黎雪清 魯藝 王鐵杰等

[摘要] 目的 建立一種快速檢測(cè)抗風(fēng)濕類中成藥和保健食品中30種非法添加化學(xué)成分的高液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法。 方法 色譜條件：C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，以甲醇-0.1%乙酸溶液為流動(dòng)相，梯度洗脫，質(zhì)譜條件：電噴霧離子化正離子檢測(cè)（ESI+），全掃描一級(jí)質(zhì)譜、選擇離子二級(jí)掃描質(zhì)譜檢測(cè)方式，掃描范圍50～800 aum，對(duì)抗風(fēng)濕類中成藥和保健食品中非法添加的化學(xué)成分進(jìn)行快速定性分析。 結(jié)果 根據(jù)檢測(cè)到的化合物的色譜保留時(shí)間及一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜信息，并與對(duì)照品比較，可作為分析抗風(fēng)濕類中成藥和保健食品中非法添加嗎啡、甲氧芐啶、對(duì)乙酰氨基酚、羅通定、氨基比林、龍膽苦苷、磺胺甲■唑、安替比林、阿司匹林、非那西丁、鹽酸美沙酮、潑尼松、可的松、異丙安替比林、吡羅昔康、氫化可的松、金諾芬、地塞米松、甲基潑尼松龍、醋酸曲安奈德、酮洛芬、舒林酸、萘普生、地西泮、醋酸地塞米松、保泰松、奧沙普秦、雙氯芬酸鈉、吲哚美辛和丙酸倍氯米松等30種化學(xué)成分的有效手段。在50批供試品中，檢測(cè)到有10種供試品中含有非法添加的化學(xué)成分。 結(jié)論 本方法專屬性強(qiáng)、靈敏度高，可作為抗風(fēng)濕類中成藥和保健食品中非法添加化學(xué)成分的快速檢測(cè)方法。

[關(guān)鍵詞] 液質(zhì)聯(lián)用法；快速檢測(cè)；抗風(fēng)濕類；非法添加

[中圖分類號(hào)] R917 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2015）02（c）-0086-05

我國(guó)地理緯度跨度大，高寒、高濕地區(qū)多，導(dǎo)致我國(guó)具有較高的風(fēng)濕病發(fā)病率[1]。風(fēng)濕性及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎以疼痛、麻木、關(guān)節(jié)活動(dòng)不靈為主要癥狀，是一種致殘性非常強(qiáng)的疾病[2-3]?；谏鲜銮闆r，不法商家為牟取暴利，突顯產(chǎn)品療效，在抗風(fēng)濕類中成藥和保健食品中非法添加化學(xué)物質(zhì)[4-5]，使通常起效慢的中藥和保健食品似乎具備了速效、高效的優(yōu)點(diǎn)。在健康產(chǎn)品中非法添加的化學(xué)藥物，未經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證、臨床驗(yàn)證和國(guó)家相關(guān)部門嚴(yán)格審核批準(zhǔn)，本身質(zhì)量安全難以控制保證，而且存在隨意性和不確定性。這種非法現(xiàn)象會(huì)給社會(huì)和消費(fèi)者帶來(lái)了嚴(yán)重的，甚至導(dǎo)致死亡的威脅，同時(shí)引起了國(guó)家相關(guān)監(jiān)管部門的重視。建立完善的檢測(cè)非法添加化學(xué)藥物的專屬性方法具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。由于中成藥和保健食品添加的化學(xué)成分種類繁多、基體復(fù)雜，對(duì)分析儀器的檢測(cè)能力要求苛刻，現(xiàn)代質(zhì)譜技術(shù)是目前眾多分析化學(xué)方法中同時(shí)具備了靈敏度高、特異性好、普適性強(qiáng)、高通量等優(yōu)點(diǎn)的分析方法，可對(duì)多組分混合物定性鑒定和分子結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確判定[6-8]。

