劉鈞天 崔瑩雪 黃玉海 黃暢 黃劍 趙百孝 韓麗 楊佳 王磊

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艾煙與香煙對(duì)載脂蛋白E基因敲除小鼠學(xué)習(xí)記憶功能與海馬β淀粉樣蛋白沉淀的影響

劉鈞天 崔瑩雪 黃玉海 黃暢 黃劍 趙百孝 韓麗 楊佳 王磊

目的 觀(guān)察艾煙與香煙對(duì)載脂蛋白E基因敲除(apolipoprotein E-deficient，ApoE-/-)小鼠學(xué)習(xí)記憶能力與海馬β淀粉樣蛋白(β-Amyloid)沉淀的影響。方法 將13只8周齡C57BL/6小鼠作為空白對(duì)照組，27只同齡ApoE-/-小鼠隨機(jī)分為ApoE-/-模型組、艾煙組、香煙組。香煙與艾煙組小鼠分別暴露于5～15 mg/m3的香煙與艾煙環(huán)境。各組小鼠每天干預(yù)20分鐘，每周6天，共干預(yù)12周。于第13周進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試，之后處死動(dòng)物、取材，對(duì)其腦組織海馬中Aβ沉淀進(jìn)行剛果紅染色。結(jié)果 與模型組對(duì)比，空白對(duì)照組、艾煙組、香煙組小鼠均表現(xiàn)出學(xué)習(xí)潛伏期縮短，記憶潛伏期增長(zhǎng)，記憶錯(cuò)誤次數(shù)減少，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。模型組小鼠在視野范圍內(nèi)有明顯的粉紅色彌散樣Aβ沉淀，空白對(duì)照組明顯少于模型組(P<0.05)。艾煙組與香煙組在相同海馬區(qū)域CA3中淀粉樣蛋白沉淀均有不同程度的減少,艾煙組中Aβ沉淀較模型組顯著降低(P<0.05)，較香煙組亦有減少(P<0.05)。結(jié)論 艾煙能夠發(fā)揮ApoE-/-小鼠的海馬CA3區(qū)保護(hù)作用，減少Aβ沉淀進(jìn)而改善ApoE-/-小鼠學(xué)習(xí)記憶能力。

艾煙； 香煙； 載脂蛋白E基因敲除小鼠； 淀粉樣蛋白； 學(xué)習(xí)記憶

艾灸是以艾絨為施灸材料，點(diǎn)燃后在體表一定的部位進(jìn)行燒、灼、熏，給人體以溫?zé)帷⑺幬锎碳ぷ饔?，以防治疾病的一種外治法。艾煙作為艾灸的重要組成部分被證明有著諸多的生物活性——抗氧化[1-2]、廣譜殺菌、抗病毒[3-4]、抗腫瘤[5-6]以及免疫調(diào)節(jié)[7]等作用。課題組前期研究中發(fā)現(xiàn)艾煙可以提高人體自主神經(jīng)活力[8]，改善SAMP8小鼠腦中氧化應(yīng)激狀態(tài)[9]，說(shuō)明艾煙可從多渠道參與改善衰老模型小鼠的病理進(jìn)程。

為進(jìn)一步觀(guān)察艾煙對(duì)阿茲海默病模型小鼠學(xué)習(xí)記憶功能以及腦中β淀粉樣蛋白(Aβ)沉淀形成的影響。本實(shí)驗(yàn)以載脂蛋白E基因敲除(apolipoprotein E-deficient，ApoE-/-)小鼠為模型，通過(guò)對(duì)比觀(guān)察艾煙暴露與香煙暴露兩種不同干預(yù)方式對(duì)其學(xué)習(xí)記憶功能影響及腦組織海馬中Aβ沉淀改變，探討艾煙對(duì)腦組織衰老的干預(yù)作用，以期為探索艾灸療法延緩衰老機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

選用清潔級(jí)8周齡雄性載脂蛋白E基因敲除小鼠(ApoE-/-)27只，C57BL/6小鼠13只，體質(zhì)量30 g，2013年3月22日購(gòu)自北京大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)中心[許可證：SCXK(京)2011-0012]。ApoE-/-小鼠采用高脂飼料喂養(yǎng)，C57BL/6小鼠采用標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)水；飼養(yǎng)環(huán)境溫度(22±2)℃，相對(duì)濕度50%～60%，保持12小時(shí)光照(8∶00～20∶00)和黑暗(20∶00～次日8∶00)交替循環(huán)。

