吐爾遜阿依·買買提 張 秦 鄭 宏 (新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院麻醉科，烏魯木齊 830054)

過敏性疾病是多基因遺傳和多環(huán)境因素相互影響的結果［1-3］。根據(jù)最新的世界過敏組織的報告:過敏性疾病在全球的高發(fā)病率和高死亡率給健康預算帶來了巨大的負擔。闡明過敏性疾病的發(fā)病機制，和提出有針對性、有效的治療方案是迫切需要解決的問題。2001 年公布人類基因組序列草圖后，更多的目光聚焦在個體之間的基因組變異上，大量關于過敏性疾病易感基因的研究陸續(xù)展開。用于發(fā)現(xiàn)過敏基因的各種手段隨著時間的推移而演變，各種基因分型技術提供的數(shù)據(jù)越來越多，成本越來越低。當我們開始采用21 世紀的新技術如下一代全基因組測序技術，基因的發(fā)現(xiàn)將不再局限于基因分型技術，而是依賴計算機和生物信息處理系統(tǒng)，解釋這些龐大的數(shù)據(jù)成了新的需要解決的問題。這一節(jié)我們將回顧性地總結這些研究策略。

1 候選基因策略

候選基因法就是將感興趣的基因定為候選基因，選擇候選基因中的多態(tài)性標記，然后比較多態(tài)性標記的基因型在病例組和合適的對照人群中的頻率分布差異，從而找出與疾病表型相關的基因變異。1990 年以來，在不同民族中用候選基因法進行了過敏性疾病的相關研究，大量候選基因的啟動區(qū)和編碼區(qū)的單核苷酸多態(tài)性已證實與過敏相關疾病的表型有關(見表1)。候選基因的選擇是基于大量的證據(jù)資料，比如所掌握的生物學功能、發(fā)現(xiàn)的疾病的差異性表達、與別的疾病共同的表型、或來源于動物模型和相關的組織等。這種方法是假設驅動的，且結果很容易解釋，多態(tài)位點選擇簡單，找到的候選基因有生物合理性，并且展示了對感興趣疾病有意義的功能序列、總費用低、易于實施。缺點是限制已知或未知的可能參與疾病的基因，從而減少了發(fā)現(xiàn)新的可能影響疾病的基因的機會。并且缺乏統(tǒng)計支持和結果重復性差，基因多態(tài)性覆蓋率不足等。其中，結果重復困難受多因素的影響，主要與不好的研究設計、研究人群樣本量小，缺乏足夠的對照組人群，群體分層、篩查所選取多態(tài)性標記不同，遺傳異質性、不同種族間的連鎖不平衡模式、研究隊列間的不同環(huán)境暴露以及統(tǒng)計學分析的自限性等因素有關。

2 定位克隆策略

定位克隆的方法是一個假說獨立的、依靠對疾病遺傳家系的研究分析，最先用于家族調查研究。為找到與研究疾病相關的表型，標記物隨機分布在整個基因組。如果發(fā)現(xiàn)特定標記物與表型之間存在關聯(lián)，則進一步分型的遺傳標記物將輔助更準確地定義關鍵區(qū)域的致病基因。從此之后，被定位在此區(qū)域的基因可以用來檢測是否參與某種疾病發(fā)病過程及治病基因突變的出現(xiàn)。如果基因組中所有的基因都用這種方法檢測，這種方法就被稱作定位克隆或基因掃描。雖然這種方法不需要假設某種基因與疾病的易感性有關，但它需要大量的分子遺傳研究，需要大量的時間和精力。不像許多候選基因的研究，通過定位克隆技術鑒定的易感基因，在一般情況下，在隨后的研究中更容易被重復，盡管定位克隆的基因也可能被證明有時難以復制。

許多過敏性疾病和過敏性疾病易感基因的全基因組掃描已經(jīng)完成。過敏和過敏性疾病易感基因的全基因組畫面的結果反映了遺傳和環(huán)境異質性，已觀察到的基因組的多個區(qū)域與不同的表型有關，在相似或不同人群中的可重復性較差。這說明鑒定復雜性疾病易感基因的難度很大。不同的基因位點將說明不同的種族和不同環(huán)境中的人群之間的聯(lián)系。在復雜疾病的研究中，真正的挑戰(zhàn)不是確定有關的區(qū)域而是對所觀察到的有關區(qū)域中相關基因和遺傳變異的精確識別。過敏性疾病表型的連鎖分析是緩慢和昂貴的，大多數(shù)研究已經(jīng)證明，盡管收集幾百個家庭樣本，找出并證明復雜疾病的易感基因是非常困難的，不夠讓人信服。一項有關哮喘連鎖分析的Mata 分析表明:氣道高反應性、過敏原皮膚點刺試驗陽性、血清總IgE 水平的易感基因位點，沒有一致的統(tǒng)計學上的顯著的易感基因位點與哮喘的表型有關，說明了結果的異質性。

