周天寒，黃學(xué)寬，張超男，鄧福忠，王志紅，楊治國(guó)，王　玲，楊　玉（.重慶醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校，重慶　4033；.重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，重慶　4033）

痛風(fēng)消停湯對(duì)AGA大鼠踝關(guān)節(jié)炎性因子表達(dá)的影響

周天寒1，黃學(xué)寬2，張超男2，鄧福忠1，王志紅1，楊治國(guó)1，王玲2，楊玉2
（1.重慶醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校，重慶401331；2.重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，重慶401331）

［摘要］目的：研究痛風(fēng)消停湯對(duì)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎（AGA）大鼠受試踝關(guān)節(jié)滑膜組織炎性因子的影響。方法：60只SD雄性大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、秋水仙堿組，痛風(fēng)消停湯低、中、高劑量組，每組10只。正常組常規(guī)喂養(yǎng)，其余各組采用尿酸鈉（MSU）溶液注射法建立急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型。造模前2日，正常組與模型組按20mL/kg予以生理鹽水灌胃，秋水仙堿組0.3mg/kg灌胃，1日1次；痛風(fēng)消停湯低、中、高劑量組分別按2g/kg、4g/kg、8g/kg體質(zhì)量給予痛風(fēng)消停湯灌胃，1日1次，直至造模后第7日，連續(xù)9日。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，檢測(cè)血尿酸，采用ELISA法檢測(cè)受試踝關(guān)節(jié)IL-1β、IL-6、TNF-α的含量，免疫組化法檢測(cè)TGF-β及其受體（TGF-βR1）的表達(dá)。結(jié)果：與正常組比較，模型組大鼠血尿酸、受試踝關(guān)節(jié)滑膜組織中IL-1β、IL-6、TNF-α含量明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，痛風(fēng)消停湯各組大鼠血尿酸、受試踝關(guān)節(jié)滑膜組織中IL-1β、IL-6、TNF-α含量明顯降低（P＜0.05），而痛風(fēng)消停湯各組TGF-β1及TGF-βR1的表達(dá)較其他各組明顯增強(qiáng)（P＜0.05）。結(jié)論：痛風(fēng)消停湯治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的機(jī)制可能與上調(diào)TGF-β1及TGF-βR1的表達(dá)、抑制IL-1β、IL-6、TNF-α的表達(dá)有關(guān)。

［關(guān)鍵詞］痛風(fēng)消停湯；大鼠；急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎；炎性因子

［Abstract］Objective：To investigate the effect of Tongfeng Xiaoting Decoction on the inflammatory factors in ankle joint synovial tissue of acute gouty arthritis rats(AGA).Method：60 male SD rats were randomly divided into 6 groups：normal group, model group, colchicine group and low, medium and high Tongfeng Xiaoting Decoction groups (10 in each group).AGA model was established by induced monosodium urate (MSU) method except the normal group. Two days before AGA model was established, rats in normal and model groups received intra-gastric normal saline(NS) by 20ml/kg.d for qd, colchicine group received colchicine by 0.3mg/kg.d for qd, while those in low, medium and high Tongfeng Xiaoting Decoction groups received Tongfeng Xiaoting Decoction at the liquid of 2g /kg,4g /kg and 8g/kg respectively, once daily, until 7 days after model was formed, continuously for 9 days. After the experiment, serum uric acid was detected, the expression of IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1 were detected by ELISA and the expression of TGF-β1 and TGF-βR1 were detected by immunohistochemistry. Result：Serum uric acid and the content of IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1 in ankle joint synovial membrane were increased significantly in the model group compared to that of the normal group（P＜0.05）.Serum uric acid and the content of IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1 in ankle joint synovial membrane were decreased significantly in Tongfeng Xiaoting Decoction groups compared to that of the model group（P＜0.05）. The expression of TGF-β1and TGF-βR1 in ankle joint synovial membrane were increased significantly in Tongfeng Xiaoting Decoction groups compared to that of the others group（P＜0.05）.Conclusion: The mechanism of treating gouty arthritis by Tongfeng Xiaoting Decoction may be through up-regulating the expression of TGF-β1 ,TGF-rβ1 and inhibiting the expression of IL-1β、IL-6、TNF-αin synovial tissue.

