劉金香，謝水波, ，馬華龍，王永華，陳華柏，李 標(biāo) (. 南華大學(xué) 污染控制與資源化技術(shù)湖南省高校重點實驗室，衡陽 400； . 南華大學(xué) 鈾礦冶生物技術(shù)國防重點學(xué)科實驗室，衡陽 400)

地下水的鈾污染控制是我國鈾礦冶領(lǐng)域亟待解決的核環(huán)境問題。地下水中的鈾常以U(Ⅵ)和U(Ⅳ)兩種價態(tài)存在，U(Ⅵ)主要以可溶性[UO2]2+形式存在，極易隨地下水流動而遷移，構(gòu)成更大范圍的放射性污染和重金屬毒害；U(Ⅳ)主要以難溶的瀝青鈾礦(UO2)形式存在，性質(zhì)穩(wěn)定，不易遷移[1]。因此，將六價鈾轉(zhuǎn)化為四價鈾是地下水鈾污染控制的關(guān)鍵。

與傳統(tǒng)的物化處理法相比，成本低、耗能少、效率高和無二次污染等優(yōu)點的生物法成為當(dāng)前的研究熱點[2]。厭氧條件下，希瓦氏菌(Shewanella)可將水體中可溶態(tài)的U(Ⅵ)還原成難溶態(tài)的U(Ⅳ)，并以晶質(zhì)鈾礦的形式沉淀[3-4]。近期研究證實，Shewanella也能還原其他金屬(Pd[5]、Pu[6]、Cr(Ⅵ)[7]、Mn(Ⅳ)[8]、Fe(Ⅲ)[9])以及有毒有機(jī)物[10]。Shewanella厭氧條件下具有還原多種高價態(tài)金屬的特性而備受關(guān)注[11]。

零件鐵(ZVI)反應(yīng)速度快、廉價易得，可通過還原、微電解及混凝吸附等機(jī)理有效去除水中的U(Ⅵ)，利用ZVI去除地下水中鈾等污染物是近年發(fā)展起來的一種新技術(shù)。但ZVI 在還原U(Ⅵ)過程中，其腐蝕釋放的Fe2+容易生成FeOOH沉淀，使其表面鈍化，大幅降低修復(fù)效果。近期研究表明[12]，厭氧環(huán)境下，ZVI可作為電子供體協(xié)同微生物對可還原態(tài)物質(zhì)的還原，如Cr(Ⅵ)[13]、Zn(Ⅱ)[14]、硝酸鹽[15]、偶氮染料[16]等。也能促進(jìn)U(Ⅵ)[17]的生物還原，因此，采用ZVI與厭氧微生物協(xié)同作用，有望實現(xiàn)U(Ⅵ)的快速還原。目前，關(guān)于S. oneidensis還原去除U(Ⅵ)的研究已經(jīng)開展，但在腐殖質(zhì)存在條件下，其與ZVI協(xié)同作用還原去除U(Ⅵ)的研究鮮有報道。

本文作者以S. oneidensis為實驗菌株，探討AQS存在條件下，ZVI和厭氧微生物協(xié)同還原U(Ⅵ)的能力、主要影響因素及機(jī)制，以期為地下水鈾污染修復(fù)提供技術(shù)支撐。

1 實驗

1.1 實驗菌株與培養(yǎng)基

實驗菌種奧奈達(dá)希瓦氏菌MR-1購自中國海洋微生物菌種保藏管理中心(Marine culture collection of China,MCCC)，MCCC編號1A01706。

培養(yǎng)基組成如下：NaHCO32.5 g/L，NH4Cl 0.25 g/L，KCl 0.1 g/L，NaCl 0.1 g/L，MgSO4·7H2O 0.05 g /L，MgCl2·6H2O 0.2 g/L，KH2PO40.04 g/L，Yeast Extract 1 g/L。還原實驗中添加適量的乳酸鈉作為電子供體。

