羅 琦，楊 靜

(武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430000)

鴉膽子油乳制劑對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞的抑制效果及作用機(jī)制研究

羅 琦，楊 靜

(武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430000)

目的 探討鴉膽子油乳制劑對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞的抑制效果及作用機(jī)制。方法 觀察不同濃度(5，10 μg/mL)鴉膽子油乳處理Hela細(xì)胞后的形態(tài)改變;檢測(cè)不同濃度鴉膽子油乳(2.5，5，10，20，40 μg/mL)處理后對(duì)Hela細(xì)胞的抑制率，并觀察鴉膽子油乳處理濃度分別為10，20 μg/mL時(shí)細(xì)胞周期的變化情況。結(jié)果 鴉膽子油乳處理宮頸癌Hela細(xì)胞后出現(xiàn)凋亡小體,且細(xì)胞毒作用隨時(shí)間延長(zhǎng)毒性增強(qiáng)；在處理48 h后，研究組的抑制率均>60%,72 h后抑制率均>80%;伴隨鴉膽子油乳濃度的增加,G0～G1期細(xì)胞比率降低,S期及G2～M期細(xì)胞比率明顯增加。10 μg/mL和20 μg/mL鴉膽子油乳處理48 h后細(xì)胞凋亡率分別為60%與70%。結(jié)論 鴉膽子油乳能夠明顯抑制宮頸癌Hela細(xì)胞的增殖,且呈時(shí)間依賴性,能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,且使Hela細(xì)胞阻滯于S期。

宮頸癌Hela細(xì)胞;鴉膽子油乳;抑制增殖;巴氏染色;細(xì)胞凋亡

宮頸癌為女性常見(jiàn)的生殖道惡性腫瘤,手術(shù)聯(lián)合放化療是臨床上常用的有效治療方法。但大部分放化療藥物均具有較大的毒副作用,給宮頸癌女性帶來(lái)了嚴(yán)重傷害，故探尋一種毒副作用小的輔助放化療藥物迫在眉睫。鴉膽子油乳提取于苦木科植物鴉膽子成熟果實(shí),其主要富含油酸與亞油酸。鴉膽子油乳對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)具有顯著的抑制作用,臨床上用于配合腫瘤的放化療過(guò)程,具有一定的增效減毒功效[1-3]。本研究觀察了鴉膽子油乳處理宮頸癌Hela細(xì)胞后的形態(tài)及生長(zhǎng)周期等的變化情況,旨在探討鴉膽子油乳對(duì)Hela細(xì)胞的抑制效果及機(jī)制,為該藥物進(jìn)一步應(yīng)用于宮頸癌的臨床治療提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)資料

1.1試劑與藥品 鴉膽子油乳購(gòu)自沈陽(yáng)藥大藥業(yè)有限責(zé)任公司, 胰蛋白酶與小牛血清均由沈陽(yáng)寶信生物制品有限公司提供,宮頸癌Hela細(xì)胞株為本實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期保存,3-(4,5-二甲基噻-2)-2,5-二苯基四氮唑(MTT)、碘化丙啶(PI)、RPMI 1640培養(yǎng)液與二甲基亞砜(DMSO)等均購(gòu)自美國(guó)西格瑪公司。

1.2Hela細(xì)胞培養(yǎng) 將凍存的Hela細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇,使用含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng),設(shè)定溫度為37 ℃,將其置于CO2飽和濕度為5%的培養(yǎng)箱中,配置含有0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)的0.25%胰酶進(jìn)行消化并傳代培養(yǎng)。

1.3鴉膽子油乳處理Hela細(xì)胞后的形態(tài)觀查 將傳代24 h且生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞分為對(duì)照組、研究一組與研究二組,對(duì)照組不加鴉膽子油乳,研究一組與研究二組中分別添加5，10 μg/mL的鴉膽子油乳。使用倒置顯微鏡密切觀察Hela細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況。處理48 h后，分別收集3組Hela細(xì)胞,使用甲醛進(jìn)行固定,用Harris蘇木精染液、EA36染液、橙黃-G6染液及梯度濃度乙醇進(jìn)行巴氏染色,查看Hela細(xì)胞的形態(tài)變化情況。

1.4MTT法分析鴉膽子油乳作用于Hela細(xì)胞的效果 設(shè)計(jì)5個(gè)不同濃度的鴉膽子油乳(2.5，5，10，20，40 μg/mL)的研究組與陰性對(duì)照組,陰性對(duì)照組不加鴉膽子油乳。通過(guò)MTT法對(duì)細(xì)胞增殖抑制率進(jìn)行檢測(cè)。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞移至96孔板中,各孔細(xì)胞液均為200 μL,細(xì)胞數(shù)量約1×104個(gè),設(shè)定溫度為37 ℃,濃度為5%的CO2飽和濕度下繼續(xù)培養(yǎng)24 h。再將藥物分別加進(jìn)研究孔內(nèi),設(shè)定6個(gè)復(fù)孔,進(jìn)行24，48及72 h培養(yǎng),各孔添加20 μL的MTT,孵育4 h后,棄去上清液,加入150 μL DMSO后勻速振蕩10 min,在波長(zhǎng)為490 nm處使用酶標(biāo)儀測(cè)定光密度(D)。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(%)=(1-研究組D/對(duì)照組D)×100%。

