑。CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo Revco)、超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司)、倒置相差顯微鏡(Olympus)、離心機(jī)(Eppendorf)。

1.2 動(dòng)物 為雄性SD 大鼠，體重100 g 左右，普通級(jí)，購(gòu)于鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.3 BMSCs 的體外分離培養(yǎng)及鑒定 SD 大鼠頸脫位法處死，放入75%酒精內(nèi)浸泡5 min。在無(wú)菌條件下，取出脛骨和股骨，剪斷骨骺，滅菌的PBS 緩沖液反復(fù)沖洗;得到的沖洗培養(yǎng)液吹打后，以1×106/ml 接種到培養(yǎng)瓶，置于37 ℃、5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d 后首次換液，7～8 d 傳代。以后每3～4 d 傳代，第3～4 代后細(xì)胞純化后用于實(shí)驗(yàn)。P3 代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞常規(guī)消化離心，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml，100 μl 每管分裝于EP 管中，分別加入CD45-FITC、CD90-FITC 單抗5 μl，室溫避光孵育30 min 后流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果。

1.4 體外誘導(dǎo)BMSCs 向神經(jīng)細(xì)胞分化及丙戊酸的干預(yù) 將細(xì)胞分為兩組，對(duì)照組:不加丙戊酸，當(dāng)?shù)? 代細(xì)胞達(dá)80%～90%融合時(shí)開(kāi)始進(jìn)行誘導(dǎo)分化，加入預(yù)誘導(dǎo)液DMEM/F12 培養(yǎng)基/體積分?jǐn)?shù)為10%的FBS/1 mmol/L β-巰基乙醇(β-ME)培養(yǎng)24 h，而后換為誘導(dǎo)液DMEM/F12 培養(yǎng)基/體積分?jǐn)?shù)為2%二甲基亞砜(DMSO)/200 μmol/L 丁羥茴醚(BHA)誘導(dǎo)5 h。誘導(dǎo)過(guò)程中在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。實(shí)驗(yàn)組:誘導(dǎo)分化前12 h，在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入丙戊酸(濃度200 μg/ml)，其它同對(duì)照組。

1.5 免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色 誘導(dǎo)后的細(xì)胞用PBS 洗滌2 次后，用4%多聚甲醛固定30 min，PBS 再洗滌后，加入3% H2O2封閉10 min，5% BSA封閉20 min，分別加入神經(jīng)特異性烯醇化酶(NSE)抗體(1∶100)、大鼠膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)抗體(1:100)、單克隆抗體室溫孵育2 h 后，置4℃過(guò)夜，PBS 洗滌，分別滴加1∶200 稀釋的生物素山羊抗兔和山羊抗小鼠二抗，置濕盒45 min，ABC 復(fù)合物，37 ℃濕盒孵育1 h，PBS 洗滌，DAB 溶液顯色，脫水透明，中性樹(shù)膠封片，光鏡觀察。

1.6 Western blot 檢測(cè)NSE、GFAP、Oct-4 蛋白表達(dá)水平:誘導(dǎo)后的細(xì)胞，按細(xì)胞總蛋白提取試劑盒提取各組細(xì)胞總蛋白，制備SDS-PAGE 凝膠后上樣30 μg，70～120 V 恒壓電泳，250 mA 恒流轉(zhuǎn)膜70 min，5%～20%脫脂牛奶封閉2～4 h，4 ℃孵育一抗NSE 抗體(1∶100)、GFAP 抗 體(1∶1 000)，洗膜，孵育二抗(1∶4 000)，顯影、定影，以β-actin為內(nèi)參照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。兩組數(shù)據(jù)采用卡方檢驗(yàn)P≤0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)觀察及鑒定 剛接種的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)為大小均一的圓形細(xì)胞，24 h后細(xì)胞開(kāi)始貼壁生長(zhǎng)，8～12 d 后細(xì)胞長(zhǎng)成典型的長(zhǎng)梭形，傳代后的BMSCs 生長(zhǎng)迅速，3～4 d 傳代一次，呈集落生長(zhǎng)，仍貼壁，形態(tài)多樣(見(jiàn)圖1)。誘導(dǎo)后的細(xì)胞為伸出突起的神經(jīng)樣細(xì)胞形態(tài)，有軸突和樹(shù)突出現(xiàn)(見(jiàn)圖2)。丙戊酸誘導(dǎo)12 h 后的細(xì)胞已經(jīng)部分細(xì)胞開(kāi)始分化生神經(jīng)樣細(xì)胞(見(jiàn)圖2 A1、A2)。丙戊酸預(yù)處理后的實(shí)驗(yàn)組神經(jīng)樣細(xì)胞的突出明顯多于對(duì)照組細(xì)胞。表面骨髓基質(zhì)標(biāo)志CD90 高達(dá)95.62%，造血細(xì)胞標(biāo)志CD45 表達(dá)為0.36%(見(jiàn)圖3)。

圖1 細(xì)胞形態(tài)觀察

圖2 細(xì)胞形態(tài)觀察

圖3 第3 代BMSCs 的表面標(biāo)志物

2.2 免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定 誘導(dǎo)后實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的細(xì)胞均有NSE、GFAP 染色陽(yáng)性的細(xì)胞，即誘導(dǎo)后的細(xì)胞為神經(jīng)細(xì)胞(見(jiàn)圖4)