迄今為止，通過定位克隆策略的全基因組掃描已認定過敏性疾病表型的幾個易感基因，包括與哮喘有關的整合素和金屬蛋白酶33 (ADAM33)［4］，幾丁質酶3 樣蛋白-1 (CHI3L1)［5］，二肽基肽酶(DPP10)［6］，主要組織相容性復合物(MHC)，HLAG［7］，PHD 鋅指蛋白-11(PHF11)［8］，前列腺素D2 受體(PTGDR)［9］，血纖維蛋白溶酶原激活劑，尿激酶受體(PLUAR)［10］;與氣管高反應性(BHR)有關的PCDH1［11］;與特應性皮炎有關的COL29A1 基因［12］。詳見表2。

表1 通過候選基因研究確定的可以復制的基因Tab.1 Well-replicated loci identified through candidate-gene studies

表2 通過定位克隆技術確定的可以復制的基因Tab.2 Loci identified through linkage studies and positional cloning

3 全基因組關聯(lián)研究

全基因組關聯(lián)研究是新近出現(xiàn)的篩查復雜性疾病易感基因的有力工具。近些年來，基于SNP 基因分型技術的應用，革新了復雜疾病的遺傳基礎研究。使得我們有機會識別巨大數(shù)量的SNP，以及通過基因組水平的連鎖不平衡，識別了不同種族人群的遺傳特征。全基因組關聯(lián)研究(GWAS 研究)現(xiàn)在已經(jīng)徹底改變了復雜的常見疾病遺傳因素的研究模式。自2005 年Science 雜志報道了首個與年齡有關的視網(wǎng)膜黃斑變性GWAS，隨后相繼報道了從生理測量如常見的疾病身高和身體質量指數(shù)到生物測量如循環(huán)血脂水平和血液中嗜酸性粒細胞水平等超過150 個表型，GWAS 為人類基因組的不同位點提供了數(shù)百個強有力的、有意義的統(tǒng)計關聯(lián)［17］。全基因組假設獨立的關聯(lián)研究不像連鎖定位克隆法，不需要收集大型家庭為基礎的樣品和其表型;GWAS 可以分析人類基因組的所有基因，不受候選基因的限制。

最近的GWAS 研究已令人信服地檢測到大量的過敏性疾病相關的基因位點，在過敏性疾病的研究中取得了很大的成功。第一個用GWAS 發(fā)現(xiàn)的哮喘易感基因位點是在染色體17q12-21.1 上的ORM1-like3 和Gasdermin like(GSDML)基因［18］。一項大規(guī)模哮喘的GWAS 研究，收集了10 365 個病例和16 110 個對照，確定了6 個易感基因位點IL1RL1 IL18R1，HLA-DQ，IL33，SMAD3，ORMDL3，GSDMB IL2RB［19］。IL1RL1 的配體是IL-33，這已被證明在Th2 細胞相關的疾病模型中有重要的作用［20］。IL-33 被認為是重要的宿主防御線蟲的細胞因子，通過IL-33 受體誘導Th2 細胞產(chǎn)生，也是一個關鍵的誘導和激活固有淋巴細胞的細胞因子。這些研究結果意味著，參與IL-33 通路的遺傳因素在人類支氣管哮喘的病理生理機制中發(fā)揮了重要作用。

過敏性疾病的中間表型，如IgE 水平，皮膚點刺試驗的反應，或連續(xù)測量肺功能措施對基因關聯(lián)研究有更強大的統(tǒng)計學意義。最近的一個全基因組關聯(lián)研究應用于過敏中間表型的例子是研究冰島人口血液中嗜酸性粒細胞計數(shù);這項研究表明，基因的序列變異影響嗜酸性粒細胞數(shù)，包括白細胞介素1 受體樣1 (IL1RL1)，WD 重復結構域36 (WDR36)，白細胞介素33(IL33)，和v-myb 基因的成髓細胞瘤病毒癌基因同系物(MYB)，與哮喘和心肌梗死有關［21］。已經(jīng)提議將IL1RL1 作為濕疹和哮喘的候選基因。GWAS 的方法同樣被應用到識別變種調節(jié)血清IgE 水平，這項研究確定在染色體1q23 的編碼IgE (FCER1A)的高親和力受體基因的功能變異與血清IgE 水平及過敏致敏有關。以及證實了以前的候選基因研究結果，即信號轉導和轉錄激活因子6(STAT6)基因有關變異調節(jié)了總IgE 水平和過敏。

最新用GEWASs 方法發(fā)現(xiàn)了哮喘伴花粉過敏的11 個易感基因:HLA-DQB 16p21、TLR14 p14、WDR36 5q22、IL1RL1 2q12、LRRC32 11q13、GSDMA 17q21、TSLP 5q22、IL33 9p24、ZBTB10 8q21、SMAD3 15q22、CLEC16A 16p13［22］。