小鼠購(gòu)進(jìn)后，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，干預(yù)12周。按隨機(jī)數(shù)字表法將ApoE-/-小鼠隨機(jī)分為ApoE-/-模型組、艾煙組、香煙組三組(每組9只)，并將13只C57BL/6小鼠作為空白對(duì)照組進(jìn)行對(duì)照。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)材料、儀器及試劑

自制細(xì)艾條：(直徑0.5 cm×長(zhǎng)20 cm，河南南陽(yáng)漢醫(yī)艾絨有限公司)；香煙(中南海牌，焦油含量10 mg/支)；自制帶孔玻璃缸1 m×1 m×1 m,頂層玻璃正中設(shè)一直徑5 mm圓孔)； 光散射式數(shù)字粉塵測(cè)試儀(北京賓達(dá)綠創(chuàng)科技有限公司)；小鼠跳臺(tái)試驗(yàn)儀；剛果紅染液(南京建成生物工程研究所)；中性樹(shù)膠封片劑；多聚甲醛，中性樹(shù)膠及其它生物試劑(Sigma公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟

空白暴露：將空白對(duì)照組與ApoE-/-模型組小鼠分別暴露于玻璃缸中20分鐘。

艾煙干預(yù)：將調(diào)試好的粉塵測(cè)試儀置于玻璃缸中間，將艾煙組小鼠自由暴露在玻璃缸中，點(diǎn)燃自制細(xì)艾條，從玻璃缸上方的圓孔將點(diǎn)燃的一端插入，令艾煙充滿(mǎn)玻璃缸。根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)論[10]，控制艾煙濃度為5～15 mg/m3。用粉塵測(cè)試儀測(cè)試其濃度達(dá)到預(yù)定范圍后(此過(guò)程艾條燃燒約15秒)，將艾條取出，迅速封閉圓孔。此后每隔3分鐘記錄一次濃度數(shù)值，使?jié)舛确€(wěn)定在10 mg/m3左右。若數(shù)值高于15 mg/m3，可將上方玻璃蓋稍微移動(dòng)，令艾煙散去部分后迅速將蓋子移回；若數(shù)值低于5 mg/m3，可再將點(diǎn)燃的艾條由圓孔插入，以補(bǔ)充艾煙。20分鐘后，取出小鼠，每周干預(yù)6天，共干預(yù)12周。

香煙干預(yù)：除將艾條換成香煙，香煙濃度及干預(yù)方式與艾煙組相同。在進(jìn)行香煙干預(yù)時(shí)要保證與其他組別嚴(yán)格隔離，避免其他組別嗅到香煙。

于第13周進(jìn)行跳臺(tái)試驗(yàn)。將小鼠置于被動(dòng)回避反應(yīng)箱(20 cm×20 cm×10 cm)，適應(yīng)3分鐘，然后底部銅柵通電(AC，40V)，通電時(shí)間5分鐘。小鼠遭受電擊后，會(huì)跳上絕緣墊躲避電擊；當(dāng)從安全臺(tái)上跳下觸及電柵遭受電擊即為錯(cuò)誤反應(yīng)，記錄小鼠首次跳上絕緣墊所需時(shí)間即反應(yīng)時(shí)間，5分鐘內(nèi)跳下圓臺(tái)次數(shù)(錯(cuò)誤次數(shù))，作為學(xué)習(xí)成績(jī)。24小時(shí)后重復(fù)上述測(cè)試，記錄小鼠首次從安全臺(tái)跳至銅柵所需時(shí)間即潛伏時(shí)間、5分鐘內(nèi)跳下圓臺(tái)次數(shù)(錯(cuò)誤次數(shù))，作為記憶成績(jī)。