［Key Words］Tongfeng Xiaoting Decoction; acute gouty arthritis; inflammatory Factors

痛風(fēng)（Gout）是長(zhǎng)期嘌呤代謝障礙、血尿酸增高導(dǎo)致組織損傷的疾病，而急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎（acyte gouty arthritis，AGA）則是痛風(fēng)的特征性臨床表現(xiàn)。尿酸鈉晶體析出、沉淀于關(guān)節(jié)腔內(nèi)，導(dǎo)致大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，促使關(guān)節(jié)出現(xiàn)劇烈疼痛、紅腫和功能障礙［1］。痛風(fēng)消停湯具有清熱解毒、利濕泄?jié)帷⒒鐾ńj(luò)之功，治療痛風(fēng)有較好臨床療效。我們觀(guān)察了痛風(fēng)消停湯對(duì)AGA大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織炎性因子的影響，總結(jié)如下。

1　材 料

動(dòng)物：清潔級(jí)雄性S D大鼠6 0只，體質(zhì)量（200±20）g，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供［動(dòng)物合格證號(hào)SCXK（渝）2012-0001，環(huán)境合格證號(hào)SYXK（渝）2012-0001］。

藥品與試劑：痛風(fēng)消停湯由茵陳、苦參、蒼術(shù)、車(chē)前子、當(dāng)歸、黃精、秦艽、尋骨風(fēng)、絡(luò)石藤等中藥組成，原藥購(gòu)自重慶西部醫(yī)藥商城有限責(zé)任公司，由重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院鑒定，按常規(guī)方法自制煎劑，即冷水浸泡30min，煮沸后煎30min，共煎3次，合并藥液，濃縮為含生藥1.0g /mL煎劑。秋水仙堿片（昆明制藥集團(tuán)股份有限公司），尿酸鈉晶體（美國(guó)SIGMA公司），白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α））ELISA試劑盒（南京建成生物工程研究所），S-P Rabbit HRP Kit （DAB）兔Streptavidin-HRP試劑盒（武漢博士德生物科技有限公司），TGF-β1、TGF-βR1 一抗（武漢博士德生物科技有限公司）等。

儀器：AU400全自動(dòng)生化分析儀，日本OLYMPUS公司；BX51T-PHD-J11型顯微鏡，日本OLYMPUS 公司；80-2型低速離心機(jī)，上海手術(shù)器械廠(chǎng)；圖像采集系統(tǒng)CMOS，日本OLYMPUS 公司；Image-Pro Plus，美國(guó)Media Cybernetics公司；RM2015型切片機(jī)，德國(guó)萊卡等。

2　方 法

2.1動(dòng)物造模與分組

取雄性SD大鼠60只適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常組，模型組，秋水仙堿組，痛風(fēng)消停湯低、中、高劑量組，每組10只。造模前2日開(kāi)始，按20mL/kg體質(zhì)量予以生理鹽水灌胃，1日1次，直至造模后7日，連續(xù)9日。秋水仙堿組用秋水仙堿混懸液0.3mg/kg灌胃，痛風(fēng)消停湯低、中、高劑量組分別按2、4、8g/kg體質(zhì)量給予痛風(fēng)消停湯灌胃，均從造模前2日開(kāi)始，1日1次，直至造模后第7日，連續(xù)9日。根據(jù)文獻(xiàn)方法［2］加以改進(jìn)，除正常組大鼠外，其余各組大鼠從灌胃第3天開(kāi)始，大鼠腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉后，在大鼠右踝關(guān)節(jié)后側(cè)用6號(hào)注射針針口斜面與脛骨成45°夾角方向插入跟腱內(nèi)側(cè)直至踝關(guān)節(jié)腔，將配置好的（濃度為2.5g/100mL）0.2mL的尿酸鈉溶液注入關(guān)節(jié)腔內(nèi)，以關(guān)節(jié)囊對(duì)側(cè)鼓脹為注入標(biāo)準(zhǔn)，連續(xù)7天。正常組注射同體積生理鹽水，連續(xù)7天。

2.2標(biāo)本采集與指標(biāo)檢測(cè)

