陳秋宇 熊華平 許 茹 王 敏 廖 峭 黃 珂 黃杰庭 戎 霞 付涌水

(廣州醫(yī)科大學研究生學院，廣州 510182)

丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)引起的一種呈世界性分布的傳染性疾病，主要通過靜脈毒品注射、輸血和器官移植等途徑傳播［1］。目前全世界大約有2 億人感染HCV，占全世界人口的3%［2］，而在我國就有約3 700～4 000 萬人感染了HCV。HCV 感染后，20%～30%感染者會發(fā)生自發(fā)性清除，70%～80% 將會持續(xù)感染［3］。HCV 感染后的轉(zhuǎn)歸受環(huán)境因素、病毒本身(HCV 基因型、病毒載量)和宿主因素(人種、性別、年齡、宿主遺傳基因多態(tài)性)等多方面因素的影響，其中關(guān)于宿主基因多態(tài)性與HCV 感染轉(zhuǎn)歸的研究成果不斷被報道，如人類白細胞抗原(HLA)、炎癥趨化因子、白細胞介素等。有學者通過全基因組基因多態(tài)性關(guān)聯(lián)研究(Genome-wide association studies，GWAS)發(fā)現(xiàn)，IL-28B 基因多態(tài)性與HCV 的清除和持續(xù)感染密切相關(guān)［4，5］，而位于IL-28B 基因上游3 kb 處的rs12979860 位點與HCV 的自發(fā)清除和抗病毒治療應答相關(guān)性更加密切［5］，但在中國人群中尚缺乏相關(guān)報道，本研究收集了來自廣州地區(qū)無償獻血者中266 名HCV 感染者與97 名健康對照者，檢測IL-28B rs12979860 基因型和等位基因，以探討IL-28B rs12979860 基因多態(tài)性與丙型肝炎自然轉(zhuǎn)歸間的聯(lián)系。

1 材料與方法

1.1 研究對象 隨機選取了2009 年6 月至2011 年11 月在廣州血液中心參加無償獻血的獻血者，其中HCV 感染者266 名，包括HCV 慢性感染者(HCV 抗體和HCV RNA 均陽性)159 名和自發(fā)清除者(HCV 抗體陽性，HCV RNA 陰性)107 名，健康對照人群97 名(抗-HCV、抗-HIV、HBsAg、HBV 和HCV 核酸均陰性)。在266 名HCV 感染者中，男性196 人，女性70 人，平均年齡(32.1±9.7)歲;97 名 健 康 對 照 者，男 性48名，女性49 名，平均年齡(28.8±8.2)歲;HCV慢性感染者中，男性125 人，女性34 人，平均年齡(32.8±9.6)歲;自發(fā)清除者中，男性71 人，女性36 人，平均年齡(31.2±9.8)歲。

1.2 HCV 抗體的ELISA 檢測 采用兩種抗HCV抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒檢測HCV抗體，包括麗珠(中國珠海麗珠試劑公司)和科華(Kehua Biotech Co.Ltd，Shanghai，China)的ELISA試劑，實驗操作按試劑盒說明書進行。

1.3 HCV-RNA 的檢測 采用美國諾華公司的核酸試劑盒(NAT;the Proclein Ultrio Assay，Gen-Probe，San Diego，CA，USA)檢測HCV RNA，實驗操作按試劑盒說明書進行。

1.4 RIBA 確證 對于ELISA 檢測雙試劑陽性，NAT 檢測陰性的標本采用HCV BLOT 3.0 試劑盒(新加坡MP 生物醫(yī)學公司)進行HCV 抗體確證試驗，實驗操作按說明書進行。

1.5 基因組DNA 的提取 靜脈采血5 ml 加入ACD 抗凝后，按照DNA 提取純化試劑盒QIAamp DNA Blood Mini Kit(Qiagen，Chatsworth，CA)的操作說明提取全血中的DNA，DNA 的濃度采用微量紫外核酸蛋白分析儀進行檢測。