2.3 Western blot 實(shí)驗(yàn)組的誘導(dǎo)后神經(jīng)細(xì)胞蛋白的表達(dá)明顯高于對(duì)照組細(xì)胞表達(dá)水平，Oct-4 的表達(dá)實(shí)驗(yàn)組高于對(duì)照組(見(jiàn)圖5～圖7、表1)。

圖4 免疫細(xì)胞化學(xué)

圖5 NSE 蛋白的表達(dá)

圖6 GFAP 蛋白的表達(dá)

圖7 Oct-4 的表達(dá)

表1 兩組NSE、GFAP、Oct-4 蛋白相對(duì)表達(dá)水平(n=3)

3 討論

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是一種從骨髓中分離得到的一類中胚層來(lái)源的未分化干細(xì)胞，具有自我增殖和多向分化潛能，已有大量的體內(nèi)外研究證明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在一定條件下可誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞。［1，2］有研究表明β-ME、DMSO 和BHA、PDGF 等作為誘導(dǎo)劑，成功的在體外定向誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞。同時(shí)它表達(dá)神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)［3］和神經(jīng)微絲M(NF-M)［4］等神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志物。

丙戊酸(VPA)是一種組蛋白去乙?；敢种苿渥鳛橐环N抗癲癇、抗驚厥和情緒穩(wěn)定藥物被廣泛應(yīng)用于臨床。研究表明，組蛋白去乙酰化酶(HDAC)在分化中發(fā)揮著重要作用。組蛋白與DNA具有高度親和力，由于丙戊酸和組蛋白結(jié)合緊密，阻礙了基本轉(zhuǎn)錄單位蛋白復(fù)合體進(jìn)入啟動(dòng)子結(jié)合位點(diǎn)，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄抑制。作為HDAC 的抑制劑，能使HDAC 的作用受到抑制，使組蛋白和DNA 的親和力下降，使染色體的結(jié)構(gòu)松散，有利于細(xì)胞分裂、增殖。［5］本實(shí)驗(yàn)證明丙戊酸能夠誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化，并且提高其誘導(dǎo)的效率，使得神經(jīng)樣細(xì)胞的軸突和樹(shù)突比對(duì)照組更多，細(xì)胞在一定時(shí)間誘導(dǎo)成神經(jīng)樣細(xì)胞比例更多。并且丙戊酸在預(yù)處理12 h 時(shí)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞就有一部分開(kāi)始分化長(zhǎng)出突出，分化成神經(jīng)樣細(xì)胞了(見(jiàn)圖2 A1、A2)。可以得出由丙戊酸預(yù)處理后，又經(jīng)經(jīng)典的誘導(dǎo)方法誘導(dǎo)的細(xì)胞，其誘導(dǎo)后的神經(jīng)樣細(xì)胞比只有經(jīng)典方法誘導(dǎo)的細(xì)胞更有明顯的神經(jīng)元結(jié)構(gòu)。

研究證明，Oct-4 是屬于POU 家族的轉(zhuǎn)錄因子，它由Pou5f1 基因編碼產(chǎn)生，是多能性干細(xì)胞或全能干細(xì)胞的標(biāo)志物，在維持細(xì)胞的干細(xì)胞特性上起非常重要作用。有研究表明Oct-4 在胚胎干細(xì)胞分化中表達(dá)會(huì)下降。即骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)成神經(jīng)樣細(xì)胞的前后Oct-4 的表達(dá)會(huì)下降［6，7］。Oct-4 表達(dá)的水平同樣決定著鼠胚胎干細(xì)胞的命運(yùn)走向:適當(dāng)水平的表達(dá)可維持胚胎干細(xì)胞的未分化［8，9］;上調(diào)約2倍水平會(huì)誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化為內(nèi)胚層、中胚層;表達(dá)正常水平的50%則可以觸發(fā)向外胚層的分化。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果同時(shí)顯示，第3 代的BMSCs 誘導(dǎo)后分化成神經(jīng)樣細(xì)胞，而第3 代被丙戊酸預(yù)處理后的細(xì)胞比第3 代的BMSCs 未經(jīng)丙戊酸預(yù)處理的細(xì)胞的Oct-4表達(dá)增多，即丙戊酸增強(qiáng)了Oct-4 在BMSCs 體外定向誘導(dǎo)分化中的表達(dá)。由此可見(jiàn)，Oct-4 基因可能與成體干細(xì)胞多潛能性的維持有關(guān)。

綜上，本研究成功建立了大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和大鼠神經(jīng)樣細(xì)胞培養(yǎng)體系，實(shí)驗(yàn)觀察到，在體外分離出骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)后具有神經(jīng)樣細(xì)胞的特點(diǎn)，同時(shí)觀察到丙戊酸能夠成功誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)樣細(xì)胞的分化，并且提高其誘導(dǎo)分化的程度［10］。在大鼠BMSCs 定向誘導(dǎo)分化中，Oct-4 在實(shí)驗(yàn)組比較對(duì)照組表達(dá)增多，提示Oct-4 基因可能也參與了成體干細(xì)胞多潛能性的維持。本研究為進(jìn)一步研究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)方法及Oct-4 在小鼠BMSCs 增殖分化中的作用、探討B(tài)MSCs 的誘導(dǎo)分化調(diào)控機(jī)制提供了理論和實(shí)驗(yàn)資料。

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