張啟梅，盧東東

(1. 青海省湟中縣第二人民醫(yī)院，青海 湟中 811600；2. 廣西柳州市工人醫(yī)院，廣西 柳州 545000)

野艾蒿提取物對肝癌細(xì)胞系HepG2增殖的影響

張啟梅1，盧東東2

(1. 青海省湟中縣第二人民醫(yī)院，青海 湟中 811600；2. 廣西柳州市工人醫(yī)院，廣西 柳州 545000)

目的 探討野艾蒿提取物對肝癌細(xì)胞系HepG2增殖的影響及對肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞內(nèi)Bcl-2、Bax及Caspase-3基因表達(dá)的影響。方法 給予不同濃度的野艾蒿提取物(0，200，400，800 μg/mL)處理肝癌細(xì)胞系HepG2 24，48，72 h，采用MTT法檢測不同濃度的野艾蒿提取物對肝癌HepG2細(xì)胞增殖的影響；用RT-PCR法檢測肝癌細(xì)胞HepG2中Bax、Bcl-2以及Caspases-3基因的表達(dá)情況。結(jié)果 給予野艾蒿提取物400，800 μg/mL處理72 h后，Bax表達(dá)水平明顯低于0 μg/mL濃度(P<0.05)；給予野艾蒿提取物800 μg/mL處理24，48，72 h后，Bcl-2、Caspases-3基因表達(dá)水平均明顯低于0 μg/mL濃度(P均<0.05)。結(jié)論 野艾蒿提取物對肝癌細(xì)胞系HepG2的增殖有一定的抑制作用，其機(jī)制是野艾蒿提取物可抑制Bcl-2基因表達(dá)，上調(diào)Bax、Caspases-3基因的表達(dá)。

野艾蒿提取物；肝癌細(xì)胞；增殖

肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是最常見的惡性腫瘤之一，也是導(dǎo)致人群死亡的主要原因之一，盡管其診斷及治療方法仍在不斷的改進(jìn)完善，但其發(fā)病率和病死率仍表現(xiàn)為逐漸增加的趨勢，這一趨勢在亞洲國家尤為明顯[1-2]。目前一些抗癌藥物在治療肝癌患者的同時也帶來了其他一些不良反應(yīng)，故尋求新的治療靶點是目前防治肝細(xì)胞癌的重點，也是研究的熱點之一。野艾蒿為多年生草本植物，有艾葉、野艾之稱，而在廣西多稱之為苦艾，其在全國大部分地區(qū)均有分布，是傳統(tǒng)的食物及藥用植物。張璐敏等[3]研究提示野艾蒿具有抑制Hela癌細(xì)胞增殖的作用，提示野艾蒿對細(xì)胞增殖凋亡具有一定的影響。但野艾蒿對肝癌細(xì)胞HepG2的影響目前尚未明確，本課題擬通過給予不同濃度的野艾蒿提取物處理體外培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞系HepG2，以了解野艾蒿提取物對肝癌細(xì)胞增殖的影響，為野艾蒿的開發(fā)利用提供一定的實驗依據(jù)。

1 實驗資料

1.1細(xì)胞株與藥物 肝癌細(xì)胞系HepG2購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所；野艾蒿采于廣西柳州。

1.2主要試劑、耗材與儀器 DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；96孔板(美國Corning公司)；谷氨酰胺(美國Sigma公司)；胰蛋白酶、噻唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、新生小牛血清(購自北京久峰潤達(dá)生物技術(shù)有限公司)；總RNA提取試劑盒(北京久峰潤達(dá)生物技術(shù)有限公司)；cDNA第一鏈合成試劑盒、Taq DNA聚合酶(北京天恩澤生物技術(shù)有限公司)；Bcl-2、Bax、Caspase-3及GAPDH引物(上海生物工程有限公司合成)。酶聯(lián)免疫檢測儀(美國Bio-Rad公司)，低溫超速離心機(jī)(德國Eppendorf公司)，凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)，倒置顯微鏡(日本Olympus公司)，電泳儀(北京六一儀器廠)，冷凍干燥儀(北京博醫(yī)康儀器公司)，二氧化碳培養(yǎng)箱(日本SANY公司)。

1.3方法

1.3.1野艾蒿提取物的制備 新鮮野艾蒿葉100 g浸入800 mL 95%乙醇溶液中，使用索氏提取器回流提取8 h，蒸餾液旋蒸濃縮后冰凍干燥；將干燥藥物粉末溶于二甲基亞砜(DMSO)，使用蒸餾水分別配置成0，200，400，800 μg/mL濃度的溶液，使用0.22 μm過濾器過濾后備用。

1.3.2細(xì)胞培養(yǎng) 肝癌細(xì)胞系HepG2在含10%新生小牛血清的RPMI1640(含20 mmol/L Hepes，100 mol/mL青霉素/鏈霉素)培養(yǎng)液中培養(yǎng)，使用貼壁細(xì)胞傳代方法，2～3 d傳代1次。在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況。