1.2 主要試劑和儀器

主要試劑：基準(zhǔn)八氧化三鈾U3O8(分析純)，標(biāo)準(zhǔn)鈾溶液采用GBW04201方法配制；蒽醌-2-磺酸鈉(AQS)，分析純，Sigma公司生產(chǎn)；鐵粉(ZVI)，分析純，天津志遠(yuǎn)化學(xué)試劑公司生產(chǎn)；其他試劑均為分析純，實驗用水為超純水。

核酸蛋白測定儀(德國Eppendorf)，生化培養(yǎng)箱(山東省醫(yī)療器械有限公司LRH-250-Ⅱ)，光電子能譜儀(XPS)(美國Thermo ESCALAB 250Xi)。

1.3 實驗方法

厭氧培養(yǎng)裝置如圖1所示。將滅菌后的培養(yǎng)基、10 mmol/L乳酸鈉、20.0 mg/L U(Ⅵ)和1 mmol/L AQS組成的微生物培養(yǎng)液加入150 mL錐形瓶中，用NaOH和HCl調(diào)節(jié)pH值至7.0，并定容至100 mL。用丁基橡膠塞密封瓶口，在裝有培養(yǎng)液的實驗瓶中充入經(jīng)過細(xì)菌過濾器(0.2 μm)的高純N2和二氧化碳的混合氣，充氣時間≥15 min，并在氣體的保護(hù)下，將定量對數(shù)期菌懸液(細(xì)菌懸浮液在600 nm波長處的吸光值(D600)約為0.80)接種于培養(yǎng)液中，同時加入1 g/L ZVI，密封所有橡膠管。將實驗瓶置于30 ℃、120 r/min的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)。定時取樣分析，每次取樣后重新通入氣體,以保持瓶內(nèi)厭氧環(huán)境。所取樣液經(jīng)8000 r/min離心10 min，所得上清液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，留待分析。

實驗主要考察U(Ⅵ)初始濃度(5、10、20、30、50 g/L)、ZVI添加量(0、0.2、0.5、1、2 g/L)、鐵形態(tài)(FeCl3、ZVI、Fe3O4、Fe2O3)、pH值(2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0)以及其他主要共存離子(Cu2+、Mn2+、Ca2+、NO3-、SO42-)等對U(Ⅵ)還原效果的影響。所有實驗組均設(shè)置3個平行實驗，且取其數(shù)據(jù)的平均值作為實驗結(jié)果。 每組實驗不同條件值均使用同一批微生物同時進(jìn)行實驗，以確保實驗比較的可靠性。

圖1 厭氧培養(yǎng)裝置 Fig.1 Anaerobic culture device

1.4 分析測試方法

U(Ⅵ)的測定：采用國家標(biāo)準(zhǔn)GB 6768—86分光光度法測定微量鈾。

U(Ⅵ)的去除率E=(c0-c1)/c0×100%(式中：c0、c1分別為反應(yīng)前后溶液中U(Ⅵ)的濃度)。

對反應(yīng)后的鐵粉進(jìn)行X射線光電子能譜(XPS)分析，以單色Al Kα(hv =1486.6 eV，功率150 W，500 μm束斑)作為放射源，結(jié)合能以C1s 284.8校準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同體系還原U( )Ⅵ的效果對比

土壤、水體沉積物等厭氧環(huán)境中普遍存在著的腐殖質(zhì)能有效促進(jìn)希瓦氏菌屬對U(Ⅵ)的還原[18]。因此，實驗中以腐殖質(zhì)模式物AQS作為腐殖質(zhì)的替代物，設(shè)置5種體系進(jìn)行對照實驗。即單獨投加ZVI、單獨投加菌體、菌體+AQS、ZVI+菌體、ZVI+菌體+AQS。在AQS投加量為1 mmol/L、ZVI投加量為1 g/L、pH為7的條件下各實驗組對U(Ⅵ)的還原率如圖2所示。從圖2可看出，ZVI、菌體及它們的組合均可去除溶液中的U(Ⅵ)，在菌體還原U(Ⅵ)的過程中，24 h內(nèi)，同時投加菌體和ZVI的實驗組其U(Ⅵ)還原率為61.67%，比單獨投加菌體的實驗組的U(Ⅵ)還原率提高了近8倍，比單獨投加ZVI的實驗組的U(Ⅵ)還原率提高了近6倍。且ZVI+菌體實驗組24 h內(nèi)，其U(Ⅵ)的去除率明顯高于單獨添加ZVI或菌體實驗組的U(Ⅵ)去除率的疊加。表明厭氧條件下，ZVI和S. oneidensis還原U(Ⅵ) 存在協(xié)同作用。