1.6 IL-28B rs12979860基因型檢測采用ABI9700 PCR 擴增儀對所提取的DNA 進行PCR 擴增，擴增體系20 μl。PCR 引物序列如下:GGAAGGAGCAGTTGCGCTGC(上游引物)和ACCGCTACGTAAGTCACCGC(下游引物)。反應條件為:95℃預變性5 min，95℃變性50 s，60℃退火50 s，72℃延伸50 s，共32 個循環(huán)，最終72℃延長7 min。所獲得的PCR 產(chǎn)物經(jīng)QIA-quick PCR 產(chǎn)物純化試劑盒(QIAGEN 公司)純化，紫外分光光度計定量后，用PCR引物和ABI 公司的測序試劑盒對PCR 產(chǎn)物進行雙向測序，獲得的序列用DNAStar 軟件中的Seqman 軟件與參考序列比對，獲得rs12979860 基因型和等位基因分布結(jié)果。

1.7 統(tǒng)計學分析 采用SPSS16.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，對HCV 感染組、健康對照組，HCV 慢性感染組和自發(fā)清除HCV 組基因型分布進行哈迪溫伯格平衡檢驗(Hardy-Weinberg Equilibrium test，HWE)。利用χ2檢驗分析HCV 感染組與健康對照組，HCV慢性感染組和健康對照組、自發(fā)清除HCV 組與HCV 慢性感染組IL-28B rs12979860 基因型和等位基因的分布情況，并計算比值比OR(Odds ratio，OR)及95%可信區(qū)間(Confidential interval，CI)，雙側(cè)檢驗，P ＜0.05 視為有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 哈迪溫伯格平衡檢驗 對HCV 感染組、健康對照組、慢性感染組與自發(fā)清除組的IL-28B rs12979860 基因多態(tài)性進行哈迪溫伯格遺傳平衡檢驗。結(jié)果顯示均符合哈迪溫伯格平衡定律，χ2值分別為1.02、0.50 和1.26、0.06，P 均大于0.05，具有人群代表性(表1)。

表1 哈迪溫伯格遺傳平衡檢驗Tab.1 Hardy-Weinberg genetic equilibrium test

2.2 rs12979860 等位基因的測定 PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)Sanger 測序法測序后用DNAStar 軟件分析，C/C基因型在序列分析圖中只可見單峰圖(圖1)，如箭頭所指位置;C/T 基因型在序列分析圖中可見雙峰圖(圖2)，如箭頭所示位置;未發(fā)現(xiàn)T/T 基因型。

2.3 IL-28B rs12979860 基因型和等位基因在HCV感染人群和健康人群中的分布 HCV 感染組266人，C/C 基因型為235 人(88.3%)，C/T 為31 人(11.7%)，C 等位基因的頻率為94.2%，T 等位基因的頻率為5.8%。健康對照組97 人，C/C 基因型為84 人(86.6%)，C/T 為13 人(13.4%)，C 等位基因的頻率為93.3%。HCV 感染組與健康對照組基因型及等位基因比較，χ2分別為0.204、0.191，P 值分別為0.652、0.662，二者之間差異無統(tǒng)計學意義，見表2。

圖1 rs12979860 C/C 基因型序列分析圖Fig.1 rs12979860 C/C genotype sequence analysis chart

圖2 rs12979860 C/T 基因型序列分析圖Fig.2 rs12979860 C/T genotype sequence analysis chart

表2 rs12979860 基因型、等位基因在健康對照組和HCV感染組的分布Tab.2 rs12979860 genotype and allele distribution in healthy control group and HCV infection group

2.4 IL-28B rs12979860 基因型和等位基因在HCV慢性感染人群和健康人群中的分布 HCV 慢性感染組159 人，C/C 基因型為133 人(83.6%)，C/T 為26 人(16.4%)，C 等位基因的頻率為91.8%，T 等位基因的頻率為8.2%。健康對照組97 人，C/C 基因型為84 人(86.6%)，C/T 為13 人(13.4%)，C 等位基因的頻率為93.3%。HCV 慢性感染組與健康對照組基因型及等位基因比較，χ2分別為0.406、0.373，P 值分別為0.524、0.542，二者之間差異無統(tǒng)計學意義，見表3。