4 GWASs 的薈萃分析

若想最大限度地發(fā)現(xiàn)有影響力的等位基因，可以將GWASs 的結果做成薈萃分析。2011 年報道了種族多元化的北美人群中研究哮喘的薈萃分析，確定了5 個易感基因位點。其中4 個位點，分別是17q21、IL1RL1 附近、TSLP 和IL33，已經(jīng)有報道，新發(fā)現(xiàn)了非洲裔人特有哮喘易感基因PYHIN1［23］。大規(guī)模的全基因組薈萃分析發(fā)現(xiàn)有過敏性鼻炎和過敏草相關的幾個基因位點［24］。在C11orf30 和LRRC32 附近的染色體11q13.5 發(fā)現(xiàn)與表型相關，且在全基因組中有意義。LRRC32 是控制人類調節(jié)性T 細胞FOXP3 的關鍵受體，它與免疫耐受有關［25］。11q13.5 區(qū)域已經(jīng)報道是過敏性皮炎和哮喘的易感基因位點［26］。此薈萃分析發(fā)現(xiàn)，HLA 區(qū)域也與草過敏有關聯(lián)，且在全基因組水平上有意義。

5 重測序研究

在過去的五年里全基因組關聯(lián)研究在基因相關研究中占主導地位，然而測序研究將引領未來五年的發(fā)展方向。測序研究目前正在火熱進行中，因高通量，大規(guī)模并行測序技術的形成而得到快速發(fā)展。這項研究的基本原理是:這些罕見的變異與普通的變異相比，對疾病風險影響更大，是解釋常見疾病的遺傳風險的一個重要部分。有趣的是，理論模型在十年前就建議低頻等位基因的多態(tài)位點與一個或更多的可能的常見等位基因相比更有助于常見疾病的風險［27］。這種等位基因的異質性不能被運用傳統(tǒng)的統(tǒng)計方法的關聯(lián)研究所發(fā)現(xiàn)，包括全基因組關聯(lián)研究。此外，正如上面提到的，最常用的基因分型平臺幾乎專門用于普通的變異。相反，檢測該罕見的變異需要重新測序基因，外顯子，甚至掃描整個大樣本中的每個個體的基因組，去發(fā)現(xiàn)變異標記基因分型平臺沒有檢測到的罕見的變異。目前正在進行的研究在重新測序成百上千個個體的基因組，比較病例組和對照組來發(fā)現(xiàn)罕見變異。然而，顯而易見的是，測序基因組或外顯的成本下降的很快，這項技術可能在不久的將來取代SNP 分型技術。相比之下，對存儲、分析、解釋序列數(shù)據(jù)的需求大，要求高。生物信息學和計算機領域的發(fā)展沒有跟上這些數(shù)據(jù)的生成。

表3 各種方法比較Tab.3 Comparison of different methods

6 展望

使以上研究揭示了過敏性疾病易感基因的位點，提供了新見解，但對過敏性疾病的遺傳機制發(fā)現(xiàn)的少之又少，相關的變異對疾病整個發(fā)病過程起的作用較小。遺傳缺失的潛在來源包括稀有變異，拷貝數(shù)變異，表觀遺傳效應，基因-基因相互作用和基因與環(huán)境的相互作用［28］。近日，免疫芯片已經(jīng)發(fā)展到進行主要自身免疫性疾病和炎癥性疾病的深層復制，對GWAS 研究已確定的位點進行了精細定位［29］。免疫芯片是采用Infinium 技術的Illumina SNP 基因分型芯片，含有從千人基因組計劃和其他可用特定疾病的重測序數(shù)據(jù)中選擇的196 524 多態(tài)性自定義的高密度陣列［29，30］。該免疫芯片手段可能會提高我們對過敏性疾病的認識，但是，免疫芯片并不覆蓋整個基因組，專為歐洲白人使用。因此，它在應用于亞洲人群時受到了限制。

GWASs 研究發(fā)現(xiàn)的易感位點上的候選基因提示上皮屏障功能、固有適應性免疫、IL-1 家族信號，調節(jié)性T 細胞和維生素D 通道在過敏性疾病病理生理中的重要作用。在免疫學中已證實所有免疫系統(tǒng)中細胞的分子成分在免疫反應中的作用不容忽視。構造一個模仿人類生理學的動物模型，GWAS研究的結果將有助于突出參與人類過敏性疾病的基因。

7 結語

過敏性疾病是由多種基因變異和多環(huán)境因素相互作用而引起的。先前的許多遺傳研究已經(jīng)使用定位克隆和候選基因關聯(lián)研究，以及最近應用的全基因組關聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)了許多與過敏性疾病相關的基因及其位點，但上述三種方法始終沒有解決結果重復性差、結果難以解釋和很難就此下結論等問題，而且還有許多過敏性疾病的遺傳特性未被發(fā)現(xiàn)，詳見表3。在未來幾年內，高通量測序將成為研究過敏性疾病易感基因的新熱點，這種方法將使龐大的新信息涌入，以及處理大量數(shù)據(jù)時將遇到更新的問題。目前面臨的挑戰(zhàn)是找到更好的發(fā)現(xiàn)易感基因的方法，降低成本，精確地找到過敏性疾病的易感基因，闡明相關的變化對基因調控和功能的影響。

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