王 萍，蔡小軍，朱 怡，熊 期，張 菁，李朝輝，余愛華

(武漢大學(xué)中南醫(yī)院，湖北 武漢 430071)

論 著

HSP70在先天性白內(nèi)障小鼠晶狀體上皮細(xì)胞中的表達(dá)及意義

王 萍，蔡小軍，朱 怡，熊 期，張 菁，李朝輝，余愛華

(武漢大學(xué)中南醫(yī)院，湖北 武漢 430071)

目的 探討熱休克蛋白(heat shock protein, HSP)70在先天性白內(nèi)障小鼠模型晶狀體上皮細(xì)胞中的表達(dá)及意義。方法 先天性白內(nèi)障BALB/c-Cat小鼠為實(shí)驗(yàn)組，正常BALB/c小鼠為對照組，每組16只。將實(shí)驗(yàn)組與對照組均各取8只分別進(jìn)行Western blot蛋白印跡法和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測小鼠眼睛晶狀體上皮細(xì)胞中HSP70及HSP70基因的表達(dá)水平，以β-actin作為內(nèi)參校正，比較2組間HSP70表達(dá)的差異。結(jié)果 HSP70在小鼠晶狀體上皮細(xì)胞的相對表達(dá)值實(shí)驗(yàn)組為0.105 0±0.041 4,對照組為0.188 7±0.023 6，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.972 0，P<0.01)；小鼠晶狀體上皮細(xì)胞HSP70基因的相對表達(dá)值實(shí)驗(yàn)組為0.131 3±0.003 5，對照組為0.334 0±0.004 2,2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=37.026，P<0.01)。結(jié)論 HSP70在先天性白內(nèi)障小鼠病情的發(fā)生、發(fā)展中能起一定的細(xì)胞保護(hù)作用。

先天性白內(nèi)障；晶狀體上皮細(xì)胞；熱休克蛋白HSP70；BALB/c小鼠

先天性白內(nèi)障是導(dǎo)致兒童失明的主要原因之一，在發(fā)達(dá)國家其發(fā)病率為1～4/10 000萬，在發(fā)展中國家其發(fā)病率為5～215/10 000萬，全世界有13萬～20萬雙側(cè)先天性白內(nèi)障患者致盲，并正以每年2萬～4萬/年的速度遞增[1]。先天性白內(nèi)障能導(dǎo)致嬰幼兒失明或弱視，其中失明兒童中有22%～30%為先天性白內(nèi)障所致，已成為兒童失明的第二位原因[2]。先天性白內(nèi)障是由于胚胎時(shí)期晶狀體代謝發(fā)生異常而導(dǎo)致其自身透明度下降的疾病[3]。染色體異常為先天性白內(nèi)障主要致病原因，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種基因的突變體與臨床及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)性先天性白內(nèi)障發(fā)生有關(guān)。由于蛋白質(zhì)才是各種生命活動(dòng)真正的執(zhí)行者，基因是不能解釋一切的，隨著蛋白質(zhì)檢測技術(shù)的發(fā)展，先天性白內(nèi)障的研究也將進(jìn)入蛋白質(zhì)的研究階段。熱休克蛋白70(heat shock protein 70，HSP70)是生物體(或離體培養(yǎng)細(xì)胞)在不良環(huán)境因素作用下所產(chǎn)生的一組具有高度保守性的應(yīng)激蛋白[4]，其作為ATP依賴的分子伴侶可以輔助新合成的多肽進(jìn)行正確的折疊、多蛋白復(fù)合物的聚合以及蛋白質(zhì)通過膜的轉(zhuǎn)運(yùn)，同時(shí)HSP70通過抑制應(yīng)激時(shí)蛋白質(zhì)分子的錯(cuò)誤折疊，修復(fù)或降解損傷的蛋白，從而協(xié)助組織細(xì)胞的恢復(fù)，維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，促進(jìn)細(xì)胞的生存[5]。本研究以Crygc基因突變的先天性白內(nèi)障小鼠為模型，探討HSP70在先天性白內(nèi)障小鼠模型晶狀體上皮細(xì)胞中的表達(dá)及其意義。