1.5鴉膽子油乳處理Hela細(xì)胞后的細(xì)胞周期檢查 將傳代24 h后生長(zhǎng)狀態(tài)良好的Hela細(xì)胞分成正常細(xì)胞對(duì)照組與研究1組與研究2組。對(duì)照組中不添加鴉膽子油乳,研究1組、研究2組中分別加入質(zhì)量濃度為10，20 μg/mL的鴉膽子油乳。再進(jìn)行孵育48 h,按時(shí)取不同處理的Hela細(xì)胞,分析單細(xì)胞懸液,計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)在1×109L-1以上,使用PBS徹底清洗后進(jìn)行離心,再加入-20 ℃預(yù)冷后的無(wú)水乙醇進(jìn)行30 min固定。經(jīng)離心后將乙醇棄去,再用PBS進(jìn)行洗滌,再加入400 μL的碘化丙啶溶液,4 ℃處理20 min后使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1鴉膽子油乳處理后Hela細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察 鴉膽子油乳濃度與細(xì)胞生長(zhǎng)密度成反比,正常的多邊形細(xì)胞中異形細(xì)胞數(shù)目變多。鴉膽子油乳處理12 h后，細(xì)胞體積縮小,生長(zhǎng)密度降低,生長(zhǎng)受到抑制,皺縮細(xì)胞數(shù)目增多,上述現(xiàn)象研究二組比研究一組更為明顯。隨著處理時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng),大量無(wú)規(guī)則且膨大細(xì)胞從瓶壁上脫落最終降解為細(xì)胞碎片。巴氏法染色后發(fā)現(xiàn)對(duì)照組的細(xì)胞輪廓清晰,胞膜邊界完整,各細(xì)胞間的結(jié)構(gòu)十分緊密，見(jiàn)圖1。研究一組的Hela細(xì)胞體積縮小并皺縮,細(xì)胞間基本無(wú)連接, 核為溶解狀態(tài),染色質(zhì)朝向核膜聚集并顯示出凝塊狀態(tài),部分細(xì)胞呈發(fā)泡狀的凋亡小體。研究二組同樣可見(jiàn)染色質(zhì)濃縮及邊緣化,可清晰顯示出染色質(zhì)固縮于核膜周邊,出現(xiàn)發(fā)泡狀態(tài)的凋亡小體，見(jiàn)圖2。

圖1 對(duì)照組Hela細(xì)胞形態(tài)(400×)

圖2 研究組Hela細(xì)胞形態(tài)(400×)

2.2鴉膽子油乳處理Hela細(xì)胞后抑制細(xì)胞增殖情況 相同濃度的鴉膽子油乳處理Hela細(xì)胞24，48，72 h后,細(xì)胞抑制率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)。相同時(shí)間點(diǎn),不同濃度間的細(xì)胞抑制率略微增高,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。鴉膽子油乳處理Hela細(xì)胞后的細(xì)胞毒作用隨時(shí)間延長(zhǎng)毒性增強(qiáng),在處理48 h后研究組的抑制率均>60%,72 h后抑制率均>80%。見(jiàn)表1。

表1 鴉膽子油乳處理Hela細(xì)胞后抑制細(xì)胞增殖情況

2.3鴉膽子油乳處理Hela細(xì)胞后對(duì)細(xì)胞周期影響 伴隨鴉膽子油乳濃度的增加,G0～G1期細(xì)胞比率降低,S期和G2～M期細(xì)胞比率明顯增加。研究1組和研究2組細(xì)胞凋亡率分別為60%與70%。見(jiàn)表2。

3 討 論

宮頸癌是臨床常見(jiàn)的惡性腫瘤,近年來(lái)全球?qū)m頸癌的發(fā)病率與病死率呈現(xiàn)出日益增長(zhǎng)之勢(shì)，特別是處于生育期的女性所占比例最大, 據(jù)統(tǒng)計(jì),10%～15%的宮頸癌發(fā)生在育齡階段[4]。在歐洲國(guó)家的一些女性，在生育前即被診斷出患有宮頸癌,而有些手術(shù)措施不能保留生育能力[5-6]。