單獨投加ZVI的實驗組在6 h內(nèi)U(Ⅵ)去除率達(dá)到10.3%后，基本趨于穩(wěn)定，48 h后，仍只有12.3%。原因在于ZVI對U(Ⅵ)的去除是發(fā)生在ZVI表面的氧化還原反應(yīng)，其動力主要來源于Fe(Ⅲ)/ Fe(Ⅱ)[19]，ZVI表層與水相反應(yīng)被氧化成 Fe(Ⅱ)(Fe0+2H2O=Fe2++2OH-+H2)，水相中U(Ⅵ)與ZVI表面接觸時，與Fe(Ⅱ)發(fā)生反應(yīng)并被快速還原為U(Ⅳ)，沉積于ZVI表面的U(Ⅳ)阻礙了U(Ⅵ)的進(jìn)一步還原。在中性或堿性條件下，這種鈍化作用更明顯。因此，添加ZVI的實驗組在反應(yīng)初始階段能得到比較穩(wěn)定的U(Ⅵ)去除率，而后期U(Ⅵ)去除率不再繼續(xù)增加。

與ZVI+菌體、菌體+AQS實驗組相比，同時添加ZVI、菌體和AQS的實驗組對U(Ⅵ)的去除最為迅速，24 h內(nèi)，其U(Ⅵ)去除率達(dá)到 96.9%，比ZVI+菌體實驗組的U(Ⅵ)去除率提高35.2%，比菌體+AQS實驗組的U(Ⅵ)去除率增加了86.3%。由此可見，AQS存在條件下，ZVI能更加快速地促進(jìn)S. oneidensis對U(Ⅵ)的還原，后續(xù)實驗中均添加1 mmol/L AQS。

本實驗室前期開展的S. oneidensis對U(Ⅵ)的耐受性實驗表明，U(Ⅵ)初始濃度為50mg/L時，菌體的生長受到明顯抑制，U(Ⅵ)初始濃度為80 mg/L時，菌體的結(jié)構(gòu)受到破壞甚至死亡。因此，實驗中U(Ⅵ)初始濃度范圍設(shè)置為5～50 mg/L，圖3顯示U(Ⅵ)初始濃度對其還原的影響。由圖3可看出，U(Ⅵ)的還原率與其初始濃度呈正相關(guān)。當(dāng)U(Ⅵ)的初始濃度為5 mg/L時，其還原率在18 h和48 h內(nèi)，U(Ⅵ)的還原率分別為44.32%和71.81%；當(dāng)U(Ⅵ)的初始濃度為10 mg/L時，

圖2 不同體系對U(Ⅵ)還原率的影響 Fig.2 Reduction effects of different systems on U(Ⅵ) reduction rate

2.2 U( )Ⅵ初始濃度對其還原性能的影響

圖3 U(VI)初始濃度對U(Ⅵ)還原率的影響 Fig.3 Effect of initial concentration of U(Ⅵ) on U(Ⅵ) reduction rate

在18 h和48 h內(nèi)，U(Ⅵ)的還原率分別為73.85%和86.75%；當(dāng)U(Ⅵ)的初始濃度增為20 mg/L時，U(Ⅵ)的還原率在18 h和48 h內(nèi)分別為85.86%和94.64%。當(dāng)U(Ⅵ)的初始濃度為5～20 mg/L，U(Ⅵ)的還原率隨其初始濃度的增加而明顯增加。繼續(xù)增加U(Ⅵ)的初始濃度至50 mg/L時，其還原率增加不明顯。