大鼠血尿酸檢測(cè)。大鼠處置符合中華人民共和國(guó)科技部2006年頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》。造模第7日，灌胃2h后，按20%烏拉坦5mL/kg體質(zhì)量進(jìn)行麻醉，摘取眼球采血3-5mL，靜置1-2h，4000r/min離心10min，分離血清，取上清液，低溫（4℃）保存，按說(shuō)明書(shū)檢測(cè)血尿酸。

ELISA法檢測(cè)大鼠踝關(guān)節(jié)IL-1β、IL-6、TNF-α等的含量。頸椎脫臼處死大鼠，以踝關(guān)節(jié)為中心上下0.5cm處剪斷，取下受試關(guān)節(jié)及周?chē)浗M織，快速切取踝關(guān)節(jié)滑膜組織，稱(chēng)重，按1∶5比例加生理鹽水稀釋?zhuān)?℃勻漿，4000r/min離心5min，取上清液，分裝于Ep管中，按ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)關(guān)節(jié)滑膜組織浸出液中IL-1β、IL-6、TNF-α等的含量。

免疫組化SABC法檢測(cè)大鼠踝關(guān)節(jié)TGF-β1及TGF-βR1的表達(dá)。以受試踝關(guān)節(jié)為中心上下0.5cm處剪斷，取相應(yīng)關(guān)節(jié)組織放入4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋、切片。根據(jù)免疫組化試劑盒說(shuō)明書(shū)，ABC染色，DBA顯色，復(fù)染、脫水、透明、封片，以顯微鏡下細(xì)胞胞漿及胞膜內(nèi)出棕色粒為陽(yáng)性表達(dá)，免疫組化結(jié)果采用IHS （immunohistochemical scores）評(píng)分：陽(yáng)性細(xì)胞百分比為A，陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)弱為B，IHS = A×B。無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞則A為0分，陽(yáng)性細(xì)胞為1%～10%則A為1分，陽(yáng)性細(xì)胞為11%～50%則A為2分，陽(yáng)性細(xì)胞為51%～80%則A為3分，陽(yáng)性細(xì)胞為80%～100%則A為4分。染色強(qiáng)度陰性B 為0分，弱陽(yáng)性為1分，陽(yáng)性為2分，強(qiáng)陽(yáng)性為3分［3］。

2.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以（±s） 表示、采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3　結(jié)　果

大鼠血尿酸及及受試踝關(guān)節(jié)滑膜組織IL-1β、IL-6、TNF-α含量比較見(jiàn)表1。

表1　各組大鼠血尿酸及受試踝關(guān)節(jié)滑膜組織IL-1β、IL-6、TNF-α含量比較 （±s）

表1　各組大鼠血尿酸及受試踝關(guān)節(jié)滑膜組織IL-1β、IL-6、TNF-α含量比較 （±s）

注：與正常組比較，△P＜0.05；與模型組比較，▲P＜0.05。

組別　n　 uric acid （μmol/L）　IL-1β（ng/L）　IL-6（ng/L）　TNF-α（ng/L）正常組　10　106.33±22.01　6.83±0.36　9.15±0.52　20.15±0.92模型組　10　186.72±43.36△　8.97±0.65△　32.57±0.65△　76.57±3.65△秋水仙堿組　10　135.49±32.25△▲　7.44±0.58△▲　17.41±0.59△▲　33.41±1.59△▲痛風(fēng)消停湯低劑量組　10　138.53±29.74△▲　7.93±0.21△▲　15.62±0.72△▲　35.62±2.72△▲痛風(fēng)消停湯中劑量組　10　131.26±24.55△▲　7.31±0.83△▲　15.28±0.43△▲　31.78±2.18△▲痛風(fēng)消停湯高劑量組　10　129.81±35.67△▲　7.28±0.54△▲　14.06±0.41△▲　29.06±1.33△▲