1.4 取材方法與標(biāo)本制備

隨機(jī)選取6只，用10%水合氯醛按3 mL/kg腹腔注射麻醉小鼠，以4%多聚甲醛頸動(dòng)脈灌注法固定腦組織，靜置30分鐘后開(kāi)顱取腦，置4%多聚甲醛中固定過(guò)夜，流水沖洗30分鐘，用各級(jí)乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟，常規(guī)包塊。轉(zhuǎn)化切片機(jī)切片，制備腦冠狀面切片，片厚約6 μm。取等間隔的組織切片采用剛果紅染色[11]：切片脫臘脫水，甲醇剛果紅染液浸染10～20分鐘，用堿性乙醇分化液分化10秒，蒸餾水洗3分鐘，95%乙醇沖30秒；無(wú)水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固。光鏡下(×400)選取細(xì)胞數(shù)較為恒定的CA3區(qū)拍片，比較不同組小鼠的Aβ斑變化。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。跳臺(tái)試驗(yàn)中學(xué)習(xí)潛伏期、學(xué)習(xí)錯(cuò)誤次數(shù)、記憶潛伏期與淀粉樣蛋白陽(yáng)性面積各數(shù)據(jù)呈現(xiàn)正態(tài)分布以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，符合方差齊性，采用單因素方差分析(one-way ANOVA)進(jìn)行各組之間比較，LSD、SNK進(jìn)行兩兩比較,記憶錯(cuò)誤次數(shù)不符合正態(tài)分布以中位數(shù)(四分位距)表示，以非參數(shù)檢驗(yàn)經(jīng)行各組之間比較，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠學(xué)習(xí)成績(jī)與記憶成績(jī)對(duì)比

學(xué)習(xí)潛伏期中空白組反應(yīng)時(shí)間最短，模型組反應(yīng)時(shí)間最長(zhǎng)，各組之間比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=10.574，P=0.000<0.01)。與模型組相比，空白組(P=0.000<0.01)、艾煙組(P=0.000<0.01)、香煙組(P=0.006<0.01)反應(yīng)時(shí)間較短，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。艾煙組與香煙組無(wú)差別。學(xué)習(xí)錯(cuò)誤次數(shù)各組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差別。

記憶潛伏期中艾煙組記憶時(shí)間最長(zhǎng)，模型組記憶時(shí)間最短。各組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=16.227，P=0.000<0.01)。與模型組相比，空白組(P=0.000<0.05)、艾煙組(P=0.000<0.01)、香煙組(P=0.011<0.05)反應(yīng)時(shí)間顯著延長(zhǎng)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。艾煙組與香煙組無(wú)差別。記憶錯(cuò)誤次數(shù)以模型組最多，空白組與艾煙香煙組中位數(shù)均為0低于模型組，并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。說(shuō)明艾煙與艾灸可降低ApoE-/-小鼠學(xué)習(xí)記憶能力減低程度，見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠跳臺(tái)試驗(yàn)結(jié)果

注：與模型組比較aP<0.05，bP<0.01。

2.2 各組小鼠海馬Aβ沉淀

經(jīng)剛果紅染色的ApoE-/-小鼠海馬CA3區(qū)在高倍光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察(圖1)，模型組小鼠在視野范圍內(nèi)有明顯的粉紅色彌散樣Aβ沉淀(如圖1中箭頭所示)，而空白組小鼠切片在同樣部位未顯現(xiàn)出淀粉樣變，Aβ面積以模型組最高，空白組最低?？瞻捉M明顯低于模型組(P=0.00<0.05)(見(jiàn)表2),說(shuō)明造模成功。ApoE-/-小鼠經(jīng)過(guò)12周艾煙與香煙治療后，艾煙組與香煙組在相同海馬區(qū)域CA3中Aβ沉淀均有不同程度的減少,艾煙組中Aβ沉淀較模型組顯著降低(P=0.004<0.05)，較香煙組亦有減少(P=0.022<0.05)。說(shuō)明艾煙可以減少ApoE-/-小鼠海馬Aβ沉淀。

A：空白組；B：模型組；C：艾煙組；D：香煙組注：箭頭所示為海馬中彌散的粉紅色Aβ淀粉樣沉淀。圖1 各組小鼠海馬CA3區(qū)經(jīng)剛果紅染色后淀粉樣蛋白沉淀情況(×400)