實驗證實，在20 mg/L U(Ⅵ)初始濃度條件下，ZVI+菌體+AQS還原體系對U(Ⅵ)的還原率已較理想，當(dāng)U(Ⅵ)初始濃度增至50 mg/L時，體系仍然對U(Ⅵ)有較強(qiáng)的適應(yīng)能力。這可能是由于添加的ZVI和AQS均能快速還原部分U(Ⅵ)，減緩其對菌體的毒性。另外，培養(yǎng)基中微量的H2PO4-能與U(Ⅵ)結(jié)合，也可部分緩解U(Ⅵ)對菌體的毒性?？紤]到鈾污染水體中鈾含量的實際情況，本實驗中U(Ⅵ)初始濃度均采用 20 mg/L。

2.3 ZVI的投加量對U( )Ⅵ還原的影響

ZVI投加量對U(Ⅵ) 還原過程的影響如圖4所示。圖4表明，不同的ZVI添加量對S. oneidensis還原U(Ⅵ)產(chǎn)生不同程度的促進(jìn)作用。當(dāng)ZVI添加量從0.2 g/L增加至1 g/L時,12 h內(nèi)，U(Ⅵ)的還原率從67.45%升至70.34%；24 h內(nèi)，U(Ⅵ)的還原率從88.88%升至95.02%。當(dāng)ZVI投加量為0.2～1 g/L時，U(Ⅵ)的還原率隨ZVI添加量的增加而明顯增加。當(dāng)ZVI增至2 g/L時，U(Ⅵ)的還原率升高不明顯。這與ZVI與厭氧微生物協(xié)同還原地下水中硝基苯時獲得結(jié)果一致[20]。這可能是由于溶液中ZVI添加量不足時，ZVI的增加可提供更多的活性點位和更多的H2電子供體，從而提高了U(Ⅵ)的還原率。另外，U(Ⅵ)的還原反應(yīng)在ZVI的表面進(jìn)行，ZVI添加量的增加直接增加了其 表面積，有利于U(Ⅵ)的還原。但當(dāng)ZVI增加到一定程度，其產(chǎn)H2速度超過微生物利用速度時，ZVI添加量的增加對U(Ⅵ)的還原促進(jìn)作用減小。因此，本研究中ZVI的添加量取1 g/L。

圖4 ZVI投加量對U(Ⅵ)還原率的影響 Fig.4 Effect of ZVI addition on U(Ⅵ) reduction rate

2.4 鐵形態(tài)對U( )Ⅵ還原的影響

不同形態(tài)的鐵對U(Ⅵ)還原能力的影響如圖5所示。結(jié)果顯示，鐵的形態(tài)對U(Ⅵ)的還原有顯著的影響。在ZVI添加量為1 g/L，F(xiàn)e3O4、Fe2O3和FeCl3添加量均為20 mmol/L的條件下，ZVI、Fe3O4和Fe2O3實驗組12 h內(nèi)U(Ⅵ)的還原率分別為70.35%、71.61%和79.09%；24 h內(nèi)U(Ⅵ)的還原率均達(dá)到95%以上，比空白組(未添加任何形態(tài)鐵)的U(Ⅵ)還原率提高近85%，說明難溶態(tài)的鐵(ZVI、Fe3O4和Fe2O3)均能明顯促進(jìn)U(Ⅵ)的還原。對添加FeCL3的實驗組，48 h內(nèi)，僅去除了10%左右的U(Ⅵ)，比空白組的U(Ⅵ)還原率降低了近50%，表明可溶態(tài)的Fe(Ⅲ)對U(Ⅵ) 的還原具有明顯抑制作用。這與何云曉等[21]研究的Cu2+、Fe3+對微生物生長及去除溶液中Cr(Ⅵ)的影響實驗獲得的結(jié)果一致。