2.5 IL-28B rs12979860 基因型和等位基因在HCV慢性感染人群和自發(fā)清除HCV 人群中的分布HCV慢性感染組159人，其中C/C基因型為133人(83.6%)，C/T 為26 人(16.4%)，C 等位基因的頻率91.8%;HCV 自發(fā)清除組107 人，C/C 基因型為102 人(95.3%)，C/T 為5 人(4.7%)，C 等位基因的頻率為97.7%。HCV 慢性感染組與自發(fā)清除組基因型分布差異有統(tǒng)計學意義(χ2=8.474，P=0.004)，C/T 等位基因中C 和T 所占比例在自發(fā)清除組和慢性感染組中有顯著差異，等位基因C 在自發(fā)清除患者中的比率明顯高于慢性組，OR=0.251(95%CI:0.093 -0.676)，見表4。

表3 rs12979860 基因型、等位基因在HCV 慢性感染組和健康對照組的分布Tab.3 rs12979860 genotype and allele distribution of HCV chronically infected patients and healthy control group

表4 rs12979860 基因型、等位基因在慢性HCV 感染組和自發(fā)清除HCV 組的分布Tab.4 rs12979860 genotype and allele distribution in chronic HCV infection and spontaneous HCV clearance

3 討論

IL-28B 編碼基因位于19 號染色體長臂(19q13.13)，全長1.58 ×103bp，由6 個外顯子和5個內(nèi)含子組成，編碼IFN-λ3，主要在樹突細胞和外周血單核細胞等抗原呈遞細胞中表達。IFN-λ3 屬于Ⅲ型干擾素家族成員(即Interferon-λs，IFN-λs)，其信號轉(zhuǎn)導機制是通過誘導受體異二聚體，激活JAK-STAT 通路上調(diào)干擾素刺激基因(IFNstimulated genes，ISGs)發(fā)揮直接抗病毒、抑制細胞生長和免疫調(diào)控作用。近年來，各國學者通過全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)研究發(fā)現(xiàn):IL-28B 區(qū)域附近7個SNP 位點的基因多態(tài)性與HCV 感染的自發(fā)清除高度相關(guān)，而且還與丙型肝炎病毒感染者對治療的應答有關(guān)［4，6-9］，這些位點包括 rs12979860、rs8099917、rs12980275、rs10853728 等。Ge 等［4］通過對北美1 137 例HCV 基因1 型患者分析發(fā)現(xiàn)，在IL-28B 基因區(qū)的7 個SNP 中，rs12979860 與HCV 的自發(fā)清除和治療相關(guān)性最強，隨后各國學者也有陸續(xù)報道。然而有關(guān)中國人群rs12979860 與HCV 感染相關(guān)性的研究還很少見。

本研究通過對HCV 感染人群和健康人群IL-28B rs12979860 基因型和等位基因分布進行了比較，發(fā)現(xiàn)CC 基因型和C 等位基因在兩組中的分布頻 率 幾 乎 一 致(88.3% vs 86.6%，94.2% vs 93.3%)，沒有統(tǒng)計學差異(P ＞0.05)，這與文獻報道結(jié)論相一致，由此我們推測IL-28B rs12979860 可能與HCV 的易感性并無相關(guān)性，C 等位基因?qū)τ诮】等巳嚎赡軣o保護性作用。目前多數(shù)學者在研究IL-28B rs12979860 基因多態(tài)性與丙型肝炎相關(guān)性時，很少采用健康人群做對照來研究丙型肝炎的易感性，相關(guān)的報道也比較少。