組別n淀粉樣蛋白陽(yáng)性面積(μm2)空白組6101.25±82.68a模型組637661.70±12349.53香煙組635455.84±18836.45艾煙組64034.43±1992.05ab

注：與模型組比較aP<0.01，與香煙組比較bP<0.01。

3 討論

現(xiàn)代研究證明ApoE基因與動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)、阿茲海默病(Alzheimer’s disease，AD)等血管疾患及中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)功能障礙有關(guān)。在心血管系統(tǒng)中，ApoE基因缺失可導(dǎo)致高脂血癥并逐步演化為AS；在CNS內(nèi)，ApoE由星形膠質(zhì)細(xì)胞合成并分泌，參與維護(hù)膽固醇、磷脂的動(dòng)態(tài)平衡，調(diào)節(jié)神經(jīng)膜重塑時(shí)膽固醇與磷脂的動(dòng)員與再分布，從而參與調(diào)節(jié)突觸可塑性的維護(hù)以及神經(jīng)細(xì)胞受損時(shí)的修復(fù)[12]。因此，載脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠除了應(yīng)用在動(dòng)脈粥樣硬化癥的研究中，還作為一種新型動(dòng)物模型應(yīng)用于認(rèn)知障礙發(fā)生機(jī)制的研究中[13]。

在ApoE基因的三個(gè)亞型中ApoE4被證明與阿茲海默病有著最為密切的關(guān)系，它主要通過(guò)影響腦血管系統(tǒng)導(dǎo)致諸如Aβ沉淀等神經(jīng)毒素的累積[14]。1991年，Namba等人發(fā)現(xiàn),在Aβ沉積和神經(jīng)原纖維中,可以檢測(cè)到ApoE蛋白成分,進(jìn)一步研究證實(shí)ApoE蛋白能夠和Aβ形成前沉積樣顆粒[15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組較空白組學(xué)習(xí)記憶能力差，其海馬Aβ沉淀面積顯著高于空白組，證實(shí)了ApoE-/-小鼠可以產(chǎn)生類(lèi)似阿茨海默病的腦部病理表現(xiàn)，說(shuō)明此小鼠模型應(yīng)用于認(rèn)知功能障礙的研究是切實(shí)可行的。產(chǎn)生這種病理改變的原因很可能是由于ApoE基因的缺失，使得淀粉前體蛋白的分裂增加，導(dǎo)致Aβ沉積異常增多[14-16]。

艾煙與香煙雖然都是常見(jiàn)的可吸入煙霧，但其安全性卻相去甚遠(yuǎn)。香煙煙霧成分復(fù)雜，其中很多化合物具有致畸、致突變的作用[17]。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，吸煙會(huì)導(dǎo)致呼吸系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)發(fā)病率的提高。不同于香煙煙霧，本課題組在前期對(duì)艾煙安全性研究中發(fā)現(xiàn)臨床濃度下的艾煙煙霧不會(huì)對(duì)呼吸、心血管等系統(tǒng)臟器產(chǎn)生毒性影響，且不會(huì)引起全身過(guò)敏反應(yīng)[18]，初步證實(shí)了艾煙的安全性。