可溶性的Fe(Ⅲ)對U(Ⅵ)的還原表現(xiàn)為強(qiáng)烈的抑制作用，這可能是由于可溶性的Fe(Ⅲ)通過細(xì)胞膜上的通道進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與細(xì)胞蛋白質(zhì)結(jié)合使之變性，或者是Fe(Ⅲ)進(jìn)入細(xì)胞后與酶上的—SH基結(jié)合而使其失去活性，也可能是Fe(Ⅲ)與代謝中間產(chǎn)物結(jié)合而使代謝受阻。而難溶態(tài)的Fe(Ⅲ) 對U(Ⅵ)的還原表現(xiàn)為促進(jìn)作用，這可能是由于S. oneidensis對U(Ⅵ)的還原反應(yīng)發(fā)生在菌體表面，F(xiàn)e3O4和Fe2O3在細(xì)胞膜上僅具有低滲透性，F(xiàn)e(Ⅲ)氧化物通過菌體的厭氧代謝被還原，產(chǎn)生的Fe(Ⅱ)進(jìn)一步將電子傳遞到U(Ⅵ)，促進(jìn)其還原[22]。

圖5 鐵形態(tài)對U(Ⅵ)還原率的影響 Fig.5 Effect of iron species on U(Ⅵ) reduction rate

2.5 pH對U( )Ⅵ還原的影響

pH不僅影響微生物的生長，也影響ZVI對U(Ⅵ)的還原效果。研究表明，ZVI還原去除水體中的U(Ⅵ) 在酸性條件下效果更好； S. oneidensis屬耐酸耐鈾菌，在極端環(huán)境條件下(pH＞2)仍能存活，但其生長受到較大程度的抑制，其最適pH值為7.0。反應(yīng)初始pH值對ZVI-微生物協(xié)同去除U(Ⅵ)效果的影響如圖6所示。由圖6可知，在初始pH為2～6條件下，12 h內(nèi)，各實驗組的U(Ⅵ)還原率可達(dá)到95%以上；而pH為7的實驗組，12 h內(nèi)僅能還原52%左右的U(Ⅵ)，達(dá)到95%以上的U(Ⅵ)還原率需要24 h。由此可見，酸性條件下，U(Ⅵ)的還原去除較中性環(huán)境下的更迅速?？赡苡梢韵略蛩拢核嵝詶l件下，ZVI的腐蝕速率遠(yuǎn)大于中性及堿性條件，厭氧微生物可快速獲得充足的電子供體，而且ZVI腐蝕產(chǎn)生的FeOOH沉淀也不會覆蓋其表面產(chǎn)生鈍化，顯著提高ZVI對U(Ⅵ)的還原去除效果。因此，酸性環(huán)境下，菌株的生長雖受到較大程度的抑制，然而U(Ⅵ)的還原去除率反而增加。ZVI+菌體+AQS體系在中性條件也可取得良好效果，考慮到鈾污染地下水環(huán)境的實際情況，本文作者其他研究中的初始pH取7。