1 實(shí)驗(yàn)資料

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 先天性白內(nèi)障BALB/c-Cat小鼠16只，鼠齡2～3周，雌雄不限，體質(zhì)量50～100 g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。正常BALB/c小鼠16只，鼠齡2～3周，雌雄不限，體質(zhì)量50～100 g，購自武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。實(shí)驗(yàn)前2組小鼠均進(jìn)行散瞳，并進(jìn)行裂隙燈檢查排除角膜病及葡萄膜、玻璃體疾病。

1.1.2主要試劑及儀器 鼠抗人單克隆單體HSP70和Actin (深圳晶美生物制品公司)，Westem blot檢測試劑盒(美國cellsignaling公司)，Trizol試劑(Invitrogen 公司)，HSP70及β-actin基因引物(Invitrogen Biotechnology Co., LTD中國公司合成)；PCR儀(美國PE公司)，離心機(jī)(Heal Force公司 )， PCR檢測系統(tǒng)(上海宏石醫(yī)療科技有限公司)，超凈工作臺(tái)(蘇凈安泰)，電泳儀(北京六一儀器廠)，Tanon-1600R型凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)，裂隙燈，顯微鏡，顯微器械。

1.2方法 購買后的小鼠環(huán)境適應(yīng)時(shí)間為1周。 給予10%水合氯醛腹腔內(nèi)注射(3 mg/kg),麻醉后，將小鼠頸椎脫臼致死，在顯微鏡下摘除雙側(cè)眼球，并用生理鹽水進(jìn)行沖洗；置于冰浴中，剪除角膜、虹膜，摘出完整之晶狀體，生理鹽水沖洗；分離出晶狀體囊膜，因單個(gè)晶狀體囊膜HSP70表達(dá)含量較少且不穩(wěn)定，所以將2個(gè)晶狀體囊膜合并放入1.5 mL Ep冷凍管，于液氮瓶下保存。采用Western-blot蛋白印跡法檢測2組小鼠眼睛晶狀體囊膜上皮細(xì)胞中HSP70蛋白的表達(dá)，按照常規(guī)方法完成SDS-PAGE凝膠的灌制和分離蛋白的電轉(zhuǎn)移，印跡膜片與上述的一抗及HRP標(biāo)記的二抗相繼孵育后，經(jīng)過反復(fù)漂洗，與化學(xué)發(fā)光試劑溫育，經(jīng)X射線片曝光顯現(xiàn)特異的蛋白信號，將膠片進(jìn)行掃描存檔，Alpha軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的光密度值，以β-actin作為內(nèi)參校正，行半定量分析。采用RT-PCR法檢測2組小鼠服睛晶狀體囊膜上皮細(xì)胞HSP70基因的表達(dá)，RT-PCR條件：55 ℃逆轉(zhuǎn)錄30 min，94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃持續(xù)30 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，進(jìn)行30個(gè)PCR循環(huán)后72 ℃ 7 min。取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行0．8%瓊脂糖電泳，以Kodak 2 000凝膠成像系統(tǒng)對擴(kuò)增條帶進(jìn)行密度掃描和分析。以151 bp β-actin作為內(nèi)參照，并按照下列公式計(jì)算HSP70的相對表達(dá)值：被檢測基因表達(dá)值=被檢測基因光密度/β-actin光密度。

2 結(jié) 果

2.12組小鼠晶狀體囊膜上皮細(xì)胞中HSP70蛋白表達(dá)情況 2組小鼠晶狀體囊膜上皮細(xì)胞上HSP70蛋白均有表達(dá)，見圖1。其中實(shí)驗(yàn)組小鼠晶狀體囊膜上皮細(xì)胞中HSP70蛋白的相對表達(dá)值明顯低于對照組(t=4.972 0，P<0.01)，見表1。