艾煙作為艾灸過(guò)程中的燃燒生成物，其主要成分與生物活性都影響著艾灸療效的發(fā)揮。在課題組前期利用氣相色譜—質(zhì)譜技術(shù)對(duì)艾燃燒生成物進(jìn)行分析[19]，結(jié)果共得到85種不同的化學(xué)成分，其中大部分為芳烴、萜類(lèi)和一些長(zhǎng)鏈脂肪烴，而其揮發(fā)油成分則鑒定出26種[20]。艾煙作為具有獨(dú)特氣味的煙氣，其作用途徑很可能通過(guò)嗅覺(jué)。艾煙中多種氣味化合物與特異受體結(jié)合激活氣味受體細(xì)胞并產(chǎn)生電信號(hào)，通過(guò)特異性的嗅覺(jué)通路將嗅覺(jué)信息投射到下丘腦、邊緣系統(tǒng)、海馬等部位，直接參與情緒與學(xué)習(xí)記憶等行為的調(diào)控[21-22]。在艾煙生物活性研究中，發(fā)現(xiàn)艾煙不僅可以降低wistar大鼠血清中氧化修飾低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，ox-LDL)和血管性假血友病因子水平，升高低密度脂蛋白受體(low density lipoprotein receptor，LDL-r)，從而對(duì)脂質(zhì)代謝產(chǎn)生良性調(diào)整作用[23]；還可通過(guò)提高快速老化小鼠系8(senescence-accelerated mouse prone 8，SAM-P8)小鼠腦中抗氧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性，調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞因子平衡[10]，起到調(diào)節(jié)免疫和抗氧化的作用。吸煙可以引起肺癌與呼吸道損傷，但其主要毒性物質(zhì)尼古丁卻被報(bào)道其具有改善AD小鼠學(xué)習(xí)記憶行為的作用[24]。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，艾煙與香煙均能不同程度的改善ApoE-/-小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能，艾煙組海馬中Aβ沉淀顯著低于模型組與香煙組，說(shuō)明艾煙可減少ApoE-/-小鼠腦中Aβ沉淀，其作用途徑可能是通過(guò)艾煙本身的活性成分經(jīng)黏膜吸收與干預(yù)嗅覺(jué)系統(tǒng)的神經(jīng)遞質(zhì)，影響嗅覺(jué)傳導(dǎo)的信號(hào)改變，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，改善腦內(nèi)Aβ沉積與清除之間的失衡，進(jìn)而抑制Aβ沉淀的累積。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果再次證明了ApoE-/-小鼠可以作為阿茨海默病的動(dòng)物模型。并說(shuō)明艾煙的確可以降低ApoE-/-小鼠的腦內(nèi)淀粉蛋白沉淀，改善學(xué)習(xí)記憶功能進(jìn)而起到延緩腦組織衰老的作用。

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(本文編輯：董歷華)

Effects of moxa and cigarette smoke on behavioral changes and brain β amyloid deposition in apolipoprotein E-deficient mice

LIUJun-tian，CUIYing-xue，HUANGYu-hai，etal.

CollegeofAcumoxandTuina，BeijingUniversityofChineseMedicine，Beijing100029，China

ZHAOBai-xiao，Email：baixiao100@gmail.com

Objective To investigate the influence of moxa smoke and cigarette smoke on the apolipoprotein E-deficient (ApoE-/-) male mice’ learning and memory ability and β amyloid deposition in brain hippocampus. Method 13 eight weeks old C57BL/6 mice were assigned to control group; 27 eight weeks old ApoE-/-mice were randomly divided into 3 groups (n=9/group): model group, moxa smoke group, cigarette smoke group. Mice in the two smoke groups were exposed to smoke, which concentration is controlled within 5～15 mg/m3; mice in model group and control group were exposed to normal air. The step-down test was conducted in the 13th week. Level of β amyloid deposition was determined by congo red staining. Results Compared with the model group, mice in control group, moxa smoke group and cigarette smoke group showed decreased learning latency, increased memory latency and made less mistakes in the step-down test (P< 0.05). Compared with the model group, β amyloid deposition of control group, moxa smoke group and cigarette smoke group was significantly decreased (P< 0.05). Conclusion Our findings suggest that moxa smoke may have effect on protecting nerve function and anti-aging by reducing the deposition of β amyloid in hippocampus.

Moxa smoke； Cigarette smoke； Apolipoprotein E-deficient mice； Amyloid； Step-down test

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81373730)；北京中醫(yī)藥大學(xué)自主課題(0100604214，0100605132)

100029 北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院[劉鈞天(博士研究生)、黃玉海(碩士研究生)、黃暢(博士研究生)、黃劍(博士研究生)、趙百孝、韓麗、楊佳(博士研究生)、王磊(博士研究生)]；北京中醫(yī)醫(yī)院針灸科(崔瑩雪)

劉鈞天(1986- )，女，2012級(jí)在讀博士研究生。研究方向：艾灸作用原理研究。E-mail:juntianyt@hotmail.com

趙百孝(1963- )，博士，教授。研究方向：針灸作用原理與艾灸效應(yīng)機(jī)制研究。 E-mail:baixiao100@gmail.com

R245.81

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2015.05.004

2014-09-02)