袁偉杰 袁子薇 王銳英 胡軍祖 (桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院骨科，桂林 541001)

腰腿痛病因繁多，腰椎間盤突出癥是其最常見的原因之一。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，腰椎間盤突出癥是椎間盤纖維環(huán)破裂，髓核突出壓迫神經(jīng)根所表現(xiàn)的一種綜合征。然而在臨床實(shí)踐中，許多患者沒有明顯的神經(jīng)根受壓，卻有嚴(yán)重的神經(jīng)根性癥狀。目前有學(xué)者已經(jīng)證明在椎間盤退變中存在自身免疫反應(yīng)［1］，但自身免疫反應(yīng)對(duì)神經(jīng)根損傷的具體機(jī)制研究較少。本實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)非壓迫性椎間盤髓核突出模型中T 細(xì)胞、TNF-α 表達(dá)，探討非壓迫性椎間盤髓核突出中自身免疫反應(yīng)致神經(jīng)根損傷的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象及分組 雌性SD 大鼠48 只(桂林醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)，體重300～350 g，采用隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為2 組:模型組及對(duì)照組，每組24 只。同一組中每2 只飼養(yǎng)于一個(gè)鋼絲籠中，實(shí)驗(yàn)室溫度為22℃～26℃，每日早晨8:00 至20:00 開燈，20:00至次日8:00 熄燈。

1.2 主要試劑 抗大鼠APC 標(biāo)記CD3/PE 標(biāo)記CD4/FITC 標(biāo)記CD8 抗體購(gòu)自美國(guó)BD 公司;淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自北京索菜寶科技有限公司;TNF-α ELISA 試劑盒購(gòu)自欣博盛生物科技有限公司。

1.3 造模方法 動(dòng)物造模［2］:戊巴比妥鈉45 mg/kg 腹腔注射麻醉，備皮，消毒，背部正中切口，長(zhǎng)約3 cm，依次切開皮膚及皮下組織，從棘突左側(cè)鈍性分離椎旁肌，暴露腰4、5 椎間關(guān)節(jié)及橫突，微型咬骨鉗去除腰4、腰5 左側(cè)椎板及關(guān)節(jié)突，用顯微器械小心顯露腰4、腰5 神經(jīng)根。取大鼠自體2～8 尾椎共計(jì)6 個(gè)椎間盤髓核組織，輕輕置于腰4、腰5 神經(jīng)根旁，注意不要造成機(jī)械壓迫，逐層縫合切口。術(shù)后3 d連續(xù)腹腔注射青霉素30 萬U/(只·d)，預(yù)防切口感染。對(duì)照組采用同樣的手術(shù)方式，神經(jīng)根旁不放置髓核組織。

1.4 觀測(cè)項(xiàng)目 觀察兩組大鼠的行為學(xué)變化;術(shù)后10 d、20 d、40 d 時(shí)，每組隨機(jī)抽取8 只，參考文獻(xiàn)［3］用血壓計(jì)自制測(cè)量器檢查左后肢痛閾;腹主動(dòng)脈采血4 ml，2 ml 用枸櫞酸鈉抗凝管采集，淋巴細(xì)胞分離液分離淋巴細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+、CD8+T 細(xì)胞百分比;另外2 ml 用干燥試管采集，離心后收集上層血清，ELISA 法測(cè)定血清中TNF-α 水平;HE 染色觀察腰4、腰5 神經(jīng)根形態(tài)學(xué)變化。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 運(yùn)用SPSS18.0 統(tǒng)計(jì)軟件做統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s 表示。計(jì)量資料符合正態(tài)分布，采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，P ＜0.05 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