E為實(shí)驗(yàn)組，C為對照組。

表1 2組小鼠晶狀體囊膜上皮細(xì)胞中HSP70蛋白表達(dá)情況±s)

注：①與對照組比較,P<0.01。

2.22組小鼠晶狀體囊膜上皮細(xì)胞中HSP70基因表達(dá)情況 HSP70基因在2組小鼠晶狀體囊膜上皮細(xì)胞上的表達(dá)情況見圖2，HSP70基因和內(nèi)參β-actin分別擴(kuò)展基因片段，1～2為對照組小鼠晶狀體囊膜上皮細(xì)胞上HSP70基因的擴(kuò)展產(chǎn)物，3～8為實(shí)驗(yàn)組小鼠晶狀體囊膜上皮細(xì)胞上HSP70基因的擴(kuò)展產(chǎn)物，2組小鼠晶狀體囊膜上皮細(xì)胞上HSP70基因的擴(kuò)展產(chǎn)物約為255 bp。圖像分析儀測量瓊脂糖凝膠上HSP70/β-actin的平均灰度，結(jié)果實(shí)驗(yàn)組HSP70基因相對表達(dá)值明顯低于對照組(t=37.026，P<0.01)，見表2。

圖2 2組小鼠晶狀體囊膜上皮細(xì)胞中HSP70的表達(dá)情況

表2 2組小鼠晶狀體囊膜上皮細(xì)胞中HSP70基因表達(dá)情況

注：①與對照組比較，P<0.01。

3 討 論

機(jī)體在正常生理應(yīng)激和病理狀態(tài)下，都可激活一組基因——熱休克基因，產(chǎn)生具有高度保守性的氨基酸序列及其編碼基因所表達(dá)的蛋白質(zhì)，即HSPs，以增強(qiáng)保護(hù)機(jī)體自身細(xì)胞免受應(yīng)激因子的損傷的作用，其在原核細(xì)胞及真核細(xì)胞中均廣泛存在。HSPs對生物體在嚴(yán)酷環(huán)境下的生存起重要作用，又名應(yīng)激蛋白[6]。HSPs種類繁多，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)10多種，目前尚無明確的分類標(biāo)準(zhǔn)，主要的HSPs可分為4個(gè)家族，即HSP90家族(分子量為83～90 kD)、HSP70家族(分子量為66～78 kD)、HSP60以及小分子量HSP家族(分子量為12～43 kD)[7]。其中HSP70是HSP大家族中的重要成員，它在正常細(xì)胞中有基礎(chǔ)性表達(dá)，表達(dá)水平比較低，而在應(yīng)激后表達(dá)顯著增高。HSP70作為主要的分子伴侶之一，在維持機(jī)體正常的生理活動(dòng)中起了重要的作用。由于晶狀體無血管供給營養(yǎng)，也沒有神經(jīng)支配，各種應(yīng)激因子均可對其造成損害，并影響晶狀體的正常代謝。當(dāng)晶狀體蛋白質(zhì)發(fā)生變性或其結(jié)構(gòu)出現(xiàn)異常，不溶性蛋白質(zhì)或異常蛋白質(zhì)會(huì)增加，透明晶狀體發(fā)生混濁，導(dǎo)致白內(nèi)障。在混濁晶狀體中不可溶性蛋白質(zhì)增加，可能是由于HSP70的缺乏或缺陷造成，缺氧及滲透性應(yīng)激可導(dǎo)致晶狀體蛋白的展開和分解并導(dǎo)致晶狀體混濁，ATP和HSP幫助展開的蛋白質(zhì)重新折疊，但如果這一層防御措施失效，則變性蛋白將被消化或細(xì)胞進(jìn)入凋亡途徑，在此過程中HSP促進(jìn)其消化或凋亡[8]。Li 等[9]研究顯示，HSP70可以通過抑制線粒體細(xì)胞色素C的釋放及Caspase-3 的活化而抑制細(xì)胞凋亡。目前醫(yī)學(xué)界對HSP70在許多組織及疾病中的作用進(jìn)行了廣泛的研究，國內(nèi)很多學(xué)者都對HSP70在年齡相關(guān)性白內(nèi)障發(fā)生發(fā)展中的作用進(jìn)行了研究，結(jié)果均提示老年性白內(nèi)障中HSP70含量明顯高于正常對照組，推測在老年性白內(nèi)障中，細(xì)胞發(fā)生氧化損傷后，誘導(dǎo)產(chǎn)生更多的HSP70，以此發(fā)揮其細(xì)胞保護(hù)、分子伴侶、調(diào)節(jié)凋亡及抗氧化等方面的重要作用[7]。最終形成的白內(nèi)障則可能由于負(fù)性影響大于保護(hù)因素所致。