大鼠受試踝關(guān)節(jié)TGF-β1、TGF-βR1表達(dá)比較見(jiàn)表2。

表2　各組大鼠受試踝關(guān)節(jié)滑膜組織TGF-β1、TGF-βR1表達(dá)比較（±s）

表2　各組大鼠受試踝關(guān)節(jié)滑膜組織TGF-β1、TGF-βR1表達(dá)比較（±s）

注：與正常組比較，△P＜0.05；與模型組比較，▲P＜0.05。

組別　n　 TGF-β1　 TGF-βR1正常組　10　 2.14±0.05　 2.79±0.13模型組　10　 2.45±0.12　 3.12±0.11秋水仙堿組　10　 2.29±0.16　 2.93±0.17痛風(fēng)消停湯低劑量組　10　 4.01±0.12△▲　4.39±0.12△▲痛風(fēng)消停湯中劑量組　10　 4.13±0.26△▲　4.18±0.13△▲痛風(fēng)消停湯高劑量組　10　 4.09±0.17△▲　4.96±0.21△▲

4　討　論

痛風(fēng)消停湯方中茵陳、苦參清熱解毒，蒼術(shù)、車(chē)前子利濕泄?jié)幔剀?、尋骨風(fēng)、絡(luò)石藤祛風(fēng)除濕、化瘀通絡(luò)止痛，當(dāng)歸、黃精養(yǎng)血填精和營(yíng)以固正氣。全方有清熱解毒、利濕泄?jié)?、化瘀通絡(luò)之功。藥理研究表明，茵陳有降脂利尿、抗多種病原微生物作用。苦參堿對(duì)各種致炎劑引起的急性滲出性炎癥有明顯對(duì)抗作用，與氫化可的松作用相似。蒼術(shù)、車(chē)前子的提取液可抗炎利尿，且有預(yù)防腎結(jié)石等作用。當(dāng)歸有鎮(zhèn)痛，抗菌，抗氧化和提高免疫力等作用。黃精則可提高機(jī)體的免疫力。秦艽解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎，可消除大鼠關(guān)節(jié)腫脹。尋骨風(fēng)所含生物堿對(duì)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎有較好止痛、消腫、改善關(guān)節(jié)功能等作用。絡(luò)石藤甲醇提取物對(duì)動(dòng)物雙足浮腫、扭體反應(yīng)有抑制作用，所含尿酸合成酶黃嘌呤氧化酶有顯著抑制作用而能抗痛風(fēng)。茵陳、蒼術(shù)、車(chē)前子、黃精等均有降低血尿酸的水平等作用［4］。

研究表明，在痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的病理過(guò)程中，尿酸鈉晶體作用于中性粒細(xì)胞、滑膜細(xì)胞、T細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、血小板釋放多種炎癥介質(zhì)，如炎性細(xì)胞因子、組胺、前列腺素、血小板活化因子（PAF）、微血管增滲酶等，而多種細(xì)胞因子可通過(guò)自分泌和旁分泌的方式影響痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生［5］，其中免疫活性因子TNF-α和白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）在AGA發(fā)病過(guò)程中起著非常重要的作用。中性粒細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞粘連是急性痛風(fēng)產(chǎn)生的本質(zhì)，而TNF-α和IL-1β可上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞E-選擇素活性及增加中性粒細(xì)胞的募集，活化的中性粒細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞表面黏附分子黏附，進(jìn)而向關(guān)節(jié)部位浸潤(rùn)，釋放炎性介質(zhì)，引起AGA關(guān)節(jié)局部炎癥反應(yīng)的發(fā)生［6］。有人認(rèn)為，TNF-α和IL-1β兩因子作為炎癥的啟動(dòng)因子，通過(guò)與滑膜細(xì)胞上IL-1受體相互作用，激活結(jié)頭蛋白MyD88，繼而啟動(dòng)NF-κB觸發(fā)繼發(fā)性的炎性細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄，從而加重關(guān)節(jié)損傷［7］；TNF-α也是前炎癥網(wǎng)鏈中一級(jí)細(xì)胞因子，IL-1β是由TNF-α等誘導(dǎo)的二級(jí)前炎癥細(xì)胞因子，并能提高TNF-α的活性，兩者之間可能存在反饋機(jī)制，共同參與內(nèi)皮細(xì)胞的激活和炎性細(xì)胞在體內(nèi)的募集而加重炎性損傷［8］。因此，降低AGA關(guān)節(jié)組織中TNF-α和IL-1β的水平，終止炎性細(xì)胞因子的惡性循環(huán)，則是有效治療AGA的作用環(huán)節(jié)之一。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）是一類(lèi)在發(fā)育、免疫反應(yīng)和組織修復(fù)中起調(diào)節(jié)作用的生長(zhǎng)和分化因子，其具有雙向性、多樣性和網(wǎng)絡(luò)性，在免疫、炎癥及纖維化性疾病中有重要作用。而轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）是骨關(guān)節(jié)炎的一個(gè)主要調(diào)節(jié)因子，不僅具有促進(jìn)炎癥與組織修復(fù)的活性，還可以抑制IL-1、IL-6的合成與致炎活性，使干擾素-a（IFN-a）、IFN-γ等的表達(dá)降低，有抑制炎癥活性的功能。TGF-β1的增加能抑制AGA患者IL-1β和TNF-α等促炎因子［9］，提示TGF-B1的增高可能抑制了AGA的炎癥反應(yīng)。TGF-β是通過(guò)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β受體（TGF-βR）的信號(hào)調(diào)節(jié)系統(tǒng)作為重要媒介作用于細(xì)胞的，因此可通過(guò)增加TGF-βR1的含量有效增強(qiáng)TGF-β1對(duì)組織器官發(fā)揮作用。此外，TGF-β1還可促進(jìn)蛋白多糖合成，促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨合成，促進(jìn)成纖維細(xì)胞I型膠原基因表達(dá)，且無(wú)疤痕形成［10］。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，用痛風(fēng)消停湯后，各組大鼠血尿酸、受試踝關(guān)節(jié)滑膜組織中IL-1β、IL-6、TNF-α含量降低，TGF-β1及TGF-βR1表達(dá)提高，提示痛風(fēng)消停湯治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的機(jī)制可能與上調(diào)TGF-β1及TGF-βR1的表達(dá)、抑制IL-1β、IL-6、TNF-α的含量有關(guān)，但其機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