高效液相色譜-離子阱-飛行時(shí)間高分辨質(zhì)譜（LCMS-IT-TOF）在現(xiàn)有各廠家質(zhì)譜儀不能同時(shí)實(shí)現(xiàn)多級(jí)質(zhì)譜功能和精確質(zhì)量測(cè)定的行業(yè)現(xiàn)狀下，實(shí)現(xiàn)了離子阱質(zhì)譜和飛行時(shí)間質(zhì)譜的完美結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)既可以做多級(jí)質(zhì)譜，又能達(dá)到高質(zhì)量精度的強(qiáng)大功能。充分利用IT-TOF獲得的多級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)，在一級(jí)質(zhì)譜發(fā)現(xiàn)的候選物的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步通過(guò)多級(jí)質(zhì)譜的數(shù)據(jù)對(duì)比，確認(rèn)真正的物質(zhì)，使成分鑒定更準(zhǔn)確，離子信息更豐富。

本研究以國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局藥品檢驗(yàn)補(bǔ)充檢驗(yàn)方法和檢驗(yàn)項(xiàng)目批準(zhǔn)件“抗風(fēng)濕類中成藥”（批準(zhǔn)件編號(hào)2009025）[9]為基礎(chǔ)，結(jié)合市場(chǎng)上新發(fā)現(xiàn)的非法添加化學(xué)成分情況，采用LCMS-TI-TOF對(duì)待測(cè)成分進(jìn)行定性分析，獲得高準(zhǔn)確度、高分辨率、高靈敏度的多級(jí)質(zhì)譜信息，準(zhǔn)確快速驗(yàn)證非法添加的化學(xué)成分結(jié)構(gòu)，建立了快速檢測(cè)抗風(fēng)濕類中成藥和保健食品中嗎啡、甲氧芐啶、對(duì)乙酰氨基酚、羅通定、氨基比林、龍膽苦苷、磺胺甲噁唑、安替比林、阿司匹林、非那西丁、鹽酸美沙酮、潑尼松、可的松、異丙安替比林、吡羅昔康、氫化可的松、金諾芬、地塞米松、甲基潑尼松龍、醋酸曲安奈德、酮洛芬、舒林酸、萘普生、地西泮、醋酸地塞米松、保泰松、奧沙普秦、雙氯芬酸鈉、吲哚美辛和丙酸倍氯米松等30種非法添加化學(xué)成分的液質(zhì)聯(lián)用方法[10-14]，進(jìn)一步為打擊藥品和保健食品制假售假工作提供了有效的手段[15]。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LCMS-IT-TOF液質(zhì)聯(lián)用儀（日本島津公司，SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器，電噴霧離子源（ESI），LCMSolution色譜工作站）；XS105DU十萬(wàn)分之一電子天平（瑞士梅特勒公司）；Milli-Q Academic純水器（美國(guó)MILLIPORE公司）；SB25-12DT超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 試藥

氨基比林（批號(hào)：100503-200301）、嗎啡（批號(hào)：171201-201324，含量99.1%）、甲氧芐啶（批號(hào)：10031-200304）、對(duì)乙酰氨基酚（批號(hào)：100018-200408）、羅通定（批號(hào)：100452-200301）、龍膽苦苷（批號(hào)：200106）、磺胺甲噁唑（批號(hào)：100025-200904，含量99.8%）、安替比林（批號(hào)：100506-200301）、阿司匹林（批號(hào)：100113-201104）、鹽酸美沙酮（批號(hào)：171243-200602）、潑尼松（批號(hào)：100199-201002，含量98.5%）、可的松（批號(hào)：101128-201001，含量97.2%）、異丙安替比林（批號(hào)：100525-200301）、吡羅昔康（批號(hào)：100177-200603，含量99.8%）、氫化可的松（批號(hào)：100152-200206）、金諾芬（批號(hào)：100272-201202）、地塞米松（批號(hào)：100129-200804，含量99.6%）、醋酸曲安奈德（批號(hào)：100125-201105，含量97.8%）酮洛芬（批號(hào)：100337-200502）、萘普生（批號(hào)：100198-200403）、地西泮（批號(hào)：171225-200903，含量99.9%）、醋酸地塞米松（批號(hào)：100122-201206）、保泰松（批號(hào)：100481-200601，含量99.9%）、奧沙普秦（批號(hào)：100353-200301）、雙氯芬酸鈉（批號(hào)：100334-200302）、丙酸倍氯米松（批號(hào)：100119-200603）對(duì)照品均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；非那西?。ㄅ?hào)：81105，含量98.5%，德國(guó)DR.EHRENSTORFER）、甲基潑尼松龍（批號(hào)：20100402，EDQM）、舒林酸（批號(hào)：10J345，含量99.8%，USP）、吲哚美辛（批號(hào)：01105，含量99.0%，德國(guó)DR.EHRENSTORFER）；甲醇和乙酸均為色譜純；水為超純水（自制）。待測(cè)樣品均為市售。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