模型組術(shù)后逐漸出現(xiàn)多動(dòng)、易激惹，近40 d 時(shí)恢復(fù)正常;而對(duì)照組未出現(xiàn)多動(dòng)、易激惹情況。觀察期間兩組大鼠后肢活動(dòng)均自如，飲食正常，無大小便失禁。模型組在10 d、20 d 時(shí)左后肢痛閾較對(duì)照組降低，P值＜0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;在40d時(shí)兩組痛閾比較，P 值＞0.05，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在10 d、20 d時(shí)，模型組CD4+T 細(xì)胞比例、血清TNF-α 水平均高于對(duì)照組，CD8+T 細(xì)胞比例低于對(duì)照組，P 值＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;在40 d 時(shí)，兩組CD4+T細(xì)胞比例、CD8+T 細(xì)胞比例、血清TNF-α 水平比較，P 值＞0.05，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見表1～4，圖1)。模型組10 d 時(shí)腰神經(jīng)根橫斷面髓鞘部分崩解，呈空泡變;20 d 時(shí)最嚴(yán)重，神經(jīng)纖維排列不規(guī)律，大小不一，髓鞘崩解，空泡樣變嚴(yán)重;40 d 時(shí)基本恢復(fù)正常。對(duì)照組10、20、40 d 時(shí)腰神經(jīng)根橫斷面神經(jīng)纖維排列規(guī)律，大小基本一致，髓鞘完整，呈紅色，位于軸突周圍。見圖2。

表1 造模后10 d、20 d、40 d 左后肢痛閾(mm/Hg)Tab.1 Left hind leg pain threshold after ten days，twenty days and forty days after building(mm/Hg)

表2 造模后10 d、20 d、40 d CD4 +T 細(xì)胞比例(%)Tab.2 Proportion of CD4 + T cells after ten days，twenty days and forty days after building

表3 造模后10 d、20 d、40 dCD8 +T 細(xì)胞比例(%)Tab.3 Proportion of CD8 + T cells after ten days，twenty days and forty days after building(%)

表4 造模后10 d、20 d、40 d TNF-α 表達(dá)(pg/ml)Tab.4 Levels of TNF-α after ten days，twenty days and forty days after building(pg/ml)

圖1 造模后10 d、20 d、40 d 大鼠動(dòng)脈血CD4 +、CD8 +T細(xì)胞水平Fig.1 Artery levels of CD4 +，CD8 +T cells after ten days，twenty days and forty days after building

圖2 造模后10 d、20 d、40 d 大鼠神經(jīng)根橫斷面HE 染色(×400)Fig.2 Nerve root changes by HE after ten days，twenty days and forty days after building(×400)

3 討論

臨床上常見腰腿痛患者，嚴(yán)重影響著人們的生活質(zhì)量。Rodrigues-Pinto 等研究發(fā)現(xiàn)，40% 的腰痛患者，歸因于腰椎間盤變性［4］。目前已證明在腰椎間盤退變中存在自身免疫反應(yīng)，髓核具有自身免疫原性，被纖維環(huán)包圍與外界隔絕，被稱為“隱蔽抗原”，一旦纖維環(huán)破裂，髓核與外界接觸，即引起自身免疫反應(yīng)［5］。Kimura 等［6］通過對(duì)Sprague-Dawley大鼠的研究，發(fā)現(xiàn)椎間盤髓核可導(dǎo)致神經(jīng)根損傷。甚至有學(xué)者通過Sprague-Dawley 大鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，單純物理壓迫并不會(huì)降低大鼠的痛閾，而髓核合并物理壓迫雙重因素下可明顯降低大鼠痛閾［7］。本研究發(fā)現(xiàn)模型組術(shù)后10 d、20 d 神經(jīng)根可見損傷，40 d 時(shí)神經(jīng)根基本恢復(fù)正常。進(jìn)一步提示椎間盤突出早期髓核可導(dǎo)致神經(jīng)根損傷，給患者帶來巨大的痛苦，自身免疫反應(yīng)可能參與該損傷。因此，研究早期自身免疫反應(yīng)對(duì)神經(jīng)根的損傷的具體機(jī)制意義重大。

T 淋巴細(xì)胞在機(jī)體免疫系統(tǒng)內(nèi)，是功能重要的一大細(xì)胞群，CD4+T 細(xì)胞具有輔助B 細(xì)胞產(chǎn)生抗體和輔助其他T 細(xì)胞亞群功能;CD8+T 細(xì)胞具有抑制B 細(xì)胞產(chǎn)生抗體和抑制其他淋巴細(xì)胞的功能。CD4+T 細(xì)胞和CD8+T 細(xì)胞的平衡與自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［8］。