［參考文獻(xiàn)］

［1］Bouchon A，F(xiàn)acchetti F，weigand MA，et al.TREM-1 amplifies inflammation and is a cruel mediator of septic shock［J］.Nature，2001，410(6832):1103-1107.

［2］黃火高，胡明，孫運(yùn)峰，等.大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型的建立及特點(diǎn)［J］.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊，2005，29（6）：538-542.

［3］Soslow RA，Dannenberg AJ，Rush D，Woerner BM，Khan KN，Masferrer J，Koki AT.Cox-2 is expressed in human pulmonary，colonic and mammary tumors［J］.Cancer，2000，89(12):2637-2645.

［4］梅全喜.簡(jiǎn)明實(shí)用中藥藥理手冊(cè)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2010.

［5］余斌，張亦工.急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎中白細(xì)胞介素類(lèi)細(xì)胞因子的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)中醫(yī)骨傷科雜志，2005，13（4）：56.

［6］Chapman PT，Yarwod H，Harrison AA，et a1．Endothelial activation in monosodium urate monohydrate crystal-induced inflammation:in vitro and in vivo studies on the roles of tumor necrosis factor alpha and interleukin-l ［J］.Arthritis Rheum，1997，40(5):955.

［7］Chen CJ，Shi Y，Hearn A，et a1.MyD88-dependent IL-1 receptor signaling is essential for gouty inflammation stimulated by monosodium urate crystals ［J］.J Clin Invest，2006，116(8):262.

［8］高火高，孫云峰，胡明，等.大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型的建立及特點(diǎn)［J］.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊，2005，29（6）：538.

［9］Yu-Hsuan Chen，Song-Chou Hsieh et al.Spontaneous resolution of acute gouty arthritis is associated with rapid induction of the antiinflammatory factors TGFβ1，IL-10 and soluble TNF receptors and the intracellular cytokine negative regulators CIS and SOCS3［J］.Ann Rheum Dis，2011，70:1655–1663.

［10］何煒，郭亭，趙建寧.轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β與骨關(guān)節(jié)炎的軟骨損傷修復(fù)［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2007，20 （2）：195.

［收稿日期］2015-07-23

［通訊作者］黃學(xué)寬

［基金項(xiàng)目］重慶市衛(wèi)生局科技項(xiàng)目（2010-2-25）

［中圖分類(lèi)號(hào)］R255.689.7

［文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼］B

［文章編號(hào)］1004-2814（2015）10-0888-03