CAPCELL PAK C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇（A）和0.1%乙酸溶液（B），梯度洗脫：0～5 min，40%～50%A；5～25 min，55%～60%A；25～40 min，70%～75% A；40～45 min，90%A。柱溫：35℃；樣品室溫度：20℃；進(jìn)樣量：10 μL；體積流量：1.0 mL/min（分流比為1∶5）。

2.2 質(zhì)譜條件

質(zhì)譜裝配電噴霧電離源（ESI）；m/z 50～800 amu；噴霧氣流：1.5 L/min；曲型脫溶劑管（CDL）溫度：200℃；加熱板溫度：200℃；檢測(cè)電壓：1.65 kV；干燥氣（N2）電壓：112 kPa；碰撞能量范圍：20%～70%；正離子模式檢測(cè)。掃描方式采用全掃描一級(jí)質(zhì)譜、選擇離子二級(jí)掃描質(zhì)譜監(jiān)測(cè)（MS/MS）。

2.3 對(duì)照品溶液的配制

取各對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1毫升中各含嗎啡、甲氧芐啶、對(duì)乙酰氨基酚、羅通定、氨基比林、龍膽苦苷、磺胺甲■唑、安替比林、阿司匹林、非那西丁、鹽酸美沙酮、潑尼松、可的松、異丙安替比林、吡羅昔康、氫化可的松、金諾芬、地塞米松、甲基潑尼松龍、醋酸曲安奈德、酮洛芬、舒林酸、萘普生、地西泮、醋酸地塞米松、保泰松、奧沙普秦、雙氯芬酸鈉、吲哚美辛和丙酸倍氯米松0.1 mg的混合對(duì)照品貯備液；精密量取上述貯備液1 mL，置50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.4 供試品溶液的配制

取供試品（相當(dāng)于一次口服劑量）研細(xì)，置50 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲處理20 min，放冷，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。取上清液適量加甲醇稀釋100倍，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.5 質(zhì)譜特征

取混合對(duì)照品溶液，按上述質(zhì)譜條件檢測(cè)。部分化學(xué)成分不能達(dá)到完全分離，但因各待測(cè)成分的準(zhǔn)分子離子峰不同，通過(guò)質(zhì)譜的高靈敏和高選擇測(cè)定，不會(huì)造成相互間的干擾。記錄全掃描一級(jí)質(zhì)譜、選擇離子二級(jí)質(zhì)譜信息。30種化學(xué)成分的質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

2.6 樣品測(cè)定

按“2.4”項(xiàng)下制備供試品溶液，在上述色譜和質(zhì)譜條件下測(cè)定，共測(cè)50批樣品，其中包括中成藥24批，保健食品26批。測(cè)得樣品呈陽(yáng)性的結(jié)果見(jiàn)表2。部分對(duì)照品及供試品的一級(jí)及二級(jí)質(zhì)譜圖見(jiàn)圖1。

3 討論

3.1 液質(zhì)聯(lián)用法優(yōu)勢(shì)

中成藥和保健食品添加的化藥成分種類繁多、基體復(fù)雜[16]，采用化學(xué)方法或者高效液相色譜法進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果；通過(guò)一級(jí)全掃描模式可獲得化合物的準(zhǔn)分子離子峰，但若遇復(fù)雜的基質(zhì)，同樣容易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，因此需提取該分子離子為母離子進(jìn)行二級(jí)掃描獲得碎片信息。本文采用液質(zhì)聯(lián)用法，基于LCMS-IF-TOF譜，對(duì)待測(cè)成分進(jìn)行定性分析，獲得高質(zhì)量準(zhǔn)確度、高分辨率和高靈敏度的多級(jí)質(zhì)譜LCMS-IT-TOF信息，準(zhǔn)確快速驗(yàn)證非法添加的化學(xué)成分結(jié)構(gòu)。通過(guò)比較對(duì)照品及供試品的保留時(shí)間、一級(jí)質(zhì)譜分子離子峰及二級(jí)質(zhì)譜碎片等信息，對(duì)供試品進(jìn)行結(jié)果確證，提高檢測(cè)的專屬性。