本實(shí)驗(yàn)以BALB/c-Cat小鼠為先天性白內(nèi)障模型。BALB/c-Cat小鼠于2006年12月在大規(guī)模生產(chǎn)(BALB/C♂×ICR♀)F1代小鼠時(shí)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)10個(gè)世代回交，通過白內(nèi)障雜合子小鼠自交，培育成先天性白內(nèi)障近交系小鼠，呈常染色體顯性遺傳，同時(shí)將其命名為BALB/c-Cat小鼠[10]。2009年上海東華大學(xué)發(fā)現(xiàn)該白內(nèi)障小鼠是由于Crygc基因發(fā)生突變而導(dǎo)致的。Crygc基因是小鼠γ-C晶狀體蛋白的編碼基因，γ-C晶狀體蛋白是晶狀體的重要結(jié)構(gòu)蛋白。Crygc基因位于小鼠1號染色體的D1Mit236和D1Mit19之間約11 cM內(nèi)，BALB/c-Cat小鼠Crygc亞基第3個(gè)外顯子的209 bp處缺失一個(gè)堿基。該突變在Crygc亞基第3外顯子的76位引入終止密碼子，使正常蛋白質(zhì)丟失了15個(gè)氨基酸，第二結(jié)構(gòu)域中的保守區(qū)被破壞、變短，形成截短蛋白，保守序列對維持蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能是相當(dāng)重要的，變短則影響了晶狀體蛋白的功能，導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，突變后縮短的γ-C晶狀體蛋白可能失去與其他分子間正常的相互作用，或?qū)е卤旧淼牟蝗芙庑訹11]。在蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)分析中，突變型蛋白的C-末端缺失一個(gè)β-折疊。β-折疊結(jié)構(gòu)也是蛋白質(zhì)構(gòu)象中經(jīng)常存在的一種結(jié)構(gòu)方式，對于晶狀體而言，β-折疊有利于其形成球狀的結(jié)構(gòu)，因此當(dāng)其失去時(shí)，多肽鏈空間的伸張失去平衡，正是由于γ-C晶狀體蛋白的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生了改變，導(dǎo)致晶狀體內(nèi)發(fā)生了上述一系列的改變，引發(fā)白內(nèi)障[11]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示HSP70和HSP70基因在先天性白內(nèi)障小鼠和正常小鼠的晶狀體上皮細(xì)胞中均有表達(dá)，且先天性白內(nèi)障小鼠的表達(dá)均低于正常小鼠，推測HSP70在先天性白內(nèi)障小鼠的晶狀體上皮細(xì)胞中表達(dá)減少，可能對白內(nèi)障的形成起到一定的作用。其機(jī)制可能是Crygc基因突變后，機(jī)體產(chǎn)生一定的應(yīng)激反應(yīng)，HSP70應(yīng)保護(hù)細(xì)胞應(yīng)對這一反應(yīng)。而缺失的HSP70導(dǎo)致細(xì)胞或生物從各種應(yīng)激中恢復(fù)的能力下降，降低了細(xì)胞對損害的耐受程度，從而不能有效地保護(hù)它們免遭這些應(yīng)激因素的損害，影響了細(xì)胞正常代謝。HSP70不僅可以與新生、未折疊的正常蛋白質(zhì)結(jié)合，輔助新合成的多肽鏈折疊，還可以與錯(cuò)折疊或聚集的蛋白質(zhì)相結(jié)合，使某些蛋白質(zhì)解離，減少不溶性聚集物的產(chǎn)生。同時(shí)HSP70的缺失導(dǎo)致機(jī)體不能將某些變性蛋白及時(shí)降解和清除，并且延緩了正常蛋白質(zhì)合成的恢復(fù)。Crygc基因突變后，γ-C晶狀體蛋白縮短，HSP70的缺失使其不能幫助γ-C晶狀體蛋白進(jìn)行正確的折疊，影響了γ-C晶狀體蛋白肽鏈的伸展?fàn)顟B(tài)，增加了γ-C晶狀體蛋白的不溶解性。在這兩大方面的因素的綜合影響下，小鼠晶狀體蛋白質(zhì)發(fā)生變性，不溶性蛋白質(zhì)增多，透明晶狀體出現(xiàn)混濁，從而導(dǎo)致白內(nèi)障發(fā)生。