1.3.3MTT細(xì)胞毒性試驗 取對數(shù)生長期的肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞懸液，以每孔1 000～10 000個細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，每孔體積200 μL，分為藥物組和對照組，藥物組加入不同濃度的野艾蒿提取物(每一濃度設(shè)6個復(fù)孔)，處理24，48，72 h后，每孔加入5% MTT 20 μL，繼續(xù)孵育4 h后終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加200 μL DMSO，振蕩10 min，在490 nm波長處測定各孔吸光值(OD)，記錄結(jié)果。細(xì)胞存活率計算公式：細(xì)胞存活率=(藥物組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)×100%。

1.4RT-PCR檢測目的基因表達(dá)情況 所使用的引物及其序列見表1。使用RNA快速提取試劑盒提取肝癌細(xì)胞系HepG2中總RNA，取1.0 μg總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，取1 μL逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性30 s，58～62 ℃退火45 s(不同引物的退火溫度略有不同)，72 ℃延伸1 min，72 ℃最終延伸10 min，共35次循環(huán)。PCR反應(yīng)結(jié)束后取2 μL反應(yīng)產(chǎn)物+10 μL 6×Loading Buffer在1.7%瓊脂糖凝膠中電泳，電泳結(jié)束后在凝膠成像系統(tǒng)下拍照，用Image J軟件分析各條帶灰度值。

表1 引物名及其序列

2 結(jié) 果

2.1不同濃度野艾蒿提取物對肝癌細(xì)胞系HepG2增殖的影響 給予200 μg/mL野艾蒿提取物及400 μg/mL處理72 h后，肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞存活率均明顯低于24 h時(P均<0.05)；給予800 μg/mL野艾蒿提取物處理48 h、72 h后，肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞存活率明顯低于24 h時(P均<0.05)。見表2。

表2 不同濃度野艾蒿提取物對細(xì)胞存活率影響±s，%)

注：①與同一時點0 μg/mL比較，P<0.05；②與同一藥物濃度24 h比較，P<0.05。

2.2不同濃度野艾蒿提取物對肝癌細(xì)胞系HepG2中Bcl-2、Bax及Caspase-3基因表達(dá)的影響 給予野艾蒿提取物400，800 μg/mL處理72 h后，Bax表達(dá)水平明顯低于0 μg/mL濃度(P<0.05)；給予野艾蒿提取物800 μg/mL處理48，72 h后，Bax表達(dá)水平明顯低于24 h時(P均<0.05)。給予野艾蒿提取物800 μg/mL處理24，48，72 h后，Bcl-2和Caspases-3基因表達(dá)水平均明顯低于0 μg/mL濃度(P均<0.05)；給予野艾蒿提取物800 μg/mL處理72 h后，Bcl-2和Caspases-3基因表達(dá)水平均明顯低于24 h時(P均<0.05)；給予野艾蒿提取物400 μg/mL處理48，72 h后，Caspases-3基因表達(dá)水平明顯低于0 μg/mL濃度(P均<0.05)。見表3～5及圖1～3。

表3 不同時間及藥物濃度處理后Bax表達(dá)灰度值±s)

注：①與同一時點0 μg/mL組比較，P<0.05；②與同一藥物濃度24 h時比較，P<0.05。

3 討 論

盡管遺傳事件在肝細(xì)胞癌的發(fā)生和進(jìn)展過程中的作用尚未十分明確，但目前的相關(guān)研究表明這一過程中至少涉及3種致癌途徑：p53、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤腫瘤抑制蛋白 (Rb)和Wnt/β-連環(huán)蛋白(Wnt/β-catenin )信號通路[4]。在正常情況下，Beclin-1是被一個復(fù)雜的相互抑制的Bcl-2/Bcl-xL途徑所抑制的，而一旦p53綁定到Bcl-2時，被抑制的Beclin-1功能即可得到解放，從而導(dǎo)致了細(xì)胞死亡[5]。由Bcl-2和Bax介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用已被大量研究所證實。

表4 不同時間及藥物濃度處理后Bcl-2表達(dá)灰度值±s)

注：①與同一時點0 μg/mL組比較，P<0.05；②與同一藥物濃度24 h時比較，P<0.05。

表5 不同時間及藥物濃度處理后Caspases-3基因表達(dá)灰度值±s)