本實(shí)驗(yàn)建立非壓迫性椎間盤髓核突出模型，排除神經(jīng)根受壓迫或牽拉因素。在10 d、20 d 時(shí)，模型組和對(duì)照組比較，CD4+T 細(xì)胞比例升高，CD8+T 細(xì)胞比例降低;在40 d 時(shí)，兩組CD4+、CD8+T 細(xì)胞比例相當(dāng)。提示模型組早期存在T 細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫，從而引起神經(jīng)根損傷，導(dǎo)致大鼠后肢痛閾降低，椎間盤髓核參與該反應(yīng)，考慮可能通過以下幾種方式造成神經(jīng)根損傷:(1)椎間盤髓核通過激活CD4+T 細(xì)胞，使得B 細(xì)胞產(chǎn)生更多的髓核相關(guān)抗體，抗原抗體復(fù)合物的沉積可激活炎癥反應(yīng)而導(dǎo)致神經(jīng)根的損傷。另外，抗原抗體反應(yīng)過程本身可產(chǎn)生大量的炎癥因子，進(jìn)一步損傷神經(jīng)根;(2)CD8+T細(xì)胞減低，免疫抑制作用減弱，也可導(dǎo)致抗原抗體反應(yīng)的增強(qiáng);(3)椎間盤髓核本身可激活T 細(xì)胞亞群，破壞T 細(xì)胞亞群的平衡，而爆發(fā)大量的炎癥反應(yīng)，損傷神經(jīng)根。由于T 細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)中可釋放大量炎性因子，損傷神經(jīng)根，因此，研究神經(jīng)根損傷的具體致炎因子，對(duì)神經(jīng)根損傷的預(yù)防尤為重要。

臨床實(shí)踐中，有些椎間盤突出患者應(yīng)用甾體或非甾體類抗炎藥同樣能達(dá)到緩解或治愈疼痛的效果，從而達(dá)到手術(shù)治療的目的［9］。手術(shù)中也常常發(fā)現(xiàn)神經(jīng)根表現(xiàn)出充血、水腫等炎癥樣變化。TNF-α作為重要的炎性介質(zhì)可能與椎間盤所致腰背部疼痛有關(guān)［10］。本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M在10 d、20 d 時(shí)，神經(jīng)根可見損傷，TNF-α 表達(dá)明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;在40 d 時(shí)，神經(jīng)根損傷基本恢復(fù)正常，模型組TNF-α 表達(dá)與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明在椎間盤髓核突出早期TNF-α 可能是神經(jīng)根損傷主要致炎因子。TNF-α 大多是由活化的巨噬細(xì)胞分泌而來。有文獻(xiàn)指出CD4+T 細(xì)胞的Th1 細(xì)胞亞群分泌IFN-γ、淋巴毒素α 和IL-2，可促進(jìn)巨噬細(xì)胞活化［11］。因此T 細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)可間接刺激TNF-α 分泌，從而使TNF-α 表達(dá)增高。TNF-α 促進(jìn)PLA2 的釋放，激活基質(zhì)金屬蛋白酶-2、基質(zhì)金屬蛋白酶-9 產(chǎn)生對(duì)基底膜的降解而損傷神經(jīng)根。

根據(jù)以上結(jié)果推斷，椎間盤髓核突出早期可能通過T 細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)使TNF-α 分泌增多引起神經(jīng)根損傷，從而出現(xiàn)神經(jīng)根性疼痛，故腰椎間盤髓核突出初期，可給予抗免疫、抗炎治療，減輕自身免疫及炎癥反應(yīng)對(duì)神經(jīng)根的損傷，減輕患者癥狀。本實(shí)驗(yàn)通過研究椎間盤髓核突出后T 細(xì)胞亞群及TNF-α 的變化，探討自身免疫反應(yīng)對(duì)椎間盤髓核致神經(jīng)根損傷中的作用機(jī)制，有助于加深人們對(duì)椎間盤髓核突出后腰腿疼發(fā)病機(jī)理的認(rèn)識(shí)，更好地指導(dǎo)臨床對(duì)本病的治療。

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