本實(shí)驗(yàn)力求從蛋白質(zhì)水平對先天性白內(nèi)障形成原因進(jìn)行初步探討，進(jìn)一步為先天性白內(nèi)障的防治工作提供新視野。隨著對HSP70研究的不斷深入，HSP 70在先天白內(nèi)障上的應(yīng)用價(jià)值也將不斷被開發(fā)出來?？梢园袶SP70具有的抗氧化應(yīng)激、分子伴侶、細(xì)胞保護(hù)作用應(yīng)用到先天性白內(nèi)障的防治上，這是一項(xiàng)值得深入探討的課題，擁有極為廣闊的前景。但本研究對HSP70在先天性白內(nèi)障小鼠晶狀體上皮細(xì)胞中降低的分子機(jī)制方面還不明了，將在接下來的工作中做進(jìn)一步的研究與探討。

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Expression and significance of HSP70 in congenital cataract lens epithelial cells of mice

WANG Ping, CAI Xiaojun, ZHU Yi, XIONG Qi, ZHANG Jing, LI Zhaohui, YU Aihua

(Zhongnan Hospital of Wuhan University, Wuhan 430071, Hubei, China)

Objective It is to approach the expression of heat shock protein 70 (HSP70) in lens epithelial cells (LECs) in mice model of congenital cataract and clarify the effect of HSP70 on pathogenesis of congenital cataract. Methods The lens capsule membrane in mice was chose as the research object, there was 16 cases (32 eyes) of normal BALB/c mouse in control group, and 16 cases (32 eyes) of congenital cataract BALB/c-Cat mouse in experimental group. The expression of HSP70 protein and HSP70 gene was assayed using Western blot method of protein imprinting and reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) method in the two groups of mice eye lens epithelial cells. Using β-actin as the confidential reference items for correction, the differences of HSP70 expression was compared between the two groups. Results The relative values of HSP70 expression to β-actin is 0.105 0+0.041 4 in congenital cataract LECs, while is 0.188 7+0.023 6 in normal control group, there was significant different in the expression of HSP70 between the two groups (t=4.972 0,P<0.01). The relative expression value of HSP70 gene is 0.131 3±0.003 5 in the experimental group and 0.334 0±0.004 2 in the normal group, there was significant difference between them (t=37.026,P<0.01). Conclusion HSP70 is associated with the occurrence and development of congenital cataract and it plays an important role in the cytoprotection.

congenital cataract; lens epithelial cells; heat shock protein 70, BALB/c mice

王萍，女，碩士，研究方向?yàn)榘變?nèi)障發(fā)生機(jī)制與治療。

蔡小軍，E-mail：xiaojuncai86@yahoo.com.cn

湖北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2012FFB04324)

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.06.001

R-332

A

1008-8849(2015)06-0571-04

2014-09-10