Thomas 等［5］對620 例慢性丙肝患者及388 例自發(fā)清除患者的基因型進行了分析，發(fā)現(xiàn)rs12979860 位點C/T 等位基因中C 和T 所占的比率在自發(fā)清除者和慢性感染者中有顯著差異，C 等位基因在自發(fā)清除患者中的比例明顯高于慢性化患者，含CC 基因型的患者比含CT 或TT 基因型患者的HCV 更容易被清除。此后，該發(fā)現(xiàn)在許多不同人群中得到印證，即IL-28B rs12979860 位點的CC 基因型在HCV 自發(fā)清除人群中均具有較高頻率［10，11］。在本研究中，IL-28B rs12979860 位點與HCV 感染相關(guān)性的研究結(jié)果與國外的主流研究報道類似，自發(fā)清除組中CC 基因型分布明顯高于慢性感染組(95.3%vs 83.6%)，同樣自發(fā)清除組C 等基因頻率也高于慢性感染組(97.7% vs 91.8%)。國內(nèi)也有研究認為rs12979860 位點與HCV 自發(fā)清除并無關(guān)聯(lián)［12］。結(jié)果不一致的原因可能與樣本數(shù)量及人群不同有關(guān)。本研究266 名HCV 感染者均來自無償獻血者，感染者均未知自己曾經(jīng)或現(xiàn)在感染了HCV，也未進行過治療，這或許更能反應IL-28B rs12979860 基因多態(tài)性與人體感染HCV 后自然轉(zhuǎn)歸的關(guān)聯(lián)性。

不同種族人群中rs12979860 的等位基因分布頻率不盡相同。Ge 等［4］發(fā)現(xiàn)對HCV 感染者具有保護作用的C 等位基因在東亞裔人群中最高(95%);Thomas 等［5］研究在另一項隨機多種族人群的研究中發(fā)現(xiàn)，C 等位基因頻率的分布規(guī)律，在東亞人群最高，歐洲人群次之，非洲最低。本研究中也發(fā)現(xiàn)C等位基因的頻率基因(97.7%)遠遠高于其他人群［13］。同時研究已證明HCV 在不同人群中的清除率也不相同，若單獨考慮宿主IL-28B rs12979860 等位基因?qū)CV 清除人群的影響，東亞人群中的自發(fā)清除率可能是最高，但在實際情況中，東亞人群的自發(fā)清除率并不是最高的，這可能與所感染的HCV 基因型、宿主遺傳等多方面的因素有關(guān)。IL-28B rs12979860 不但與HCV 自發(fā)清除具有相關(guān)性，還與丙型肝炎患者的治療應答相關(guān)。Mangia 等［14］在對慢性丙型肝炎患者的研究中發(fā)現(xiàn)IL-28B rs12979860基因型與患者抗病毒治療的快速病毒學應答(Rapid virological response，RVR)及持續(xù)病毒學應答(Sustainde viral response，SVR)也具有較強的相關(guān)性。Thomas 等［5］對經(jīng)PEG-IFN-α(聚乙二醇干擾素α)及RBV(利巴韋林)聯(lián)合治療的慢性丙型肝炎患者進行了研究，也發(fā)現(xiàn)IL-28B rs12979860 基因C/C 型更易獲得SVR，肝內(nèi)ISGs 表達減少與之高度相關(guān)，這跟其他學者研究在不同種族人群中HCV 自發(fā)清除率表現(xiàn)出高度一致性［2，4，7，8，15-18］，推斷其原因可能是IL-28B 基因的遺傳變異通過調(diào)節(jié)肝臟對HCV 的固有免疫反應，使患者在接受外源性IFN 治療時出現(xiàn)較強的ISGs 反應。由于客觀原因的限制，本研究目前尚未開展治療相關(guān)的研究，但這是目前的一個研究熱點，也是我們下一步的研究方向。

總之，IL-28B rs12979860 基因多態(tài)性在丙型肝炎病毒感染的自發(fā)清除和治療應答過程中都起著重要的作用，C 等位基因可能有利于HCV 的自然清除。本研究的發(fā)現(xiàn)將有助于預測HCV 感染后的自然轉(zhuǎn)歸及臨床治療方案的制定。

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