注：①與同一時點0 μg/mL組比較，P<0.05；②與同一藥物濃度24 h時比較，P<0.05。

圖1 肝癌細(xì)胞系HepG2中Bax基因的表達(dá)情況

圖2 肝癌細(xì)胞系HepG2中Bcl-2基因的表達(dá)情況

Bcl-2和Bax是Bcl-2家族中2個調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因子，分別在抗細(xì)胞凋亡和促細(xì)胞凋亡過程中有重要的作用[6]。Bcl-2是一種位于線粒體外膜的抗凋亡因子，而Bax是一種位于線粒體基質(zhì)的促凋亡因子，二者通過控制蛋白酶和核酸酶的活性而發(fā)揮調(diào)節(jié)凋亡作用，而Bcl-2對抗Bax的作用主要是通過抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的開放來實現(xiàn)的[7-8]。同時，有研究提出，細(xì)胞凋亡的敏感性是由Bcl-2/Bax的比率來決定的，通過細(xì)胞線粒體來實現(xiàn)細(xì)胞凋亡的調(diào)控也是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因素[9]。高表達(dá)的Bcl-2細(xì)胞凋亡率相應(yīng)降低，而高表達(dá)的Bax細(xì)胞凋亡率相應(yīng)升高。近年來Bcl-2基因被認(rèn)為是直接或者間接設(shè)計抗癌藥物的靶點[10]。而本實驗也表明野艾蒿提取物對Bcl-2基因有一定的抑制作用，通過Bcl-2抗凋亡作用的抑制，從而導(dǎo)致細(xì)胞增殖受到影響，表現(xiàn)在給予800 μg/mL野艾蒿提取物處理72 h后，肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞存活率明顯低于0 μg/mL濃度。

圖3 肝癌細(xì)胞系HepG2中Caspases-3基因的表達(dá)情況

細(xì)胞凋亡的主要遞質(zhì)是半胱氨酸天冬蛋白酶家族(Caspases)的半胱氨酸蛋白水解酶類[11]。Degterve等[12]指出細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)途徑包括復(fù)雜的感應(yīng)信號以及Caspases的激活，在線粒體凋亡通路中，這一復(fù)雜的級聯(lián)反應(yīng)包括了細(xì)胞色素C的釋放以及結(jié)合凋亡蛋白酶激活因子-1(Apaf-1)、ATP，然后激活前體Caspases-9誘導(dǎo)凋亡小體的形成，而最后的細(xì)胞凋亡則是由Caspases-3的激活來實現(xiàn)的[13]，在這一過程中，Caspases-3是一個重要的關(guān)鍵因子，Caspase-3最終的激活誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡。

本實驗結(jié)果顯示，野艾蒿對肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞的增殖有一定的影響，并在細(xì)胞凋亡過程中能上調(diào)促凋亡基因Bax和Caspases基因的表達(dá)，并抑制了抑制凋亡基因Bcl-2的表達(dá)，提示野艾蒿提取物可調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax的表達(dá)，使Bcl-2/Bax比率發(fā)生改變，促進(jìn)了HepG2細(xì)胞的凋亡，同時通過參與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)Caspases-3的表達(dá)，導(dǎo)致HepG2細(xì)胞凋亡的發(fā)生，而這種作用與野艾蒿提取物的藥物濃度有一定關(guān)聯(lián)，在野艾蒿提取物濃度升高時這種作用較為明顯。張璐敏等[13]的相關(guān)實驗結(jié)果也證實了不同濃度的野艾蒿提取物對Hela癌細(xì)胞可發(fā)揮誘導(dǎo)凋亡和壞死的作用，與本實驗的結(jié)果一致。但是野艾蒿作為中草藥，其成分較為復(fù)雜，提取物中含有多種復(fù)合物成分，故野艾蒿中對細(xì)胞增殖有影響的具體有效成分及其影響細(xì)胞增殖的具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步實驗加以明確。

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Effect of extractive from Artemisia lavandulaefolia DC on hepatocelular carcinoma HepG2 cells proliferation

ZHANG Qimei1, LU Dongdong2

(1. The Second People’s Hospital of Huangzhong County, Huangzhong 811600, Qinghai, China; 2. The Worker’s Hospital of Liuzhou, Liuzhou 545000,Guangxi, China)

Objective It is to approach the influence of extractive from Artemisia lavandulaefolia DC on hepatocelular carcinoma HepG2 cells proliferation and the expression of Bax, Bcl-2, Caspases-3. Methods The HepG2 cells were treated with different concentrations (0, 200, 400, 800 μg/mL) of the extractive from Artemisia lavandulaefolia DC for 24, 48 and 78 hours; then the influence on cell proliferation of different concentrations of Artemisia lavandulaefolia DC were detected by MTT; the expression of Bax, Bcl-2, Caspases-3 gene in HepG2 cells were detected by RT-PCR. Results After treated with 400, 800 μg/mL of extractive form Artemisia lavandulaefolia DC for 72 hours, the expression of Bax gene was higher than 0 μg/mL group significantly (P<0.05). After treated with 800 μg/mL of Artemisia lavandulaefolia DC for 24, 48 and 72 hours, the expression of Bcl-2 and Caspases-3 gene were lower than 0 μg/mL group (allP<0.05). Conclusion The extractive of Artemisia lavandulaefolia DC have certain inhibitory effect on the proliferation of hepatoma HepG2 cells, the mechanism is to inhibit the expression of Bcl-2 and up-regulation the expression of Bax, Caspasese-3.

Artemisia lavandulaefolia DC; hepatoma carcinoma cell; proliferation

張啟梅,女，主治醫(yī)師，主要從事臨床內(nèi)科工作。

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.06.005

R965

A

1008-8849(2015)06-0583-04

2014-09-01