圖6 初始pH對U(Ⅵ)還原率的影響 Fig.6 Effect of initial pH on U(Ⅵ) reduction rate

2.6 共存離子對U( )Ⅵ的還原影響

鈾污染水體中其他離子的存在會對U(Ⅵ)的還原產(chǎn)生影響，保持其他條件不變，在微生物培養(yǎng)液中分別加入50 mg/L 的Cu2+、Mn2+、Ca2+和1 mol/L的SO42-和NO3-離子，考察其對U(Ⅵ)還原能力的影響，圖7所示為外加離子對U(Ⅵ)還原的影響。從圖7可看出，添加了金屬離子Cu2+、Ca2+、Mn2+的實驗組，12 h內(nèi)，U(Ⅵ)的還原率分別為3.58%、14.15%、60.76%，無外加離子的對照組的U(Ⅵ)還原率達(dá)到了75.16%，這說明Cu2+、Ca2+、Mn2+對U(Ⅵ)的還原均有不同程度的抑制作用，其中Cu2+的影響最為顯著，Ca2+的次之，Mn2+的最小。Cu2+的抑制作用可能是由于S. oneidensis的細(xì)胞膜上具有還原酶活性的蛋白質(zhì),外加的Cu2+與呼吸鏈?zhǔn)级嗣摎涿傅鞍椎幕钚灾行南嘟Y(jié)合，破壞了蛋白的活性中心，從而使該蛋白失去氧化電子供體的能力[23]，對U(Ⅵ)的還原產(chǎn)生了不利影響。研究表明[24]：ZVI可還原Cu2+，從而削弱了ZVI對U(Ⅵ)還原的促進(jìn)作用。Ca2+的抑制作用可能是其與U(Ⅵ)生成性質(zhì)穩(wěn)定的鈣鈾碳酸鹽絡(luò)合物，U(Ⅵ)作為電子受體時，其活性健不易重新釋放，降低了U(Ⅵ)的還原活性，從而影響U(Ⅵ)的生物還原。

與對照組相比，第12 h時，添加了NO3-的實驗組U(Ⅵ)的還原率降低了近58%，添加了SO42-的實驗組僅降低了約4%。說明SO42-對U(Ⅵ)的還原影響較小，而NO3-對U(Ⅵ)的還原具有明顯抑制。NO3-的抑制作用是由于NO3-中氧化態(tài)的N5+在厭氧反應(yīng)體系中具有較強(qiáng)氧化性，與U(Ⅵ)存在自由電子競爭，以致對U(Ⅵ)的還原產(chǎn)生了抑制。

圖7 共存離子對U(Ⅵ)還原率的影響 Fig.7 Effect of coexisting ions on U(Ⅵ) reduction rate

3 U( )Ⅵ還原產(chǎn)物形態(tài)分析

為了進(jìn)一步驗證U(Ⅵ)還原產(chǎn)物在ZVI表面的沉積，對ZVI表面鈾的形態(tài)特征進(jìn)行XPS分析，結(jié)果如圖8所示。

從圖8可知，U4f7/2軌道和U4f5/2軌道分別在結(jié)合能為380～382和392～393 eV處有明顯的出峰。根據(jù)XPS手冊分析可知，U4f7/2軌道處的出峰由UO2(U(Ⅳ)在(380.3±0.4) eV處的峰和UO3(U(Ⅵ)在(381.6±0.3) eV處的峰疊加而成，其含量比約為9：4；U4f5/2軌道處的出峰由U3O8在392 eV處的峰和UO3(U(Ⅵ))在(392.65±0.15) eV處的峰疊加而成，其含量比約為6：1。由此可見，菌體表面吸附和沉積了U(Ⅵ)和U(Ⅳ)兩種價態(tài)的U元素，U(Ⅵ)處理后，大部分形成了穩(wěn)定UO2，同時也還殘留部分UO3(U(Ⅵ))，該部分可能是菌體吸附所致。

圖8 ZVI表面XPS譜 Fig.8 XPS spectra of ZVI surface

4 結(jié)論

1) 在厭氧環(huán)境下，ZVI與 S. oneidensis還原U(Ⅵ)存在明顯的協(xié)同作用，在ZVI投加量為1 g/L、U(Ⅵ)的初始濃度為20 mg/L條件下，24 h內(nèi)可還原去除96.9%的U(Ⅵ)。ZVI投加量的增加有利于U(VI)的去除，U(VI)的還原率與其初始濃度正相關(guān)。

2) ZVI、Fe3O4和Fe2O3對菌體還原U(Ⅵ)的促進(jìn)作用顯著，而Fe3+對U(Ⅵ)的還原有明顯的抑制作用。

3) Cu2+、Mn2+、Ca2+、NO3-等離子對U(Ⅵ)的還原均有一定程度的抑制作用，SO42-對U(Ⅵ)的還原影響不明顯。

4) 菌體表面吸附和沉積了U(Ⅵ)和U(Ⅳ)兩種價態(tài)的鈾元素，反應(yīng)后的鈾大部分形成穩(wěn)定的UO2。

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