表2 鴉膽子油乳處理后對(duì)細(xì)胞周期的影響 %

注：①與0 μg/mL濃度比較，P<0.05。

鴉膽子油乳主要由油酸與亞油酸組成,在抗腫瘤與增強(qiáng)機(jī)體免疫力方面效果顯著[7]。鴉膽子油乳與腫瘤的放化療聯(lián)合使用已應(yīng)用于肝癌[8]、胰腺癌[9]、肺癌[10]、腦瘤[11]、食管癌[12]等各類惡性腫瘤;還能夠治療由HPV所導(dǎo)致的尋常疣、扁平疣、尖銳濕疣以及喉乳頭狀瘤等,但是將該藥應(yīng)用于宮頸癌治療則鮮有報(bào)道。本研究旨在研究鴉膽子油乳對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞的抑制效果,結(jié)果顯示鴉膽子油乳在體外可以顯著抑制宮頸癌Hela細(xì)胞的增殖,而且鴉膽子油乳處理Hela細(xì)胞后的細(xì)胞毒作用隨時(shí)間延長(zhǎng)毒性隨之增強(qiáng),在處理48 h后研究組的抑制率均>60%,72 h后抑制率均>80%。

細(xì)胞凋亡出現(xiàn)異常與腫瘤的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān),大多數(shù)化療藥物都是通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡來(lái)發(fā)揮作用的。王芳等[13]的研究顯示鴉膽子油乳可以誘導(dǎo)HL-60腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。本研究結(jié)果顯示,鴉膽子油乳處理Hela細(xì)胞后,細(xì)胞核固縮,染色質(zhì)出現(xiàn)濃縮聚集在核膜下,呈半月?tīng)?最終形成凋亡小體。而且通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)表明,鴉膽子油乳在10 μg/mL和20 μg/mL濃度下對(duì)Hela細(xì)胞均出現(xiàn)凋亡峰。上述結(jié)果均證實(shí)鴉膽子油乳抑制Hela細(xì)胞增殖的作用機(jī)制可能是誘導(dǎo)Hela細(xì)胞進(jìn)入了凋亡程序。

細(xì)胞周期中存在幾個(gè)檢查點(diǎn)即調(diào)定點(diǎn),其中以G1～S期轉(zhuǎn)換與G2～M期轉(zhuǎn)換最為關(guān)鍵。因?yàn)榛蚪M的穩(wěn)定性差,腫瘤細(xì)胞可以通過(guò)上述2個(gè)關(guān)鍵的檢查點(diǎn),故而體現(xiàn)出細(xì)胞周期運(yùn)行失控的特點(diǎn),最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞無(wú)限增殖以及細(xì)胞分化受阻。有報(bào)道顯示,一般G2～M檢查點(diǎn)被認(rèn)為對(duì)腫瘤治療的敏感性起決定性作用[14]。本研究應(yīng)用鴉膽子油乳處理Hela細(xì)胞,使其細(xì)胞周期分布發(fā)生變化,伴隨藥物濃度的不斷增加,S期與G2～M期細(xì)胞數(shù)量也顯著增加,G0～G1期細(xì)胞數(shù)明顯減少,表明鴉膽子油乳阻滯S期轉(zhuǎn)為G2～M期,使腫瘤細(xì)胞分裂能力下降,抑制腫瘤細(xì)胞的增殖?？傊?鴉膽子油乳誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并將其阻滯于S期,能夠有效抑制宮頸癌Hela細(xì)胞的增殖。

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Study on the inhibition effect and the mechanism of brucea javanica oil emulsion preparation in cervical cancer Hela cells

LUO Qi, YANG Jing

(Wuhan University School of Basic Medicine Sciences, Wuhan 430000, Hubei, China)

Objective It is to observe the inhibitory effect of Brucea javanica oil emulsion preparation on cervical cancer Hela cells, and approach its mechanism. Methods The morphology change of Hela cell after treated with different concentrations (5, 10 μg/mL) of brucea javanica oil was observed. The inhibition rate of Hela cells after treatment by different concentrations (2. 5, 5, 10, 20, 40 μg/mL) of brucea javanica oil emulsion on Hela cell were detected, and the change of cell cycle of Hela cell treated by 10 and 20 μg/mL of brucea javanica oil emulsion was observed. Results Apoptotic bodies was founder after treatment of brucea javanica oil emulsion in cervical cancer Hela cells, and the cytotoxic effect was increased with prolonged time; each group had more than 48% of inhibition rate after treated 48-hour,, and more than 80% after 72-hour; with the increase of brucea javanica oil emulsion concentration, the ratio of G0to G1phase cells was decreased, S phase and G2to M phase cell ratio were increased significantly. The cell apoptosis rate after treated with 10 and 20 μg/mL of brucea javanica oil emulsion for 48-hour were 60% and 70%. Conclusion Brucea javanica oil emulsion can obviously inhibit the proliferation of cervical cancer Hela cells, and was time dependent, it can induce cell apoptosis, and arrest the Hela cell cycle in S phase.

cervical carcinoma Hela cell; brucea javanica; proliferation inhibition; Papanicolaou staining; cell apoptosis

羅琦，女，主管藥師，研究方向?yàn)樾滤幯芯颗c評(píng)價(jià)、抗腫瘤藥物藥理和藥物毒理學(xué)。

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.06.002

R965

A

1008-8849(2015)06-0574-03

2014-09-01