3.2 檢測(cè)模式選擇

由于待測(cè)成分繁多，為了全面快速驗(yàn)證多種化學(xué)成分，利用離子阱（IT）和飛行時(shí)間（TOF）技術(shù)優(yōu)勢(shì)，可以完成MS1的正離子模式和負(fù)離子模式的自動(dòng)切換并掃描，并可以進(jìn)行MSn的正離子模式和負(fù)離子模式的相互之間切換并掃描。盡管相互切換的時(shí)間很短，但正離子模式和負(fù)離子模式下的高質(zhì)量準(zhǔn)確度仍然是可以確保的。故本研究采用同時(shí)對(duì)待測(cè)成分進(jìn)行正負(fù)離子模式檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)待測(cè)成分中安替比林和非那西丁由于存在酰胺鍵（-CO-NH）在負(fù)離子檢測(cè)模式（ESI-）下響應(yīng)較差，且適合負(fù)離子檢測(cè)的成分在正離子模式（ESI+）下響應(yīng)較好，待測(cè)成分均易加氫或者加鈉形成正電荷離子峰。因此，本法最終采用ESI+同時(shí)檢測(cè)30種待測(cè)成分，大大簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)操作，提高檢驗(yàn)效率。

3.3 測(cè)定結(jié)果

隨著科技的進(jìn)步，單一化學(xué)成分的效果有時(shí)沒(méi)有多種成分的合理組合更有利于調(diào)整人的生理功能，更利于改善產(chǎn)品的質(zhì)量特征。通過(guò)測(cè)定結(jié)果可見(jiàn)，造假分子也會(huì)“與時(shí)俱進(jìn)”把化學(xué)藥品中的組合應(yīng)用行為轉(zhuǎn)移到中成藥、保健食品中，從非法添加單一成分轉(zhuǎn)向非法添加組合成分[15]。本研究發(fā)現(xiàn)添加的化學(xué)藥成分多屬于處方藥，服用時(shí)有嚴(yán)格的適應(yīng)證、禁忌證，需要在醫(yī)生指導(dǎo)下才能安全有效使用?；颊咴诓恢榈那闆r下使用，輕則耽誤治療時(shí)機(jī)，加重治療成本，重則過(guò)量服用藥物，引起嚴(yán)重的不良反應(yīng)，甚至導(dǎo)致死亡。非法添加化學(xué)藥成分的客觀事實(shí)已經(jīng)對(duì)公眾生命財(cái)產(chǎn)安全形成威脅、造成危害。本方法快速、靈敏、準(zhǔn)確，有效地同時(shí)檢測(cè)抗風(fēng)濕類中成藥和保健食品非法添加的多種化學(xué)成分，為檢測(cè)和打擊非法添加行為提供更全面、更有力的技術(shù)支撐，提高監(jiān)督檢驗(yàn)效率。

筆者還運(yùn)用上述色譜系統(tǒng)建立了一種在45 min內(nèi)快速篩查嗎啡、甲氧芐啶、對(duì)乙酰氨基酚嗎啡、甲氧芐啶、對(duì)乙酰氨基酚、龍膽苦苷、磺胺甲■唑、安替比林、阿司匹林、非那西丁、潑尼松、異丙安替比林、氫化可的松、金諾芬、地塞米松、甲基潑尼松龍、酮洛芬、舒林酸 、萘普生、地西泮、醋酸地塞米松、保泰松、奧沙普秦、雙氯芬酸鈉、吲哚美辛、丙酸倍氯米松等24種抗風(fēng)濕類化學(xué)成分的高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器快速篩查方法以便監(jiān)督檢驗(yàn)。

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（收稿日期：2014-11-25 本文編輯：衛(wèi) 軻）